Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária
Abstract
Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade de Ciências biológicas e biomédicasThe metastatic spread of cancer is still the major barrier to the treatment of this disease.
Cancer-mortality is mainly due to recurrence and metastasis. Although much has been
done in the field of cancer treatment, prevention and approach to metastases are still areas
not fully explored.
Over and under-expression of Dll4/Notch signaling has been demonstrated to impair tumor
growth through opposing patterns of vascular modulation in different mouse tumor models
and human cancer xenografts. Recent evidence implicates Dll4/Notch pathway in the
metastasis mechanism, but less is known about the specific role of endothelial Dll4. For this
reason, we proposed to investigate how endothelial Dll4 expression interferes with the
metastatic process. To address it we used a spontaneous metastasis mouse model based
on Lewis Lung Carcinoma (LLC) subcutaneous transplants in endothelial-specific Dll4 lossof-
function (eDll4cKO) and endothelial-specific Dll4 over-expression (D4OE) mice.
Results demonstrated that eDll4cKO is responsible for the vascular function regression that
leads to tumor growth reduction. Early steps of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)
and cancer stem cell selection were also inhibited by eDll4cKO, leading to a substantial
reduction of circulating tumor cells and reduction in the number and burden of macrometastases.
Intravasation and extravasation were also compromised by eDll4cKO, possibly
due to blockade of the metastatic niche.
In the case of the D4OE mice we observed that tumor growth reduction was achieved by
vessel proliferation restriction along with an improved vascular maturation, which allowed a
more efficient delivery of chemotherapy. This last effect of vessel normalization seemed to
prevent metastasis formation even though EMT markers were increased.
In conclusion, despite the opposite vascular architecture phenotypes of eDll4cKO and
D4OE, both lead to a reduction in metastasis. This is in line with the concept of Dll4 dosage
observed in the wound-healing context and represents a promising therapeutic approach in
metastasis prevention/ treatment.RESUMO - A importância da expressão endotelial do ligando Dll4 no processo de metastização - O cancro é, atualmente, uma das principais causas de morte em todo o mundo, a par das
doenças cardiovasculares e da doença pulmonar obstrutiva crónica. A mortalidade por
cancro está frequentemente associada à metastização, quer seja pelo compromisso
hemodinâmico, quer seja pelas consequências do seu tratamento. Apesar dos avanços no
tratamento do cancro, com novos agentes biológicos e imunomodeladores, a investigação
do mecanismo da metastização, prevenção e abordagem das metástases continuam a ser
áreas pouco exploradas.
A via Notch é uma via de sinalização intercelular altamente conservada que está envolvida
na determinação do destino, regulação da proliferação e diferenciação celulares. O ligando
Dll4 tem uma expressão predominantemente endotelial arterial e capilar, crítica para o
correto desenvolvimento embrionário, mas restringindo-se às pequenas artérias e capilares
no adulto em homeostasia. Ele atua como agente anti-angiogénico em situações de
“stress” fisiológico e em contexto tumoral, promovendo a ocorrência de pausas ritmadas na
fase de crescimento vascular ativo, que são conducentes à maturação funcional da
vasculatura nascente.
Os efeitos do aumento e diminuição da expressão do ligando Dll4 sobre a dinâmica
tumoral já foram extensamente estudados em modelos tumorais de ratinhos transgénicos e
com xenografos. Geralmente, a ativação aberrante da via de sinalização Dll4/Notch está
associada a mau prognóstico e probabilidade de metastização. Por outro lado, as terapias
de bloqueio Dll4/Notch têm-se revelado eficazes no tratamento de modelos tumorais
resistentes às terapias baseadas no “vascular endotelial growth factor” (Vegf), em modelos
pré-clínicos. Estudos recentes implicam a ativação da via Notch nas células endoteliais,
com alteração do seu fenótipo de forma a favorecer a transmigração das células tumorais,
bem como a secreção de “vascular cell adhesion molecule-1”, que promove a adesão de
leucócitos e potencia os fenómenos de intravasação e extravasação.
Nesse sentido, surge a oportunidade de explorar o papel do ligando Dll4, em concreto, de
que forma é que a sua expressão endotelial influencia as várias etapas da cascata da
metastização. Para isso, usamos um modelo murino de metastização espontânea que
consistiu na injeção subcutânea de células Lewis Lung Carcinoma (LLC) em dois tipos de
ratinhos transgénicos: ratinhos com perda-de-função ou sub-expressão endotelialespecífica
de Dll4 e ratinhos com ganho-de-função ou sobre-expressão endotelialespecífica
de Dll4. Relativamente ao estudo da influência do ganho-de-função endotelialespecífico
de Dll4 sobre o tumor primário, foram também usados outros ratinhos: o modelo
de papiloma da pele induzido quimicamente e o modelo murino transgénico RIP-Tag2, com insulinoma. Para avaliar a angiogénese do tumor primário foram determinados parâmetros
como: densidade, maturidade, funcionalidade e permeabilidade vasculares. Depois de
explorado o efeito de Dll4 sobre o fenómeno de transição-epitélio-mesenquimal (EMT), in
vitro, procurou-se explorar o mesmo, in vivo, com recurso aos ratinhos mutantes
endoteliais-específicos citados. EMT foi caracterizada através da marcação
imunofluorescente para Snail-1 e Twist. As células tumorais estaminais (CSC) foram
exploradas através da marcação imunofluorescente para p63 e CD49f. A hipóxia tumoral
foi avaliada através do teste com “Hypoxyprobe”. O circuito das células tumorais
metastáticas foi analisado com recurso à marcação das células com uma proteína verde
fluorescente, recorrendo às técnicas de imunofluorescência e “fluorescent associated cell
sorting”. A análise da expressão génica foi feita através do “quantitative real time
polymerase chain reaction”, tanto nos ratinhos com perda, como ganho-de-função
endotelial-específico de Dll4.
Quanto ao estudo da perda-de-função endotelial-específica de Dll4 foi possível avaliar,
genericamente, todas as etapas da metastização. Começando pelo tumor primário,
verifica-se que ocorre uma redução considerável do seu crescimento, em parte devido à
angiogénese que, apesar de aumentada, é desorganizada e menos funcional. A árvore
vascular apresenta inúmeras ramificações e um revestimento peri-vascular insuficiente
(redução de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA e Pdgfr-β), indicativo de
imaturidade vascular. Observa-se um aumento da permeabilidade, que leva a fenómenos
de exsudação e consequente má perfusão do tumor. Este endotélio disfuncional acaba por
sofrer regressão, condicionando o crescimento tumoral. Constata-se que eventos iniciais
como a EMT e a seleção de clones de células tumorais estaminais (CSC) são inibidos pelo
bloqueio endotelial-específico de Dll4, conduzindo a uma redução do número de células
tumorais circulantes e do número e crescimento das macro-metástases. Os fenómenos
posteriores de intravasação e extravasação estão também reduzidos, provavelmente pela
não sinalização do tumor primário à medula óssea, via Dll4/ Notch1/ Hey1/ TGF-β. Pelo
que, há uma redução da mobilização de células mieloides Cd11c+/VEGFR-1+ para o nicho
metastático (pulmão) e fraca deposição de fibronectina, que seria essencial para a
acomodação das células tumorais circulantes/metastáticas. De salientar, que não ocorre
sinalização parácrina entre o endotélio pulmonar e as células tumorais metastáticas, já que
não se verifica marcação para N1ICD pulmonar.
No caso da avaliação do papel do ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, verificouse
que a redução do crescimento tumoral resulta duma diminuição da angiogénese (com
redução concordante da expressão dos receptores pro-angiogénicos Vgfr1 e Vgfr2), mas
também da sua normalização. Trata-se duma árvore vascular com poucas ramificações,
com características de maturidade evidenciadas pelo grande revestimento peri-vascular
(aumento de células de músculo liso, dos marcadores α-SMA, Pdgfr-βe Ephrin-B2), permitindo um fluxo sanguíneo eficiente, ainda que inferior ao normal, pela redução da
densidade vascular. Este efeito, aparentemente paradoxal (contra-intuitivo), acaba por
promover um melhor aporte da doxorrubicina (quimioterápico), com bloqueio do
crescimento e/ou indução da apoptose tumoral. Esta normalização parece também inibir a
metastização, já que apesar de haver um aumento da expressão dos marcadores de EMT,
essas células tumorais acabam por ficar “aprisionadas” no endotélio tumoral, dado que se
constata uma redução do número de macro-metástases. No entanto, este modelo carece
de clarificação no número de células tumorais circulantes, bem como nas restantes etapas
da metastização que não chegaram a ser exploradas.
Em ambos os modelos, verifica-se que é a função endotelial Dll4/Notch, e não a hipóxia
tumoral, que determina a sinalização para EMT e seleção de CSC.
Concluindo, observa-se no contexto da dinâmica tumoral fenótipos opostos para os
modelos de perda e ganho-de-função endotelial-específico de Dll4, em linha com o que já
foi descrito para o contexto da cicatrização de feridas. Estamos novamente perante o
conceito de dose-dependência de Dll4, com aparente repercussão também na
metastização. Isto porque o fenótipo final é o mesmo, de redução do número de macrometástases,
apesar das diferenças na angiogénese tumoral e no evento inicial de EMT,
ficando por explorar a restante cascata da metastização.
O uso do ligando Dll4, na forma de sub ou sobre-expressão, pode constituir uma nova
abordagem terapêutica ao tratamento dos cancros da mama e colo-rectal metastizados, a
par de outros anti-angiogénicos já utilizados. Mas mais interessante será explorar a sua
abordagem como fármacos antagonistas ou agonistas, numa estratégia de prevenção da
metastização.N/