Blood Vessel Tortuosity Selects against Evolution of Agressive Tumor Cells in Confined Tissue Environments: a Modeling Approach

Cancer is a disease of cellular regulation, often initiated by genetic mutation within cells, and leading to a heterogeneous cell population within tissues. In the competition for nutrients and growth space within the tumors the phenotype of each cell determines its success. Selection in this process is imposed by both the microenvironment (neighboring cells, extracellular matrix, and diffusing substances), and the whole of the organism through for example the blood supply. In this view, the development of tumor cells is in close interaction with their increasingly changing environment: the more cells can change, the more their environment will change. Furthermore, instabilities are also introduced on the organism level: blood supply can be blocked by increased tissue pressure or the tortuosity of the tumor-neovascular vessels. This coupling between cell, microenvironment, and organism results in behavior that is hard to predict. Here we introduce a cell-based computational model to study the effect of blood flow obstruction on the micro-evolution of cells within a cancerous tissue. We demonstrate that stages of tumor development emerge naturally, without the need for sequential mutation of specific genes. Secondly, we show that instabilities in blood supply can impact the overall development of tumors and lead to the extinction of the dominant aggressive phenotype, showing a clear distinction between the fitness at the cell level and survival of the population. This provides new insights into potential side effects of recent tumor vasculature renormalization approaches

The role of endothelial Dll4 in cancer metastasis

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade de Ciências biológicas e biomédicasThe metastatic spread of cancer is still the major barrier to the treatment of this disease. Cancer-mortality is mainly due to recurrence and metastasis. Although much has been done in the field of cancer treatment, prevention and approach to metastases are still areas not fully explored. Over and under-expression of Dll4/Notch signaling has been demonstrated to impair tumor growth through opposing patterns of vascular modulation in different mouse tumor models and human cancer xenografts. Recent evidence implicates Dll4/Notch pathway in the metastasis mechanism, but less is known about the specific role of endothelial Dll4. For this reason, we proposed to investigate how endothelial Dll4 expression interferes with the metastatic process. To address it we used a spontaneous metastasis mouse model based on Lewis Lung Carcinoma (LLC) subcutaneous transplants in endothelial-specific Dll4 lossof- function (eDll4cKO) and endothelial-specific Dll4 over-expression (D4OE) mice. Results demonstrated that eDll4cKO is responsible for the vascular function regression that leads to tumor growth reduction. Early steps of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell selection were also inhibited by eDll4cKO, leading to a substantial reduction of circulating tumor cells and reduction in the number and burden of macrometastases. Intravasation and extravasation were also compromised by eDll4cKO, possibly due to blockade of the metastatic niche. In the case of the D4OE mice we observed that tumor growth reduction was achieved by vessel proliferation restriction along with an improved vascular maturation, which allowed a more efficient delivery of chemotherapy. This last effect of vessel normalization seemed to prevent metastasis formation even though EMT markers were increased. In conclusion, despite the opposite vascular architecture phenotypes of eDll4cKO and D4OE, both lead to a reduction in metastasis. This is in line with the concept of Dll4 dosage observed in the wound-healing context and represents a promising therapeutic approach in metastasis prevention/ treatment.RESUMO - A importância da expressão endotelial do ligando Dll4 no processo de metastização - O cancro é, atualmente, uma das principais causas de morte em todo o mundo, a par das doenças cardiovasculares e da doença pulmonar obstrutiva crónica. A mortalidade por cancro está frequentemente associada à metastização, quer seja pelo compromisso hemodinâmico, quer seja pelas consequências do seu tratamento. Apesar dos avanços no tratamento do cancro, com novos agentes biológicos e imunomodeladores, a investigação do mecanismo da metastização, prevenção e abordagem das metástases continuam a ser áreas pouco exploradas. A via Notch é uma via de sinalização intercelular altamente conservada que está envolvida na determinação do destino, regulação da proliferação e diferenciação celulares. O ligando Dll4 tem uma expressão predominantemente endotelial arterial e capilar, crítica para o correto desenvolvimento embrionário, mas restringindo-se às pequenas artérias e capilares no adulto em homeostasia. Ele atua como agente anti-angiogénico em situações de “stress” fisiológico e em contexto tumoral, promovendo a ocorrência de pausas ritmadas na fase de crescimento vascular ativo, que são conducentes à maturação funcional da vasculatura nascente. Os efeitos do aumento e diminuição da expressão do ligando Dll4 sobre a dinâmica tumoral já foram extensamente estudados em modelos tumorais de ratinhos transgénicos e com xenografos. Geralmente, a ativação aberrante da via de sinalização Dll4/Notch está associada a mau prognóstico e probabilidade de metastização. Por outro lado, as terapias de bloqueio Dll4/Notch têm-se revelado eficazes no tratamento de modelos tumorais resistentes às terapias baseadas no “vascular endotelial growth factor” (Vegf), em modelos pré-clínicos. Estudos recentes implicam a ativação da via Notch nas células endoteliais, com alteração do seu fenótipo de forma a favorecer a transmigração das células tumorais, bem como a secreção de “vascular cell adhesion molecule-1”, que promove a adesão de leucócitos e potencia os fenómenos de intravasação e extravasação. Nesse sentido, surge a oportunidade de explorar o papel do ligando Dll4, em concreto, de que forma é que a sua expressão endotelial influencia as várias etapas da cascata da metastização. Para isso, usamos um modelo murino de metastização espontânea que consistiu na injeção subcutânea de células Lewis Lung Carcinoma (LLC) em dois tipos de ratinhos transgénicos: ratinhos com perda-de-função ou sub-expressão endotelialespecífica de Dll4 e ratinhos com ganho-de-função ou sobre-expressão endotelialespecífica de Dll4. Relativamente ao estudo da influência do ganho-de-função endotelialespecífico de Dll4 sobre o tumor primário, foram também usados outros ratinhos: o modelo de papiloma da pele induzido quimicamente e o modelo murino transgénico RIP-Tag2, com insulinoma. Para avaliar a angiogénese do tumor primário foram determinados parâmetros como: densidade, maturidade, funcionalidade e permeabilidade vasculares. Depois de explorado o efeito de Dll4 sobre o fenómeno de transição-epitélio-mesenquimal (EMT), in vitro, procurou-se explorar o mesmo, in vivo, com recurso aos ratinhos mutantes endoteliais-específicos citados. EMT foi caracterizada através da marcação imunofluorescente para Snail-1 e Twist. As células tumorais estaminais (CSC) foram exploradas através da marcação imunofluorescente para p63 e CD49f. A hipóxia tumoral foi avaliada através do teste com “Hypoxyprobe”. O circuito das células tumorais metastáticas foi analisado com recurso à marcação das células com uma proteína verde fluorescente, recorrendo às técnicas de imunofluorescência e “fluorescent associated cell sorting”. A análise da expressão génica foi feita através do “quantitative real time polymerase chain reaction”, tanto nos ratinhos com perda, como ganho-de-função endotelial-específico de Dll4. Quanto ao estudo da perda-de-função endotelial-específica de Dll4 foi possível avaliar, genericamente, todas as etapas da metastização. Começando pelo tumor primário, verifica-se que ocorre uma redução considerável do seu crescimento, em parte devido à angiogénese que, apesar de aumentada, é desorganizada e menos funcional. A árvore vascular apresenta inúmeras ramificações e um revestimento peri-vascular insuficiente (redução de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA e Pdgfr-β), indicativo de imaturidade vascular. Observa-se um aumento da permeabilidade, que leva a fenómenos de exsudação e consequente má perfusão do tumor. Este endotélio disfuncional acaba por sofrer regressão, condicionando o crescimento tumoral. Constata-se que eventos iniciais como a EMT e a seleção de clones de células tumorais estaminais (CSC) são inibidos pelo bloqueio endotelial-específico de Dll4, conduzindo a uma redução do número de células tumorais circulantes e do número e crescimento das macro-metástases. Os fenómenos posteriores de intravasação e extravasação estão também reduzidos, provavelmente pela não sinalização do tumor primário à medula óssea, via Dll4/ Notch1/ Hey1/ TGF-β. Pelo que, há uma redução da mobilização de células mieloides Cd11c+/VEGFR-1+ para o nicho metastático (pulmão) e fraca deposição de fibronectina, que seria essencial para a acomodação das células tumorais circulantes/metastáticas. De salientar, que não ocorre sinalização parácrina entre o endotélio pulmonar e as células tumorais metastáticas, já que não se verifica marcação para N1ICD pulmonar. No caso da avaliação do papel do ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, verificouse que a redução do crescimento tumoral resulta duma diminuição da angiogénese (com redução concordante da expressão dos receptores pro-angiogénicos Vgfr1 e Vgfr2), mas também da sua normalização. Trata-se duma árvore vascular com poucas ramificações, com características de maturidade evidenciadas pelo grande revestimento peri-vascular (aumento de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA, Pdgfr-βe Ephrin-B2), permitindo um fluxo sanguíneo eficiente, ainda que inferior ao normal, pela redução da densidade vascular. Este efeito, aparentemente paradoxal (contra-intuitivo), acaba por promover um melhor aporte da doxorrubicina (quimioterápico), com bloqueio do crescimento e/ou indução da apoptose tumoral. Esta normalização parece também inibir a metastização, já que apesar de haver um aumento da expressão dos marcadores de EMT, essas células tumorais acabam por ficar “aprisionadas” no endotélio tumoral, dado que se constata uma redução do número de macro-metástases. No entanto, este modelo carece de clarificação no número de células tumorais circulantes, bem como nas restantes etapas da metastização que não chegaram a ser exploradas. Em ambos os modelos, verifica-se que é a função endotelial Dll4/Notch, e não a hipóxia tumoral, que determina a sinalização para EMT e seleção de CSC. Concluindo, observa-se no contexto da dinâmica tumoral fenótipos opostos para os modelos de perda e ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, em linha com o que já foi descrito para o contexto da cicatrização de feridas. Estamos novamente perante o conceito de dose-dependência de Dll4, com aparente repercussão também na metastização. Isto porque o fenótipo final é o mesmo, de redução do número de macrometástases, apesar das diferenças na angiogénese tumoral e no evento inicial de EMT, ficando por explorar a restante cascata da metastização. O uso do ligando Dll4, na forma de sub ou sobre-expressão, pode constituir uma nova abordagem terapêutica ao tratamento dos cancros da mama e colo-rectal metastizados, a par de outros anti-angiogénicos já utilizados. Mas mais interessante será explorar a sua abordagem como fármacos antagonistas ou agonistas, numa estratégia de prevenção da metastização.N/

Multiplexed angiogenic biomarker quantification on single cells

Clinical and biomedical research seeks single-cell quantification to better understand their roles in a complex, multi-cell environment. Recently, quantification of vascular endothelial growth factor receptors (VEGFRs) provided important insights into endothelial cell (EC) characteristics and response in tumor microenvironments. However, data on other angiogenic receptors, such as platelet derived growth factor receptors (PDGFRs), Tie receptors, are also necessary for the development of an accurate angiogenesis model. To gain insights on the involvement of these angiogenic receptors in angiogenesis, I develop a method to quantify receptor concentrations as well as the cell-by-cell heterogeneity. I establish protocols to measure cell membrane VEGFR, NRP1, Tie2, and PDGFR concentration on several cell and tissue models including human dermal fibroblasts (HDFs) in vitro, a 2D endothelial/fibroblast co-culture model in vitro, and a patient-derived xenograft (PDX) model of glioblastoma (GBM). I demonstrate VEGF-A165-mediated downregulation of membrane PDGFRα (~25%) and PDGFRβ (~30%) on HDFs, following a 24-hour treatment. This supports the idea that VEGF-A165 acts independently of VEGFRs to signal through PDGFRα and PDGFRβ. I uncover high intratumoral heterogeneity within the GBM PDX model, with tumor EC-like subpopulations having high concentrations of membrane VEGFR1, VEGFR2, EGFR, IGFR, and PDGFRs. To gain greater insights into cell heterogeneity and examine angiogenic signaling pathways as a whole, I utilize the unique spectral properties of quantum dots (Qdots), and combines Qdots with qFlow cytometry, to dually quantify VEGFR1 and VEGFR2 on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). To enable this quantification, I reduce nonspecific binding between Qdot-conjugated antibodies and cells, identify optimal labeling conditions, and establish that 800 – 20,000 is the dynamic range where accurate Qdot-enabled quantification can be achieved. Through these optimizations we demonstrate measurement of 1,100 VEGFR1 and 6,900 VEGFR2 per HUVEC. 24 h VEGF-A165 treatment induce ~90% upregulation of VEGFR1 and ~30% downregulation of VEGFR2 concentration. We further analyze HUVEC heterogeneity and observe that 24 h VEGF-A165 treatment induces ~15% decrease in VEGFR2 heterogeneity. Overall, we demonstrate experimental and analysis strategies for quantifying two or more RTKs at single-level using Qdots, which will provide new insights into biological systems

Mathematical Model for IL-6-Mediated Tumor Growth, and Targeted Treatment

abstract: Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), the sixth most common cancer type worldwide, accounts for more than 630,000 new cases and 350,000 deaths annually. Drug-resistance and tumor recurrence are the most challenging problems in head and neck cancer treatment. It is hypothesized that a very small fraction of stem-like cells within HNSCC tumor, called cancer stem cells (CSCs), is responsible for tumor initiation, progression, resistance and recurrence. It has also been shown that IL-6 secreted by head and neck tumor-associated endothelial cells (ECs) enhances the survival, self-renewal and tumorigenic potential of head and neck CSCs. In this study we will use a mathematical multi-scale model which operates at the intracellular, molecular, and tissue level to investigate the impacts of EC-secreted IL-6 signaling on the crosstalk between tumor cells and ECs during tumor growth. This model will be calibrated by using the experimental in vivo data. Eventually the model will be modified to explore the responses of head and neck cancer cells to combination therapy involving Tocilizumab (an anti-IL-6R antibody) and Cisplatin (the most frequently used chemotherapy for head and neck cancer). The model will be able to predict the final proportion of CSCs in response to endothelial cell-secreted IL-6 and drug therapies. The model will be validated by directly comparing the experimental treatment data and the model predictions. This could potentially provide a condition under which we could control enlargement of the head and neck CSC pool and tumor recurrence. It may also suggest the best bounds for Cisplatin and/or Tocilizumab dose and frequency to be tested in the clinical trial.Dissertation/ThesisDoctoral Dissertation Applied Mathematics for the Life and Social Sciences 201

Mathematical models for glioma growh and migration inside the brain

284 p.Los gliomas forman el subtipo más prevalente, agresivo e invasivo de tumores cerebrales primarios,caracterizados por una rápida proliferación celular y una elevada capacidad de infiltración. A pesar de los avances de la investigación clínica, estos tumores suelen ser resistentes al tratamiento; la supervivencia media oscila entre 9 y 12 meses, siendo la recurrencia la principal causa de mortalidad.La migración y la invasión de los gliomas en el cerebro son fenómenos complejos y aún se desconocen varios de los mecanismos subyacentes que guían la progresión de estos tumores.En esta tesis, proponemos varios modelos matemáticos para estudiar diversos aspectos de la progresión del glioma en relación con las escalas microscópicas y macroscópicas que caracterizan este proceso. Considerar el carácter intrínsico multiescala de la evolución del glioma permite definir modelos basados en sistemas dinámicos, ecuaciones cinéticas y EDP macroscópicas con diferentes roles dependiendo de los fenómenos a estudiar. Uno de los objetivos principales de esta tesis es integrar datos biológicos y clínicos con los modelos matemáticos. Los datos experimentales utilizados se han obtenido de imágenes por resonancia magnética, de imágenes con tensor de difusión del cerebro humano y de análisis de inmunofluorescencia in vivo de distribuciones de varias proteínas en Drosophila, un modelo fiable para el estudio de la dinámica del glioblastoma.Analizamos las características de anisotropía del tejido nervioso, utilizando los datos del tensor de difusión, y la influencia de la estructura de las fibras en la dinámica de las células tumorales.Mostramos cómo la red de fibras guía la migración celular a lo largo de rutas preferenciales,reproduciendo los patrones ramificados y heterogéneos típicos de la evolución del glioma; asimismo,demostramos cómo los tratamientos multimodales pueden reducir este comportamiento.Estudiamos la interdependencia entre la acidez del microambiente y la vascularización en el proceso de angiogénesis tumoral. Para ello, construimos un modelo capaz de reproducir la influencia de estos mecanismos en el desarrollo de la heterogeneidad intratumoral y de características típicas de la progresión del glioma relacionadas con la hipoxia (e.g. la necrosis). Este estudio permite formular una clasificación de los tumores basada en el nivel de necrosis, así como la investigación de terapias multimodales que incluyan efectos antiangiogénicos.Investigamos la influencia de las protrusiones celulares desde una perspectiva no local.Analizamos su rol en el fenómeno de la guía por contacto y en la manifestación de efectos colaborativos o competitivos entre dos estímulos que determinan cambios de dirección de la velocidad celular.Utilizando el análisis experimental de las distribuciones de varias proteínas, evaluamos la relación de las protrusiones celulares con las integrinas y las proteasas como principales mecanismos de progresión del glioblastoma. Mostramos cómo las interacciones bioquímicas y biomecánicas de estos agentes dan como resultado el desarrollo de frentes de propagación tumoral, que pueden presentar una evolución dinámica y heterogénea en relación a los cambios ambientales.bcam:basque center for applied mathematics; La Caixa Foundatio

Mathematical models for glioma growh and migration inside the brain

284 p.Los gliomas forman el subtipo más prevalente, agresivo e invasivo de tumores cerebrales primarios,caracterizados por una rápida proliferación celular y una elevada capacidad de infiltración. A pesar de los avances de la investigación clínica, estos tumores suelen ser resistentes al tratamiento; la supervivencia media oscila entre 9 y 12 meses, siendo la recurrencia la principal causa de mortalidad.La migración y la invasión de los gliomas en el cerebro son fenómenos complejos y aún se desconocen varios de los mecanismos subyacentes que guían la progresión de estos tumores.En esta tesis, proponemos varios modelos matemáticos para estudiar diversos aspectos de la progresión del glioma en relación con las escalas microscópicas y macroscópicas que caracterizan este proceso. Considerar el carácter intrínsico multiescala de la evolución del glioma permite definir modelos basados en sistemas dinámicos, ecuaciones cinéticas y EDP macroscópicas con diferentes roles dependiendo de los fenómenos a estudiar. Uno de los objetivos principales de esta tesis es integrar datos biológicos y clínicos con los modelos matemáticos. Los datos experimentales utilizados se han obtenido de imágenes por resonancia magnética, de imágenes con tensor de difusión del cerebro humano y de análisis de inmunofluorescencia in vivo de distribuciones de varias proteínas en Drosophila, un modelo fiable para el estudio de la dinámica del glioblastoma.Analizamos las características de anisotropía del tejido nervioso, utilizando los datos del tensor de difusión, y la influencia de la estructura de las fibras en la dinámica de las células tumorales.Mostramos cómo la red de fibras guía la migración celular a lo largo de rutas preferenciales,reproduciendo los patrones ramificados y heterogéneos típicos de la evolución del glioma; asimismo,demostramos cómo los tratamientos multimodales pueden reducir este comportamiento.Estudiamos la interdependencia entre la acidez del microambiente y la vascularización en el proceso de angiogénesis tumoral. Para ello, construimos un modelo capaz de reproducir la influencia de estos mecanismos en el desarrollo de la heterogeneidad intratumoral y de características típicas de la progresión del glioma relacionadas con la hipoxia (e.g. la necrosis). Este estudio permite formular una clasificación de los tumores basada en el nivel de necrosis, así como la investigación de terapias multimodales que incluyan efectos antiangiogénicos.Investigamos la influencia de las protrusiones celulares desde una perspectiva no local.Analizamos su rol en el fenómeno de la guía por contacto y en la manifestación de efectos colaborativos o competitivos entre dos estímulos que determinan cambios de dirección de la velocidad celular.Utilizando el análisis experimental de las distribuciones de varias proteínas, evaluamos la relación de las protrusiones celulares con las integrinas y las proteasas como principales mecanismos de progresión del glioblastoma. Mostramos cómo las interacciones bioquímicas y biomecánicas de estos agentes dan como resultado el desarrollo de frentes de propagación tumoral, que pueden presentar una evolución dinámica y heterogénea en relación a los cambios ambientales.bcam:basque center for applied mathematics; La Caixa Foundatio