Recent Advances in Bioimage Analysis Methods for Detecting Skeletal Deformities in Biomedical and Aquaculture Fish Species

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How microplastics and adsorbed pollutants affect zebrafish development?

A presença de microplásticos no ecossistema aquático é, nos dias de hoje, uma realidade extremamente preocupante que acarreta sérios riscos para o meio ambiente e para a saúde pública. A capacidade dos microplásticos de adsorverem poluentes orgânicos, como é o caso do benzo[α]pireno (BaP), levanta preocupações adicionais, pois cria uma nova rota de entrada de compostos tóxicos na cadeia alimentar. No entanto, o conhecimento atual sobre o impacto dos microplásticos, inalterados e/ou contaminados, nos organismos aquáticos é ainda insuficiente e requer estudos adicionais. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretende assim fornecer novos dados sobre os efeitos biológicos dos microplásticos utilizando como modelo o peixe-zebra (Danio rerio). Pequenos teleósteos, como é o caso do peixe-zebra, oferecem vantagens significativas relativamente aos modelos animais clássicos e são atualmente utilizados como organismos de primeira linha para avaliar os riscos ambientais associados aos compostos tóxicos presentes nos meios aquáticos. Estudos toxicológicos requerem o uso de materiais inertes e condições controladas, todavia, nenhum dos sistemas atualmente comercializados é adequado para avaliar o efeito tóxico dos microplásticos. Estes sistemas contêm componentes feitos de polímeros plásticos que podem libertar partículas plásticas micrométricas, lixiviar os constituintes químicos ou adsorver os compostos químicos em estudo. O sistema de aquários autônomo ZEB316 foi desenvolvido no âmbito deste trabalho com o objetivo de suprimir esta necessidade e de facultar uma solução económica e fácil de implementar que permita a realização de estudos toxicológicos de última geração. Este sistema é construído com materiais inertes e resistentes à corrosão e proporciona boas condições de alojamento através de um sistema eficiente de recirculação e filtragem da água. A avaliação dos parâmetros da água e do desempenho do crescimento dos peixes mostrou que o sistema ZEB316 oferece condições de alojamento comparáveis à dos sistemas comercialmente disponíveis. A maioria dos resultados obtidos no âmbito desta dissertação provêm da análise de imagens de microscopia de campo claro e/ou fluorescência. Embora o uso de imagens de microscopia seja comum na maioria dos laboratórios e permita obter uma quantidade considerável de informação, a análise destas imagens é geralmente um processo moroso, em parte devido à falta de ferramentas automáticas/semiautomáticas dedicadas que permitam a sua análise. Nesse sentido, desenvolvemos diversas macros para o software ImageJ, com o objetivo de reduzir o erro associado à análise pelo usuário, aumentando assim a reprodutibilidade dos dados e a padronização das metodologias experimentais. Uma vez que o foco deste trabalho está centrado no estudo da osteotoxicidade, é de salientar o desenvolvimento de um conjunto de macros específicas para esse fim e denominadas ZFBONE. Este conjunto de ferramentas permite aos usuários avaliar, a partir de imagens 2D, parâmetros morfométricos de várias estruturas ósseas (por exemplo, opérculo, raios e escamas da barbatana caudal), mas também a extensão e a intensidade das colorações específicas do osso. Além disso, outras macros foram desenvolvidas para outros fins, por exemplo, para analisar os vários parâmetros morfométricos relativos aos embriões de peixe ou para avaliar cortes histológicos. Uma vez desenvolvidos os meios e técnicas necessários para a execução dos ensaios toxicológicos, e subsequente análise dos resultados, procedeu-se à realização das várias experiências que visam compreender efeito biológico dos microplásticos e contaminates no peixe-zebra. Assim, larvas de peixe-zebra foram produzidas e mantidas no sistema previamente descrito, ZEB316, e expostas cronicamente, durante o seu desenvolvimento, a partículas de polietileno de 20- 27 μm, inalteradas (MP) ou contaminadas com benzo[α]pireno (MP-BaP). Estas partículas foram adicionadas à dieta dos peixes através de uma suplementação a 1% m/m. Apesar de não se ter registado qualquer alteração ao nível dos parâmetros morfológicos aos 30 dias pós-fertilização (dpf), a presença de MP e MP-BaP acabou por ter um efeito negativo no crescimento dos espécimes aos 90 e 360 dpf. A fecundidade relativa, a morfologia do ovo/embrião e a área do vitelo também sofreram um impacto negativo em peixes-zebra alimentados com MP-BaP. No que respeita ao estado geral do esqueleto, os peixes expostos a dietas experimentais contendo MP e MP-BaP sofreram um aumento significativo na incidência de deformações esqueléticas aos 30 dpf quando comparados com peixes alimentados com a dieta controlo, bem como um desenvolvimento anómalo da barbatana caudal e escamas, e uma diminuição da qualidade do osso aos 90 dpf. Um comprometimento da formação óssea intergeracional foi também observado na prole de espécimes expostos a MP ou MP-BaP, que se refletiu numa redução do osso opercular dos descendentes aos 6 dpf. Além de um claro efeito no desenvolvimento ósseo, a análise histológica do intestino revelou ainda um número reduzido de células caliciformes em peixes alimentados com dieta MP-BaP, um claro sinal de inflamação intestinal. Finalmente, a exposição das larvas a MP-BaP levou a um aumento da expressão de genes associados à via de resposta do BaP, ao mesmo tempo que impactou negativamente na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo. Os resultados obtidos indicaram um maior comprometimento do desenvolvimento ósseo no peixe-zebra quando sujeito a uma dieta contendo microplásticos contaminados com BaP (MP-BaP), por comparação com a dieta contendo microplásticos não contaminados (MP). Outros autores demostraram também que a presença de BaP afeta a formação das vértebras e o desenvolvimento generalizado do esqueleto, no entanto os mecanismos envolvidos nestes fenómenos permanecem pouco estudados. Desta forma, realizámos ensaios adicionais in vivo com o objetivo de avaliar os efeitos osteotóxicos do BaP durante o desenvolvimento e regeneração óssea em peixe-zebra. A exposição aguda de larvas de peixe-zebra entre os 3 e os 6 dpf ao BaP levou a uma redução do tamanho do osso opercular e uma diminuição quantitativa de células positivas para osteocalcina, indicando um efeito composto na maturação dos osteoblastos. Por sua vez, quando se trata de uma exposição crônica das larvas de peixe-zebra ao BaP, entre os 3 e os 30 dpf, verificou-se que o desenvolvimento do esqueleto axial é afetado, aumentando a incidência e gravidade das deformações esqueléticas. Em peixes jovens adultos, observou-se ainda que a exposição ao BaP afetou não só a mineralização dos raios da barbatana caudal e escamas recém-formados, como prejudicou também o seu padrão morfológico, fenómenos que têm por base uma remodelação óssea desequilibrada. Relativamente às análises de expressão genética de vários marcadores verificou-se que o BaP induziu a ativação das vias xenobióticas e metabólicas e impactou negativamente na formação e organização da matriz extracelular. Curiosamente, a exposição ao BaP regulou positivamente os marcadores de inflamação nas larvas e aumentou o recrutamento de neutrófilos. Uma interação direta entre neutrófilos e a matriz extracelular óssea, ou células responsáveis pela formação do osso, foi observada in vivo, o que sugere um papel dos neutrófilos nos mecanismos subjacentes à osteotoxicidade do BaP. Globalmente, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que a exposição crónica a microplásticos inalterados e/ou contaminados não prejudica apenas o crescimento dos peixes, mas também o seu desempenho a nível reprodutivo, saúde geral do seu esqueleto, e compromete a descendência por meio de efeitos intergeracionais. Além disso, este trabalho fornece novos dados sobre os principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na osteotoxicidade do BaP e aborda o possível papel dos neutrófilos na redução da resposta óssea inflamatória.The presence of microplastics in the aquatic ecosystem represents a major issue for the environment and human health. The capacity of organic pollutants such as benzo[α]pyrene (BaP) to adsorb onto microplastic particles raises additional concerns, as it creates a new route for toxic compounds to enter the food web. Current knowledge on the impact of pristine and/or contaminated microplastics on aquatic organisms remains insufficient, and this work aims at providing new insights by evaluating their biological effects in zebrafish (Danio rerio). The ZEB316, a standalone housing system built with inert materials, and a comprehensive set of ImageJ semi-automatic tools were first developed and optimized to perform state-of-the-art toxicological studies and obtain meaningful data from morphometric analysis of brightfield/ fluorescence images. Zebrafish larvae were exposed throughout their development to polyethylene microplastics, pristine or spiked with BaP, supplemented in the fish diet. While exposure up to 30 days post-fertilization only increased the incidence of skeletal deformities, long-term exposure to pristine/contaminated microplastics not only jeopardized fish growth, reproduction performance, and skeletal health, but it also caused an intergenerational effect. To further study the mechanisms underlying BaP osteotoxicity, several bone-related in vivo assays were used to evaluate the effects of waterborne exposure to BaP during bone development and regeneration. BaP inhibited osteoblast maturation and ECM mineralization and stimulated osteoclast activity, thus affecting bone remodeling. Transgenic and transcriptomic approaches suggested that besides the activation of xenobiotic and metabolic pathways, which may negatively impact extracellular matrix formation and organization, BaP activates inflammatory mechanisms that recruit neutrophils, which affect both osteoblast and osteoclast activity, possibly through a direct interaction of the neutrophils with the bone matrix. This work provides novel data on the effects of microplastics exposure during zebrafish development, in particular its osteotoxic effects, and gives new insights into the cellular and molecular players involved in BaP osteotoxicity.Marco Tarasco was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) through the PhD grant SFRH/BD/128634/2017 and COVID/BD/151848/2021 and by NEUBIAS-COST STSM program as part of action CA15124. This work was funded by FCT through projects UID/Multi/04326/2019, UID/00350/2020, UIDB/04326/2020, UID/MAR/00350/2013 and from the operational programs MAR2020 and COMPETE 2020 through projects OSTEOMAR MAR-02.01.01-FEAMP-0057 and EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121

Zebrafish : a resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders

Animal models are essential tools for addressing fundamental scientific questions about skeletal diseases and for the development of new therapeutic approaches. Traditionally, mice have been the most common model organism in biomedical research, but their use is hampered by several limitations including complex generation, demanding investigation of early developmental stages, regulatory restrictions on breeding, and high maintenance cost. The zebrafish has been used as an efficient alternative vertebrate model for the study of human skeletal diseases, thanks to its easy genetic manipulation, high fecundity, external fertilization, transparency of rapidly developing embryos, and low maintenance cost. Furthermore, zebrafish share similar skeletal cells and ossification types with mammals. In the last decades, the use of both forward and new reverse genetics techniques has resulted in the generation of many mutant lines carrying skeletal phenotypes associated with human diseases. In addition, transgenic lines expressing fluorescent proteins under bone cell- or pathway- specific promoters enable in vivo imaging of differentiation and signaling at the cellular level. Despite the small size of the zebrafish, many traditional techniques for skeletal phenotyping, such as x-ray and microCT imaging and histological approaches, can be applied using the appropriate equipment and custom protocols. The ability of adult zebrafish to remodel skeletal tissues can be exploited as a unique tool to investigate bone formation and repair. Finally, the permeability of embryos to chemicals dissolved in water, together with the availability of large numbers of small-sized animals makes zebrafish a perfect model for high-throughput bone anabolic drug screening. This review aims to discuss the techniques that make zebrafish a powerful model to investigate the molecular and physiological basis of skeletal disorders

Adverse Outcome Pathways: A framework for Identifying Chemical Mode of Action During Zebrafish Embryogenesis

Human health and ecological risk assessors are currently facing increased demands and public pressure to evaluate the potential risk of hundreds to thousands of chemicals based on limited toxicity data. Therefore, scientifically sound models are needed to predict toxicity without sole reliance on conventional whole-organism (vertebrate) bioassays. To help address this challenge, adverse outcome pathways (AOPs) have recently been proposed as conceptual tools to help link direct, molecular-level initiating events to adverse outcomes at higher levels of biological organization. Additionally, using AOPs as frameworks, high-throughput screening (HTS) and high-content screening (HCS) assays have been recently proposed as key components of a tiered regulatory toxicity testing strategy that enables screening and prioritization of chemicals for further testing using conventional bioassays. Therefore, using zebrafish embryonic development as a model, the overall research aims of this dissertation were to 1) rely on paraoxon - the active metabolite of the organophosphorus (OP) insecticide parathion - as a reference acetylcholinesterase (AChE) inhibitor to examine whether the common molecular initiating event (AChE inhibition) was associated with adverse neurological effects at higher levels of biological organization and 2) develop and optimize a HCS assay to identify chemicals impacting cardiovascular function and potentially serve as a platform for guiding AOP discovery and development. Data presented within Chapter 1 suggests that (1) normal AChE activity is not required for secondary motoneuron development and (2) spontaneous tail contractions at 26 hours postfertilization (hpf) are sensitive to paraoxon exposure, an effect that may be independent of AChE inhibition. Data presented within Chapter 2 suggests that, compared to existing zebrafish-based assays, our HCS assay provides a comprehensive chemical screening and AOP discovery platform with 1) increased sample sizes; 2) broad concentration-response format; and 3) the ability to identify chemicals that target cardiovascular function at non-teratogenic concentrations. Overall, this dissertation highlights the scientific and logistical challenges in developing quantitative AOPs to support chemical screening and prioritization strategies. Nonetheless, qualitative AOPs can play a role in identification of HTS/HCS assays that capture key events along an AOP, and results of HTS/HCS-based chemical screens can be used to facilitate development of current and new AOPs

Classifying Chemical Bioactivity by Coupling High-throughput Phenotypic Anchoring and Transcriptome Profiling in Zebrafish

There are more than 87,000 chemicals in current use with little to no toxicity information available. Assessing such a large number of chemicals using traditional methods would take an unreasonable amount of time and money, and require the use a large number of animals. The incorporation of high-throughput in vivo model systems that can overcome limitations of in vitro screens while providing a rapid genome-wide view of chemical bioactivity are needed to help fully realize the vision of 21st century toxicity testing. In this dissertation, I employed transcriptomics using the high-throughput in vivo developmental zebrafish model to generate hypotheses regarding the mechanism of action of specific chemicals and to identify unique transcriptional signatures for a set of endocrine disrupting chemicals that can be used to classify the activity of known and unknown chemicals. We employed comparative transcriptomics in wild-type and ahr2-null zebrafish exposed to mono-substituted isopropylated triaryl phosphate (mITP), a component of the Firemaster 550 flame retardant mixture, and demonstrated that the cardiotoxic effects of mITP are likely mediated through inhibition of retinoic acid receptor signaling and not the aryl hydrocarbon receptor (AhR). Although mITP induced a transcriptional profile indicative of AhR activation in wild-type zebrafish, these signatures were not related to cardiotoxicity. I found that mITP exposure, independent of ahr2 status, decreased the expression of many Hox genes as well as enzymes responsible for retinoic acid metabolism, which are known to be regulated by retinoic acid receptors. Several of the dysregulated Hox genes are involved in cardiac cell lineage determination in early heart development, and in heart tube elongation and looping via cell recruitment in the second heart field. I also employed transcriptomics to investigate the mechanism of developmental toxicity of the antimicrobial agent, triclosan (TCS). Exposure to TCS resulted in robust transcriptome changes with a large number of transcripts being significantly decreased. Downstream functional analyses showed that many of the transcripts significantly affected by TCS are involved in liver functioning and development, suggesting that TCS is hepatotoxic in embryonic zebrafish. I also compared our transcriptomic analysis with the comprehensive in vitro bioactivity profile of TCS from the Environmental Protection Agency’s Toxicity Forecaster (ToxCast) program, and observed low concordance between these two screening strategies. Lastly, I conducted transcriptome profiling of 25 endocrine disrupting chemicals in order to identify discriminatory transcriptional signatures that would help classify chemicals with estrogen, androgen, or thyroid hormone activity. Clustered correlation analysis of the top 1000 significantly differentially expressed transcripts revealed four chemicals with highly similar and unique transcriptional profiles compared to the other 21 chemicals. These four chemicals included three known thyroid hormone receptor agonists, and one unknown chemical, which was later identified as a failed pharmaceutical with thyroid receptor agonist activity. I identified a panel of 27 transcripts as well as a unique pigmentation phenotype for these four chemicals which can be used in future chemical screens to detect other thyroid receptor agonist chemicals in zebrafish. Overall, the work presented here demonstrates the utility of phenotypically anchored whole genome transcriptomics in zebrafish to identify putative mechanisms of action for many chemicals. Furthermore, the information obtained from these types of analyses can be used to develop predictive models to classify the bioactivity of known and unknown chemicals, or can identify biomarkers that can be used in future high-throughput screens

Comprehensive characterization of the cis-regulatory code responsible for the spatio-temporal expression of olSix3.2 in the developing medaka forebrain

A cluster of highly conserved non-coding sequences surrounding the Six3 gene were identified in fish genomes, and transgenesis in medaka fish demonstrates that these sequences have enhancer, silencer and silencer blocker activities that are differentially combined to control the distribution of Six3

Zebrafish Models for Development and Disease 2.0

The special issue (Zebrafish Models for Development and Disease 2.0) is a collection of articles highlighting research using the zebrafish (Danio rerio) experimental organism. Research described in this special issue addresses various developmental biology, genetic, biomedical and neuroscience topics that should be of general interest to the biomedical research community

Establishing zebrafish nutritional requirements in phospholipids, minerals and vitamins: effects on growth and skeletal development

Dissertação de mesrado, Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2013Zebrafish (Danio rerio) is considered a cost-effective model species adequate for research, due to easy maintenance and breeding. Nowadays the use of this species is increasing mainly due to the information coming from genome sequencing, known target genes, and technology for gene knock–down and manipulation. However, the nutrition of zebrafish is poorly studied, with the fish being fed with variable sources of artemia nauplii and commercial diets, which cause effects in research results. The necessity for an adequate balanced diet is a need for scientific replication and animal welfare. The aim of this study was to evaluate the effect of nutritional modulation by supplementing purified diets in vitamins (vitamin D3), phospholipids (phosphatidylethanolamine - PE and phosphatidylcoline - PC) and trace minerals (selenium, zinc, manganese and iodine) in zebrafish growth and reproductive success and subsequently in the larval growth, survival and skeletal development. The experiment was performed with groups of 8 adult zebrafish (5 females and 3 males) per dietary treatment, which were fed with each experimental diet during 28 days before being mated. As results it was observed that control diet (CD) had a positive effect on breeder’s growth and weight, but without success in reproduction. The vitamin D3 - cholecalciferol (D3) presented the lowest growth in adult’s weight, and the lowest TM. The PC diet caused an increment in adult length and an increase in egg diameter and perivitelline space, but with a negative effect in larvae length. The increment in PE on diet of adult zebrafish improved sperm total (TM) and progressive motility (PM), egg diameter and led to an increase of perivitelline space, but with poor results in larvae length. The zinc (ZN) diet caused an increment in initial larval growth (5dpf) and total mineral deposition. The increment of iodine (I) on diet led to a good larvae growth in length (28 dpf), but presented lower values in of egg diameter, perivitelline space. This treatment, despite the poor indicators of egg quality, induced a higher larval growth and a higher mineral content.O peixe zebra (Danio rerio) é considerado uma espécie modelo com um baixo custo de produção e adequada para investigação científica, devido à sua fácil manutenção e ao seu sucesso reprodutivo. Actualmente, devido à vasta informação acerca do seu genoma, função de genes estabelecida, e ferramentas para manipulação da expressão de genes, o uso desta espécie como modelo tem vindo a aumentar. No entanto, os resultados científicos podem ser comprometidos devido aos escassos estudos feitos acerca dos requisitos nutricionais desta espécie. O desenvolvimento de dietas equilibradas é uma necessidade, de forma a possibilitar a replicação de resultados experimentais e permitir um melhor bem-estar animal. Este estudo teve como objectivo a avaliação dos efeitos no peixe zebra da modelação nutricional em vitaminas (vitamina D3), fosfolípidos (fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina) e minerais (selénio, zinco, manganês e iodo) suplementados em dietas purificadas. Esta avaliação foi efectuada em relação ao crescimento e sucesso reprodutivo dos adultos e ao crescimento, sobrevivência e avaliação do desenvolvimento esquelético das larvas. Para tal, foram utilizados grupos de 8 reprodutores por tratamento (5 fêmeas e 3 machos), que foram alimentados durante 28 dias com cada uma das dietas experimentais, sendo depois reproduzidos. Como resultados, foi observado que a dieta comercial controlo (CD) apresentou efeitos positivos no crescimento dos adultos, mas sem qualquer sucesso reprodutivo. O grupo com suplemento em calciferol (vitamina D3) apresentou os valores mais baixos em termos de crescimento e peso dos adultos e baixos valores de TM do esperma assim como uma baixa taxa de eclosão dos ovos. O incremento de fosfatidilcolina (PC) levou a um aumento do crescimento dos adultos e das larvas assim como a um aumento do diâmetro do ovo e do espaço perivitelino. O incremento em fosfatidiletanolamina (PE) na dieta teve um efeito positivo nos parâmetros de qualidade dos reprodutores com um aumento na mobilidade total (TM) e progressiva (PM) do esperma, diâmetro do ovo e incremento do espaço perivitelino, mas com um baixo crescimento das larvas. O suplemento em zinco (ZN) teve como efeitos um aumento inicial no crescimento larvar (5dpf) e da deposição mineral total. Com o incremento de iodo (I) na dieta formam observados bons resultados de crescimento larvar (28 dpf) mas com baixos valores em termos de diâmetro do ovo, espaço perivitelino e deposição mineral.This work was supported by project QREN 23000 - ZEBRAFEEDS - co-financed by FEDER through PO Algarve 21 in the framework of QREN 2007-201

Cryopreservation of zebrafish germ cells: technological improvements and methodological standardization for gene banking and management

Due to the increasing number of zebrafish (Danio rerio) mutant and transgenic lines, there is a high demand for assisted reproductive techniques to support facility management. Efficient zebrafish sperm cryopreservation is a pressing necessity to manage and preserve the valuable zebrafish genetic resources. Although zebrafish sperm cryopreservation was first attempted more than 30 years ago, protocols still lack standardization, which translates into high variability in post-thaw sperm quality and in vitro fertilization success. Therefore, the present thesis aims to improve the current methodologies used for zebrafish sperm cryopreservation and broodstock management towards the standardization of procedures in this species. The introductory context of the present thesis is approached in chapter 1. In this chapter the relevance of zebrafish model is discussed as well as this species sperm cryopreservation usefulness. The main factors affecting sperm quality and the application of reliable quality analysis are discussed in this chapter. The final objective of sperm cryopreservation is to obtain high quality offspring and therefore in vitro fertilization, early development and offspring quality analysis are important tools for the optimization of sperm cryopreservation methodologies. The current knowledge in sperm cryopreservation fundamentals is approached in this chapter, as well as the main advances and bottlenecks in zebrafish sperm cryopreservation. In chapter 2, the zebrafish sperm motility activation was assessed under different conditions of water temperature and conductivity. The environmental conditions present in the fertilization microenvironment are responsible for the mechanism of spermatozoa motility activation and metabolic modulation that influence the probability of fertilization success. Zebrafish is commonly reared at 28°C, but with variable water conductivity conditions among facilities. However, sperm motility analysis is routinely performed with distilled water at room temperature. We aimed to understand the effect of water temperature and conductivity on sperm motility and fertilization ability. Water at 28°C with lower water conductivity (0 and 700 μS/cm) improve sperm motility parameters. Standardization of the water conditions (of system water and activation médium used for motility analysis) among facilities is highly relevant to improve the reproducibility of sperm quality analysis and thus, to predict with higher accuracy fertilization ability. Successful cryopreservation depends on high quality sperm, which depends on the quality of breeders. Consequently, broodstock selection and management is a priority to improve sperm cryopreservation. The broodstock diet has a preponderant effect on gamete quality, particularly in phospholipids and antioxidants content which are known to promote spermatogenesis. Therefore, in chapter 3 we aimed to determine the effects of a tailor-made purified diet supplemented with phosphatidylcholine (PC) or phosphatidylethanolamine (PE) on the zebrafish reproductive performance, gamete quality and larval skeletal malformations. Both dietary supplementations with phospholipids improved sperm motility and eggs quality, however PC increased the incidence of skeletal malformations on the offspring, as previously observed in other teleosts. Although dietary phospholipids classes have a role in the ossification process of the vertebral column in teleosts, its mechanisms are still to be understood. Therefore, the development and use of a standardized diet for zebrafish broodstock is essential to reduce the variability of the reproductive performance among facilities. In chapter 4, the selection of optimal age and minimum sperm collection frequency was evaluated, since these factors are essential to obtain high quality samples. Our results indicate that young males (6-8 months) showed higher sperm quality and require a minimum of 14 days between sperm collections to recover sperm plasma membrane viability. An important bottleneck in cryopreservation is the liquid nitrogen requirement for storage. Therefore, it was established in chapter 5 a new cryopreservation method using an electric ultrafreezer (-150°C) as an alternative to liquid nitrogen, for the first time in a teleost species. This protocol reaches a fast cooling rate (-66°C/min) in one single step and yields higher sperm viability and DNA integrity in comparison to the traditional methods (-20°C/min in liquid nitrogen). The synergy obtained by the combination of cryoprotectants is a successful cryopreservation strategy that can be beneficial in the optimization of zebrafish sperm cryopreservation. Therefore, it was selected the most adequate cryoprotectant combination that generates offspring with normal skeletogenesis. Data show that 15% of DMF with 50 mM of bicine or 10% of egg yolk is beneficial for the quality of zebrafish offspring sired by cryopreserved sperm. To the best of our knowledge, this is the first report on skeletal development of zebrafish offspring sired by cryopreserved sperm performed with different extender compositions. Zebrafish is especially useful to investigate some of the most prominent human diseases such as diabetes. Among other consequences, diabetes (type I and II) causes disturbances in the male reproductive system, since glucose metabolism is an important event not only in spermatogenesis but also in mature spermatozoa metabolism. In chapter 6 we aimed to validate zebrafish as a useful model organism to investigate male reproductive dysfunctions mechanisms caused by type I diabetes. In this chapter, sperm cryopreservation was applied to a relevant zebrafish model of type I diabetes. The transgenic zebrafish under diabetic conditions shows higher levels of insulin a (insa), insulin receptor a (inra) and glucose carrier 2 (slc2a2) transcripts in spermatozoa when compared to the controls. This is because gametogenesis occurred under diabetic conditions, changing transcription in the germline. Consequently, spermatozoa carry the imprinted transcripts that will be transmitted during fertilization. Sperm quality (motility, viability and DNA integrity) was lower in the transgenic fish under (transient) diabetic state as observed in human and mouse model. Sperm cryopreservation affects sperm quality of fish both under diabetic and non-diabetic conditions. However, diabetic conditions were detrimental in sperm freezability, which can be explained by the lower initial sperm quality. In this chapter zebrafish was validated as a useful model organism to investigate male reproductive dysfunctions mechanisms caused by type I diabetes. Relevant differences between different zebrafish lines are evidenced in terms of sperm quality and susceptibility to damage, which suggests that it is an important factor to consider while establishing sperm cryopreservation protocols. This thesis offers new insights and a set of guidelines on breeder’s management and sperm cryopreservation to improve zebrafish husbandry practices. Keywords: Zebrafish, sperm quality, cryopreservation, ultrafreezer, sperm motility activation, diet, type I diabetesO peixe zebra (Danio rerio) tornou-se inquestionavelmente num dos organismos modelo mais proeminentes da atualidade, devido às suas características favoráveis para investigação. O desenvolvimento de técnicas de edição genética e a sequenciação do genoma desta espécie possibilitou o desenvolvimento de milhares de linhas transgénicas e mutantes. Consequentemente, a gestão dos numerosos genótipos trouxe desafios na manutenção de espaço e gestão destes recursos genéticos. A criopreservação de sémen é uma ferramenta valiosa para a gestão destes valiosos recursos genéticos, que pode solucionar este problema. No entanto, apesar do primeiro protocolo de criopreservação de sémen de peixe zebra ter sido desenvolvido há mais de 30 anos, ainda requer otimização e estandardização. Consequentemente, existe elevada variabilidade na qualidade do sémen e sucesso da fertilização in vitro entre biotérios. O desenvolvimento de uma técnica de criopreservação de sémen eficiente é atualmente um dos maiores desafios da comunidade de peixe zebra. O objetivo principal da presente tese foi a otimização das técnicas de gestão de reprodutores e criopreservação de sémen de peixe zebra, no sentido da estandardização das práticas e maior reprodutibilidade dos resultados científicos nesta espécie. A introdução ao contexto da presente tese é abordada no capítulo 1. Neste capitulo a importância do peixe zebra como organismo modelo é abordado assim como a utilidade da criopreservação do sémen nesta espécie. Os factores que afetam a qualidade do sémen assim como a aplicação de análises de qualidade robustas são discutidos neste capítulo. O objetivo final da criopreservação de sémen é a produção de progenia com elevada qualidade. Consequentemente, neste capítulo a fertilização in vitro, o desenvolvimento emb rionário e a análise da qualidade da progenia é discutida. Neste capítulo são explorados os fundamentos de criobiologia, principais avanços e dificuldades no desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sémen de peixe zebra. As condições do ambiente de fertilização são responsáveis pela ativação da mobilidade dos espermatozóides e pela modulação do seu metabolismo, afetando consequentemente o sucesso da fertilização. O peixe zebra é estabulado a 28°C com parâmetros de condutividade da água variáveis entre biotérios. No entanto, as análises de mobilidade espermática são realizadas rotineiramente com água destilada a temperatura ambiente. Consequentemente, no capítulo 2 o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar o efeito da temperatura e condutividade da água na mobilidade de sémen de peixe zebra. Adicionalmente, foi estudado o efeito da condutividade da água no sucesso da fertilização. A água a 28°C e com baixa condutividade (0 e 700 μS/cm) melhorou os parâmetros de mobilidade. A estandardização das condições da água (dos sistemas de cultivo e do meio de ativação usado na análise da mobilidade) entre biotérios é essencial para a otimização das análises de qualidade, reprodutibilidade científica e maior precisão na estimação do potencial de sucesso de fertilização de uma amostra de sémen. O sucesso da criopreservação depende da qualidade do sémen que, por sua vez, depende da qualidade dos reprodutores. Consequentemente, a seleção e gestão de reprodutores é uma prioridade, de forma a assegurar o sucesso do método de criopreservação. Um dos factores mais importantes na gestão de reprodutores é a sua dieta. A nutrição dos reprodutores tem um importante efeito na qualidade dos gametas já que afeta a gametogénese, particularmente a composição da dieta em fosfolípidos e antioxidantes. O objetivo do capítulo 3 foi determinar o efeito de dietas purificadas suplementadas com fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE). A suplementação em fosfolípidos melhorou a mobilidade do sémen; no entanto, a suplementação em PC provocou um aumento da incidência de malformações esqueléticas na progenia. Estes resultados estão de acordo com estudos de nutrição anteriores em teleosteos. O desenvolvimento e utilização de dietas estandardizadas nos reprodutores de peixe zebra é essencial para optimizar a performance reprodutiva e reduzir a variabilidade entre biotérios. A seleção da idade ótima dos machos e a frequência mínima adequada para recolha de sémen é essencial para obter amostras com elevada qualidade. No capítulo 4 foi determinado o efeito da idade e da frequência de extração na qualidade do sémen. O nosso estudo mostrou que machos jovens (6-8 meses) de peixe zebra revelam maior qualidade de sémen e necessitam de um mínimo de 14 dias de repouso para recuperarem a viabilidade da membrana plasmática dos espermatozóides. Uma das maiores desvantagens da criopreservação é a necessidade de azoto líquido para armazenamento de amostras. Considerando esta questão, foi desenvolvido no capítulo 5 o primeiro protocolo de criopreservação de sémen de teleósteos utilizando um ultracongelador (-150°C). Este protocolo é realizado num só passo, sem a utilização de azoto líquido, sendo as amostras criopreservadas a - 66°C/min. Este protocolo melhorou a viabilidade e integridade do ADN dos espermatozóides em comparação com o método convencional (-20°C/min armazenado em azoto líquido). A combinação de diferentes crioprotetores é uma estratégia de criopreservação com elevado sucesso. Consequentemente, um dos objetivos do nosso trabalho foi selecionar a combinação de crioprotetores mais adequada para o protocolo de criopreservação estabelecido anteriormente. Os resultados deste trabalho indicam que a utilização de 15% de DMF com 50 mM de bicina ou 10% de gema de ovo produzem sémen de elevada qualidade do sémen e maior sucesso em fertilizações in vitro, assegurando também o adequado desenvolvimento esquelético da progenia. Este foi o primeiro estudo de caracterização de malformações esqueléticas desenvolvidas na progenia de peixe zebra produzido com sémen criopreservado com diferentes composições de crioprotetores. O peixe zebra é particularmente útil na investigação de doenças humanas com elevada prevalência na população mundial tal como a diabetes. Entre outras complicações geradas por esta patologia, a diabetes tipo I e II afeta o sistema reprodutor masculino. Estas perturbações ocorrem devido à alteração do metabolismo da glucose, essencial durante a espermatogénese e no metabolismo dos espermatozóides. Comparando com outros modelos, o peixe zebra tem gerações mais curtas, consequentemente seria uma ferramenta útil para esta investigação. O objetivo do capítulo 6 foi validar o peixe zebra como organismo modelo para o estudo dos mecanismos de ação da diabetes tipo I pelos quais afetam o sistema reprodutor masculino. Tal como observado em humanos e no organismo modelo de diabetes roedor, a qualidade do sémen (mobilidade, viabilidade, integridade do ADN) é reduzida na estirpe transgénica sob estado transiente de diabetes tipo I em relação ao controlo. O sémen do modelo transgénico em estado diabético revela aumento dos níveis de transcriptos de insulina a (insa), receptor de insulina a (inra) assim como de um transportador especifico de glucose GLUT 2 (slc2a2). Este facto é devido a uma alteração dos níveis de transcrição destes genes na linha germinal durante a gametogénese. O sémen criopreservado de ambos os tratamentos (controlo e diabético) revelou um decréscimo na qualidade, tal como esperado. O tratamento diabético aumentou a susceptibilidade das células à criopreservação, o que se pode dever à sua qualidade seminal inicial inferior. Assim, evidenciamos neste modelo transgénico para a diabetes tipo I os mesmos efeitos na qualidade seminal observados em humanos e em rato, validando desta forma esta linha para a investigação dos efeitos desta doença no sistema reprodutor masculino. A presente tese propõe o estabelecimento de medidas de seleção e maneio de reprodutores e análise de qualidade seminal. Adicionalmente propomos um método inovador de criopreservação de sémen, prático e económico, através do uso de um ultracongelador. Verificou-se o impacto de diferentes combinações de crioprotectores na qualidade e na esqueletogénese da progénie gerada com sémen criopreservado. Resumindo, esta tese propõe procedimentos e metodologias para a gestão de reprodutores de peixe zebra relevantes para o estabelecimento de medidas de estandardização, promovendo desta forma a reprodutibilidade de metodologias científicas.Patricia Diogo was the recipient of a doctoral grant SFRH/BD/97466/2013 from the FCT. This work was partly founded by the FCT and the European Commission (ERDF-COMPETE) through PEst-C/MAR/LA0015/2011 project and by the FCT through UID/Multi/04326/2019, and by project LARVAMIX-17925 funded by Portugal and by the European Union through FEDER, COMPETE 2020 and CRESC Algarve 2020, in the framework of Portugal 2020

Novel technologies for high-throughput and high-content studies on zebrafish larvae

The zebrafish larva is an ideal candidate for in vivo high-throughput screening: it is a small vertebrate, it is optically transparent, possesses complex organs, and is easy to culture. In addition, genetic mutants and models of human diseases are widely available. Despite these attractive features there are no tools capable of screening at sufficient throughput and resolution to fully exploit the zebrafish. Here, I present a collection of technologies that enable high-throughput studies on zebrafish larvae at cellular resolution.Engineering and Applied Science