Proteome Sampling by the HLA Class I Antigen Processing Pathway

The peptide repertoire that is presented by the set of HLA class I molecules of an individual is formed by the different players of the antigen processing pathway and the stringent binding environment of the HLA class I molecules. Peptide elution studies have shown that only a subset of the human proteome is sampled by the antigen processing machinery and represented on the cell surface. In our study, we quantified the role of each factor relevant in shaping the HLA class I peptide repertoire by combining peptide elution data, in silico predictions of antigen processing and presentation, and data on gene expression and protein abundance. Our results indicate that gene expression level, protein abundance, and rate of potential binding peptides per protein have a clear impact on sampling probability. Furthermore, once a protein is available for the antigen processing machinery in sufficient amounts, C-terminal processing efficiency and binding affinity to the HLA class I molecule determine the identity of the presented peptides. Having studied the impact of each of these factors separately, we subsequently combined all factors in a logistic regression model in order to quantify their relative impact. This model demonstrated the superiority of protein abundance over gene expression level in predicting sampling probability. Being able to discriminate between sampled and non-sampled proteins to a significant degree, our approach can potentially be used to predict the sampling probability of self proteins and of pathogen-derived proteins, which is of importance for the identification of autoimmune antigens and vaccination targets

Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation.

HLA class I molecules reflect the health state of cells to cytotoxic T cells by presenting a repertoire of endogenously derived peptides. However, the extent to which the proteome shapes the peptidome is still largely unknown. Here we present a high-throughput mass-spectrometry-based workflow that allows stringent and accurate identification of thousands of such peptides and direct determination of binding motifs. Applying the workflow to seven cancer cell lines and primary cells, yielded more than 22,000 unique HLA peptides across different allelic binding specificities. By computing a score representing the HLA-I sampling density, we show a strong link between protein abundance and HLA-presentation (p < 0.0001). When analyzing overpresented proteins - those with at least fivefold higher density score than expected for their abundance - we noticed that they are degraded almost 3 h faster than similar but nonpresented proteins (top 20% abundance class; median half-life 20.8h versus 23.6h, p < 0.0001). This validates protein degradation as an important factor for HLA presentation. Ribosomal, mitochondrial respiratory chain, and nucleosomal proteins are particularly well presented. Taking a set of proteins associated with cancer, we compared the predicted immunogenicity of previously validated T-cell epitopes with other peptides from these proteins in our data set. The validated epitopes indeed tend to have higher immunogenic scores than the other detected HLA peptides. Remarkably, we identified five mutated peptides from a human colon cancer cell line, which have very recently been predicted to be HLA-I binders. Altogether, we demonstrate the usefulness of combining MS-analysis with immunogenesis prediction for identifying, ranking, and selecting peptides for therapeutic use

Determination of a predictive cleavage motif for eluted major histocompatibility complex class II ligands

CD4+ T cells have a major role in regulating immune responses. They are activated by recognition of peptides mostly generated from exogenous antigens through the major histocompatibility complex (MHC) class II pathway. Identification of epitopes is important and computational prediction of epitopes is used widely to save time and resources. Although there are algorithms to predict binding affinity of peptides to MHC II molecules, no accurate methods exist to predict which ligands are generated as a result of natural antigen processing. We utilized a dataset of around 14,000 naturally processed ligands identified by mass spectrometry of peptides eluted from MHC class II expressing cells to investigate the existence of sequence signatures potentially related to the cleavage mechanisms that liberate the presented peptides from their source antigens. This analysis revealed preferred amino acids surrounding both N- and C-terminuses of ligands, indicating sequence-specific cleavage preferences. We used these cleavage motifs to develop a method for predicting naturally processed MHC II ligands, and validated that it had predictive power to identify ligands from independent studies. We further confirmed that prediction of ligands based on cleavage motifs could be combined with predictions of MHC binding, and that the combined prediction had superior performance. However, when attempting to predict CD4+ T cell epitopes, either alone or in combination with MHC binding predictions, predictions based on the cleavage motifs did not show predictive power. Given that peptides identified as epitopes based on CD4+ T cell reactivity typically do not have well-defined termini, it is possible that motifs are present but outside of the mapped epitope. Our attempts to take that into account computationally did not show any sign of an increased presence of cleavage motifs around well-characterized CD4+ T cell epitopes. While it is possible that our attempts to translate the cleavage motifs in MHC II ligand elution data into T cell epitope predictions were suboptimal, other possible explanations are that the cleavage signal is too diluted to be detected, or that elution data are enriched for ligands generated through an antigen processing and presentation pathway that is less frequently utilized for T cell epitopes.Fil: Paul, Sinu. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados UnidosFil: Karosiene, Edita. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados UnidosFil: Dhanda, Sandeep Kumar. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados UnidosFil: Jurtz, Vanessa. Technical University of Denmark; DinamarcaFil: Edwards, Lindy. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados UnidosFil: Nielsen, Morten. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentina. Technical University of Denmark; DinamarcaFil: Sette, Alessandro. University of California at San Diego; Estados Unidos. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados UnidosFil: Peters, Bjoern. La Jolla Institute for Allergy and Immunology; Estados Unidos. University of California at San Diego; Estados Unido

'Hotspots' of Antigen Presentation Revealed by Human Leukocyte Antigen Ligandomics for Neoantigen Prioritization.

The remarkable clinical efficacy of the immune checkpoint blockade therapies has motivated researchers to discover immunogenic epitopes and exploit them for personalized vaccines. Human leukocyte antigen (HLA)-binding peptides derived from processing and presentation of mutated proteins are one of the leading targets for T-cell recognition of cancer cells. Currently, most studies attempt to identify neoantigens based on predicted affinity to HLA molecules, but the performance of such prediction algorithms is rather poor for rare HLA class I alleles and for HLA class II. Direct identification of neoantigens by mass spectrometry (MS) is becoming feasible; however, it is not yet applicable to most patients and lacks sensitivity. In an attempt to capitalize on existing immunopeptidomics data and extract information that could complement HLA-binding prediction, we first compiled a large HLA class I and class II immunopeptidomics database across dozens of cell types and HLA allotypes and detected hotspots that are subsequences of proteins frequently presented. About 3% of the peptidome was detected in both class I and class II. Based on the gene ontology of their source proteins and the peptide's length, we propose that their processing may partake by the cellular class II presentation machinery. Our database captures the global nature of the in vivo peptidome averaged over many HLA alleles, and therefore, reflects the propensity of peptides to be presented on HLA complexes, which is complementary to the existing neoantigen prediction features such as binding affinity and stability or RNA abundance. We further introduce two immunopeptidomics MS-based features to guide prioritization of neoantigens: the number of peptides matching a protein in our database and the overlap of the predicted wild-type peptide with other peptides in our database. We show as a proof of concept that our immunopeptidomics MS-based features improved neoantigen prioritization by up to 50%. Overall, our work shows that, in addition to providing huge training data to improve the HLA binding prediction, immunopeptidomics also captures other aspects of the natural in vivo presentation that significantly improve prediction of clinically relevant neoantigens

An Integrated Immunopeptidomics and Proteogenomics Framework to Discover Non-Canonical Targets for Cancer Immunotherapy

Un élément essentiel de l’immunothérapie appliquée au cancer est l’identification de peptides liant les antigènes des leucocytes humains (HLA) et capables d’induire une puissante réponse T anti-tumorale. La spectrométrie de masse (MS) constitue actuellement la seule méthode non-biaisée permettant une analyse détaillée du panel d’antigènes susceptibles d’être présentés aux lymphocytes T in vivo. L’utilisation de cette méthode en clinique requiert toutefois des améliorations significatives de la méthodologie utilisée lors de l’identification des peptides HLA. Un consortium multidisciplinaire de chercheurs a récemment mis en lumière les problèmes actuellement liés à l’utilisation de la MS en immunopeptidomique, soulignant le besoin de développer de nouvelles méthodes et mettant en évidence le défi que représente la standardisation de l’immuno-purification des molécules HLA. La première partie de cette thèse vise à optimiser les méthodes expérimentales permettant l’extraction des peptides apprêtés aux HLA. L’optimisation de la méthodologie de base a permis des améliorations notables en terme de débit, de reproductibilité, de sensibilité et a permis une purification séquentielle des molécules de HLA de classe I de classe II ainsi que de leurs peptides, à partir de lignées cellulaires ou de tissus. En comparaison avec les méthodes existantes, ce protocole comprend moins d’étapes et permet de limiter la manipulation des échantillons ainsi que le temps de purification. Cette méthode, pour les peptides HLA extraits, a permis d’obtenir des taux de reproductibilité et de sensibilité sans précédents (corrélations de Pearson jusqu'à 0,98 et 0,97 pour les HLA de classe I et de classe II, respectivement). De plus, la faisabilité d’études comparatives robustes a été démontrée à partir d’une lignée cellulaire de cancer de l’ovaire, traitée à l'interféron gamma. En effet, cette nouvelle méthode a mis en évidence des changements quantitatifs et qualitatifs du catalogue de peptides présentés aux HLA. Les résultats obtenus ont mis en avant une augmentation de la présentation de longs ligands chymotryptiques de classe I. Ce phénomène est probablement lié à la modulation de la machinerie de traitement et de présentation des antigènes. Dans cette première partie de thèse, nous avons développé une méthodologie robuste et rationalisée, facilitant la purification des HLA et pouvant être appliquée en recherche fondamentale et translationnelle. Bien que les néoantigènes représentent une cible attractive, des études récentes ont mis en évidence l’existence des antigènes non canoniques. Ces antigènes tumoraux, bien que non mutés, sont aussi spécifiques aux cellules cancéreuses et semblent jouer un rôle important dans l’immunité anti-tumorale. La seconde partie de cette thèse a pour objectif le développement d’une méthodologie d’analyse permettant l’identification ainsi que la validation de ces antigènes particuliers. Les antigènes non canoniques sont d'origine présumée non codante et ne sont, par conséquent, que rarement inclus dans les bases de données des séquences de protéines de référence. De ce fait, ils ne sont généralement pas pris en compte lors des recherches de MS utilisant de telles bases de données. Afin de palier ce problème et de permettre leur identification par MS, le séquençage de l'exome entier, le séquençage de l'ARN sur une population de cellules et sur des cellules uniques, ainsi que le profilage des ribosomes ont été intégrés aux données d’immunopeptidomique. Ainsi, NewAnce, un programme informatique permettant de combiner les données de deux outils de recherche MS en tandem, a été développé afin de calculer le taux d’antigènes non canoniques identifiés comme faux positifs. L’utilisation de NewAnce sur des lignées cellulaires provenant de patients atteints de mélanomes ainsi que sur des biopsies de cancer du poumon a permis l’identification précise de centaines de peptides HLA non classiques, spécifiques aux cellules tumorales et communs à plusieurs patients. Le niveau de confirmation des peptides non canoniques a ensuite été testé à l’aide d’une approche de MS ciblée. Les peptides résultant de ces analyses ont été minutieusement validés pour un des échantillons de mélanome disponibles. De plus, le profilage des ribosomes a révélé que les nouveaux cadres de lecture ouverts, desquels résultent certains de ces peptides non classiques, sont activement traduits. L’évaluation de l’immunogenicité de ces peptides a été évaluée avec des cellules immunitaires autologues et a révélé un épitope immunogène non canonique, provenant d'un cadre de lecture ouvert alternatif du gène ABCB5, un marqueur des cellules souches du mélanome. De manière globale, les résultats obtenus au cours de cette thèse soulignent la possibilité d’inclure ce type d’analyse de proteogénomique dans un protocole d’identification de néoantigènes existant. Cela permettrait d’inclure et prioriser des antigènes tumoraux non classiques et de proposer aux patients en impasse thérapeutique des immunothérapies anti-tumorales personnalisées. -- A central factor to the development of cancer immunotherapy is the identification of clinically relevant human leukocyte antigen (HLA)-bound peptides that elicit potent anti-tumor T cell responses. Mass spectrometry (MS) is the only unbiased technique that captures the in vivo presented HLA repertoire. However, significant improvements in MS-based HLA peptide discovery methodologies are necessary to enable the smooth transition to the clinic. Recently, a consortium of multidisciplinary researchers presented current issues in clinical MS-based immunopeptidomics, highlighting method development and standardization challenges in HLA immunoaffinity purification. The first part of this thesis addresses improvements to the experimental method for HLA peptide extraction. The approach was optimized with several new developments, facilitating high-throughput, reproducible, scalable, and sensitive sequential immunoaffinity purification of HLA class I and class II peptides from cell lines and tissue samples. The method showed increased speed, and reduced sample handling when compared to previous methods. Unprecedented depth and high reproducibility were achieved for the obtained HLA peptides (Pearson correlations up to 0.98 and 0.97 for HLA class I and HLA class II, respectively). Additionally, the feasibility of performing robust comparative studies was demonstrated on an ovarian cancer cell line treated with interferon gamma. Both quantitative and qualitative changes were detected in the cancer HLA repertoire upon treatment. Specifically, a yet unreported and interesting phenomenon was the upregulated presentation of longer and chymotryptic-like HLA class I ligands, likely related to the modulation of the antigen processing and presentation machinery. Taken together, a robust and streamlined framework was built that facilitates peptide purification and its application in basic and translational research. Furthermore, recent studies have shed light that, along with the highly attractive mutated neoantigens, other non-mutated, yet tumor-specific, non-canonical antigens may also play an important role in anti-tumor immunity. Non-canonical antigens are of presumed non-coding origin and not commonly included in protein reference databases, and are therefore typically disregarded in database-dependent MS searches. The second part of this thesis develops an analytical workflow enabling the confident identification and validation of non- canonical tumor antigens. For this purpose, whole exome sequencing, bulk and single-cell RNA sequencing and ribosome profiling were integrated with MS-based immunopeptidomics for personalized non-canonical HLA peptide discovery. A computational module called NewAnce was designed, which combines the results of two tandem MS search tools and implements group-specific false discovery rate calculations to control the error specifically for the non-canonical peptide group. When applied to patient-derived melanoma cell lines and paired lung cancer and normal tissues, NewAnce resulted in the accurate identification of hundreds of shared and tumor-specific non-canonical HLA peptides. Next, the level of non-canonical peptide confirmation was tested in a targeted MS-based approach, and selected non-canonical peptides were extensively validated for one melanoma sample. Furthermore, the novel open reading frames that generate a selection of these non- canonical peptides were found to be actively translated by ribosome profiling. Importantly, these peptides were assessed with autologous immune cells and a non-canonical immunogenic epitope was discovered from an alternative open reading frame of melanoma stem cell marker gene ABCB5. This thesis concludes by highlighting the possibility of incorporating the proteogenomics pipeline into existing neoantigen discovery engines in order to prioritize tumor-specific non-canonical peptides for cancer immunotherapy. -- Maladie très hétérogène et multifactorielle, le cancer représente à ce jour la seconde cause de décès dans le monde. Bien que le système immunitaire soit capable de reconnaître puis d’éliminer les cellules cancéreuses, ces dernières peuvent à leur tour s’adapter et accumuler des mutations leur permettant d’échapper à cette reconnaissance. L’immunothérapie anti-tumorale démontre le rôle clé de l’immunité dans l’éradication des tumeurs. Cependant, ces thérapies prometteuses ne sont efficaces que chez une petite proportion des patients traités. Une étape majeure dans l’établissement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est la reconnaissance d’antigènes associés aux tumeurs. Des études récentes ont montré que les antigènes tumoraux issus de régions non-codantes du génome (antigènes non-canoniques) peuvent jouer un rôle clé dans l’induction de réponses immunitaires. Ainsi, l’identification de ces antigènes tumoraux particuliers permettrait de guider le développement d’immunothérapies anti-cancéreuses personnalisées telles que la vaccination ou encore le transfert adoptif de lymphocytes T reconnaissant ces cibles. La spectrométrie de masse (MS) est une technique non biaisée permettant l’identification et l’analyse du répertoire des antigènes présentés in vivo. Cependant, cette technique nécessite d’être optimisée et standardisée afin d’être utilisée en clinique. Ainsi, la première partie de ces travaux de thèse a été dédiée à l’optimisation expérimentale de cette méthode à partir d’échantillons de tissus et de lignées cellulaires. En comparaison avec les protocoles standards, cette technique permet une couverture plus complète, rapide et reproductible du répertoire de peptides apprêtés aux HLA. La seconde partie de cette thèse a été consacrée au développement d’une méthode permettant l’identification d’antigènes tumoraux non-canoniques via le séquençage d’ARN cellulaire, ribosomique et l’utilisation de notre méthode d’immunopeptidomique optimisée. Afin de contrôler l’identification de faux positifs, nous avons élaboré un nouveau module computationnel. Ce module a permis l’identification de plusieurs centaines de peptides-HLA non-canoniques, partagés et spécifiques au mélanome et au cancer du poumon. Le séquençage des ARN ribosomiques a mis en évidence la traduction de nouveaux cadre ouverts de lecture desquels sont traduits de nouveaux peptides non-canoniques. Cette technique nous a permis de mettre en évidence un épitope immunogène issu du gène ABCB5, un marqueur de cellules souches cancéreuses préalablement identifié dans le mélanome. De manière globale, ces travaux de thèse, alliant immunopeptidomique et protéogénomique, ont permis la mise au point d’une méthode expérimentale permettant une meilleure identification d’antigènes tumoraux. Nous espérons que ces résultats amélioreront l’identification et la priorisation de cibles pertinentes pour l’immunothérapie anti-cancéreuse en clinique

Computational characterization of the peptidome in transporter associated with antigen processing (TAP)-deficient cells

The transporter associated with antigen processing (TAP) is a key element of the major histocompatibility complex (MHC) class I antigen processing and presentation pathway. Nonfunctional TAP complexes impair the translocation of cytosol-derived proteolytic peptides to the endoplasmic reticulum lumen. This drastic reduction in the available peptide repertoire leads to a significant decrease in MHC class I cell surface expression. Using mass spectrometry, different studies have analyzed the cellular MHC class I ligandome from TAP-deficient cells, but the analysis of the parental proteins, the source of these ligands, still deserves an in-depth analysis. In the present report, several bioinformatics protocols were applied to investigate the nature of parental proteins for the previously identified TAP-independent MHC class I ligands. Antigen processing in TAP-deficient cells mainly focused on small, abundant or highly integral transmembrane proteins of the cellular proteome. This process involved abundant proteins of the central RNA metabolism. In addition, TAP-independent ligands were preferentially cleaved from the N- and C-terminal ends with respect to the central regions of the parental proteins. The abundance of glycine, proline and aromatic residues in the C-terminal sequences from TAP-independently processed proteins allows the accessibility and specificity required for the proteolytic activities that generates the TAP-independent ligandome. This limited proteolytic activity towards a set of preferred proteins in a TAP-negative environment would therefore suffice to promote the survival of TAP-deficient individuals.This work was supported by the Spanish Ministry of Economy (MINECO/FEDER) grant SAF2014-58052 and Acción Estratégica en Salud 2019 to DL. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscriptS

Expanding the immune self : impact of non-canonical translation on the repertoire of MHC I-associated peptides

Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (MHC I) sont des glycoprotéines de surface exprimées par la majorité des cellules nucléés de notre organisme. Ces molécules servent à exposer une vue intégrative de l’état interne de nos cellules (soi immunitaire) via la présentation de courts peptides (MAPs) générés lors de la dégradation des protéines cytosoliques par le protéasome. Le répertoire des MAPs de chaque cellule, véritable carte d’identité peptidique, est constamment passé en revue par nos lymphocytes T CD8+, cellules centrales du système immunitaire, afin de débusquer et d’éliminer toute cellule anormale, e.g., celles présentant des MAPs d’origine virale ou tumorale (TSAs). Au vu du nombre grandissant d’articles démontrant que des ARNs autres que les ARNs messagers peuvent être traduits, nous avons décidé d’évaluer l’impact de ces mécanismes de traduction non-canonique sur le répertoire des MAPs présentés par des cellules B. En développant une approche protéogénomique, i.e., combinant spectrométrie de masse et séquençage d’ARN à haut-débit, nous avons pu démontrer qu’environ 10 % des MAPs présentés par nos cellules B dérivent d’évènements de traduction non-canonique incluant (i) la traduction d’ARNs messagers dans un cadre de lecture alternatif ou (ii) la traduction de régions ou ARNs supposés non-codants. L’analyse subséquente des caractéristiques de ces MAPs dits « cryptiques » suggère que leur biogenèse diffère de celle des MAPs conventionnels, les MAPs cryptiques étant principalement encodés par des ARNs instables produisant de courtes protéines dont la dégradation ne semble pas exiger l’intervention du protéasome. Sachant que la déméthylation globale du génome des cellules cancéreuses permet l’expression d’un plus grand bassin d’ARNs non-codants, nous avons supposé que ces cellules pourraient présenter de nombreux MAPs (et TSAs) cryptiques. En adaptant notre approche protéogénomique, nous avons pu analyser le répertoire des MAPs de cellules cancéreuses, incluant celui de deux lignées tumorales de souris (EL4 et CT26) et sept échantillons primaires humains (quatre leucémies aigues lymphoblastiques B et trois biopsies de cancer du poumon). Cette analyse nous a permis de découvrir qu’environ 90% des TSAs sont des TSAs cryptiques. Ayant observé que la plupart de ces TSAs dérivent de séquences normales dont l’expression est restreinte aux cellules tumorales, comme les retroéléments endogènes, il est plausible que ces TSAs soient partagés par plusieurs patients. Enfin, nos études chez la souris nous ont permis de démontrer qu’au moins deux facteurs influencent positivement le potentiel protectif d’un TSA in vivo : l’expression de cet antigène par les cellules cancéreuses et la fréquence des lymphocytes T capables de le reconnaître. En conclusion, le recours à la protéogénomique pour analyser les MAPs présentés par les cellules normales et cancéreuses nous a permis de démontrer que les MAPs cryptiques contribuent significativement au bassin de peptides constituant le soi immunitaire et qu’ils permettent aux lymphocytes T CD8+ d’effectuer une surveillance immunitaire plus efficace.On their surface, nucleated cells present major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules in complex with short peptides, that we will refer to as MHC I-associated peptides (MAPs). These MAPs derive from the degradation of cytosolic proteins by the proteasome and provide an integrative view of the inner state of cells to CD8+ T cells, which can, in turn, eliminate abnormal cells, e.g., those presenting viral MAPs or tumor-specific antigens (TSAs). With the growing body of evidence suggesting that translation does occur outside of protein-coding transcripts, we tried to evaluate the impact of non-canonical translation on the repertoire of MAPs. Combining RNA-sequencing and mass spectrometry to analyze the MAP repertoire of B-lymphoblastoid cell lines, we uncovered that ~ 10 % of the MAP repertoire derives from such non-canonical translation events, including (i) the out-of-frame translation of protein-coding transcripts or (ii) the translation of non-coding regions (UTRs, introns, etc.) or transcripts (antisense, pseudogene, etc.). Interestingly, our data suggest that the biogenesis of cryptic and conventional MAPs differs, as cryptic MAPs derive from unstable transcripts generating short proteins that might be degraded in a proteasome-independent fashion. Because the global DNA hypomethylation observed in cancer cells tend to de-repress non-coding transcripts, we developed another proteogenomic approach to probe the cryptic MAP repertoire of two murine cancer cell lines (EL4 and CT26) and seven humor primary tumor samples (four B-lineage acute lymphoblastic leukemias and three lung tumor biopsies). This second analysis revealed that ~ 90% of TSAs are cryptic TSAs. Interestingly, most of those TSAs derived from cancer-restricted yet non-mutated sequences, such as endogenous retroelements, thereby suggesting that such TSAs could be shared between patients. Lastly, our validation study in mice demonstrated that at least two parameters can influence the in vivo protective effect of TSAs, namely TSA expression in cancer cells and the frequency of TSA-specific T cells. Altogether, our proteogenomic studies on the MAP repertoire of normal and cancer cells demonstrate that cryptic MAPs significantly expand the immune self and, consequently, the scope of CD8+ T cell immunosurveillance

Deciphering the Landscape of HLA class-I and class-II Phosphopeptidomes leads to Robust Predictions of Phosphorylated HLA ligands

Activation of CD8+ and CD4+ T cells through recognition of antigens presented by class I and class II human leukocyte antigen (HLA-I/HLA-II) molecules is crucial for immune responses against infected or malignant cells. In cancer, neoantigens can arise from cancer-specific genomic or proteomic alterations, including mutations and aberrant post-translational modification, such as phosphorylation. Identifying HLA ligands remains a challenging task that requires either heavy experimental work for in vivo identification or optimized bioinformatics tools for accurate predictions. While much work has been done on unmodified HLA-I and HLA-II ligands, only little is known about the presentation of phosphorylated peptides, in particular by HLA-II molecules. Moreover, none of the existing in silico models for predictions of HLA – ligand interactions are specifically trained on phosphorylated ligands. This thesis presents in-depth analyses of phosphorylated HLA-I and HLA-II ligands and introduces predictors for HLA – phosphorylated ligand interactions. The first part of this thesis comprises the curation of phosphorylated HLA-I ligands from several Mass Spectrometry – based peptidomics studies, identifying more than 2,000 unique phosphorylated peptides covering 72 HLA-I alleles. Furthermore, it was see that phosphorylated HLA-I ligands are shaped by a combination of HLA-I binding motifs, intrinsic HLA-I binding properties of phosphorylated ligands and kinase motifs. Combining phosphorylated HLA-I ligands with unmodified data for training a prediction model resulted in improved predictions of phosphorylated HLA-I ligands. The second part addresses phosphorylated HLA-II ligands presented by professional antigen presenting cells for CD4+ T cell activation. MS – based HLA-II peptidomics data resulted in the identification of binding motifs for more than 30 HLA-II alleles, comprising 2,473 unique phosphorylated ligands. These were used to retrain a predictor for HLA-II - ligand interactions and showed improved accuracy for phosphorylated ligands. The analysis of the phosphorylated HLA-II peptidomes revealed a more diverse repertoire of kinases responsible for the phosphorylation of peptides presented on HLA-II compared to HLA-I. In summary, the current work presents in-depth studies on phosphorylated HLA ligands as well as bioinformatics tools for the predictions of phosphorylated peptide interactions with HLA-I and HLA-II molecules. -- L'activation des cellules T CD8+ et CD4+ suite à la reconnaissance d’antigènes présentés par les antigènes des leucocytes humains de classe I et II (HLA-I/HLA-II) est cruciale pour les réponses immunitaires contre les cellules infectées ou cancéreuses. Dans le cancer, les néoantigènes peuvent provenir d'altérations génomiques ou protéomiques spécifiques au cancer, par exemple des mutations ou des modifications post-traductionnelles aberrantes, telles que la phosphorylation. L'identification des ligands HLA reste une tâche difficile qui nécessite soit un travail expérimental lourd pour l'identification in vivo, soit des outils bio-informatiques optimisés pour des prédictions précises. Si beaucoup de travail a été réalisé sur les ligands HLA-I et HLA-II non modifiés, on ne sait que peu de choses sur la présentation des peptides phosphorylés, en particulier par les molécules HLA-II. De plus, aucun des modèles in silico existants pour la prédiction des interactions HLA - ligands n'est spécifiquement entraîné sur les ligands phosphorylés. Cette thèse présente des analyses détaillées sur les ligands HLA-I et HLA-II phosphorylés et introduit des prédicteurs pour les interactions HLA - ligands phosphorylés. La première partie de cette thèse comprend la curation des ligands HLA-I phosphorylés provenant de plusieurs études peptidiques de spectrométrie de masse, identifiant plus de 2’000 peptides phosphorylés uniques couvrant 72 allèles HLA-I. De plus, il a été constaté que les ligands HLA-I phosphorylés sont obtenus par une combinaison de motifs de liaison aux HLA-I, de propriétés intrinsèques de liaison entre les HLA-I et les ligands phosphorylés et de motifs de kinases. La combinaison de ces ligands HLA-I phosphorylés avec des données de ligands non modifiés pour l’entraînement du prédicteur a permis d'améliorer les prédictions des ligands HLA-I phosphorylés. La deuxième partie de cette thèse porte sur les ligands HLA-II phosphorylés qui sont présentés par des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles pour l'activation des lymphocytes T CD4+. Les données peptidiques de HLA-II basées sur la spectrométrie de masse ont permis d'identifier des motifs de liaison pour plus de 30 allèles HLA-II, comprenant 2’473 ligands phosphorylés uniques. Ces motifs ont été utilisés pour re-entraîner un prédicteur des interactions entre les ligands et HLA-II qui a montré une meilleure précision pour les ligands phosphorylés. En outre, l'analyse du peptidome HLA-II phosphorylé a révélé un répertoire plus diversifié de kinases responsables de la phosphorylation des peptides présentés par les HLA-II par rapport aux HLA-I. En résumé, cette thèse présente des études détaillées sur les ligands HLA phosphorylés ainsi que des outils bio-informatiques pour la prédiction des interactions des peptides phosphorylés avec les molécules HLA-I et HLA-II

Predicting Antigen Presentation-What Could We Learn From a Million Peptides?

Antigen presentation lies at the heart of immune recognition of infected or malignant cells. For this reason, important efforts have been made to predict which peptides are more likely to bind and be presented by the human leukocyte antigen (HLA) complex at the surface of cells. These predictions have become even more important with the advent of next-generation sequencing technologies that enable researchers and clinicians to rapidly determine the sequences of pathogens (and their multiple variants) or identify non-synonymous genetic alterations in cancer cells. Here, we review recent advances in predicting HLA binding and antigen presentation in human cells. We argue that the very large amount of high-quality mass spectrometry data of eluted (mainly self) HLA ligands generated in the last few years provides unprecedented opportunities to improve our ability to predict antigen presentation and learn new properties of HLA molecules, as demonstrated in many recent studies of naturally presented HLA-I ligands. Although major challenges still lie on the road toward the ultimate goal of predicting immunogenicity, these experimental and computational developments will facilitate screening of putative epitopes, which may eventually help decipher the rules governing T cell recognition

Molecular Characterization of the Onset and Progression of Colitis in Inoculated Interleukin-10 Gene-Deficient Mice: A Role for PPARα

The interleukin-10 gene-deficient (Il10−/−) mouse is a model of human inflammatory bowel disease and Ppara has been identified as one of the key genes involved in regulation of colitis in the bacterially inoculated Il10−/− model. The aims were to (1) characterize colitis onset and progression using a histopathological, transcriptomic, and proteomic approach and (2) investigate links between PPARα and IL10 using gene network analysis. Bacterial inoculation resulted in severe colitis in Il10−/− mice from 10 to 12 weeks of age. Innate and adaptive immune responses showed differences in gene expression relating to colitis severity. Actin cytoskeleton dynamics, innate immunity, and apoptosis-linked gene and protein expression data suggested a delayed remodeling process in 12-week-old Il10−/− mice. Gene expression changes in 12-week-old Il10−/− mice were related to PPARα signaling likely to control colitis, but how PPARα activation might regulate intestinal IL10 production remains to be determined