A presença de microplásticos no ecossistema aquático é, nos dias de hoje, uma
realidade extremamente preocupante que acarreta sérios riscos para o meio
ambiente e para a saúde pública. A capacidade dos microplásticos de adsorverem
poluentes orgânicos, como é o caso do benzo[α]pireno (BaP), levanta preocupações
adicionais, pois cria uma nova rota de entrada de compostos tóxicos na cadeia
alimentar. No entanto, o conhecimento atual sobre o impacto dos microplásticos,
inalterados e/ou contaminados, nos organismos aquáticos é ainda insuficiente e
requer estudos adicionais. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretende
assim fornecer novos dados sobre os efeitos biológicos dos microplásticos utilizando
como modelo o peixe-zebra (Danio rerio). Pequenos teleósteos, como é o caso do
peixe-zebra, oferecem vantagens significativas relativamente aos modelos animais
clássicos e são atualmente utilizados como organismos de primeira linha para avaliar
os riscos ambientais associados aos compostos tóxicos presentes nos meios
aquáticos.
Estudos toxicológicos requerem o uso de materiais inertes e condições controladas,
todavia, nenhum dos sistemas atualmente comercializados é adequado para avaliar
o efeito tóxico dos microplásticos. Estes sistemas contêm componentes feitos de
polímeros plásticos que podem libertar partículas plásticas micrométricas, lixiviar os
constituintes químicos ou adsorver os compostos químicos em estudo. O sistema de
aquários autônomo ZEB316 foi desenvolvido no âmbito deste trabalho com o objetivo
de suprimir esta necessidade e de facultar uma solução económica e fácil de
implementar que permita a realização de estudos toxicológicos de última geração.
Este sistema é construído com materiais inertes e resistentes à corrosão e
proporciona boas condições de alojamento através de um sistema eficiente de
recirculação e filtragem da água. A avaliação dos parâmetros da água e do
desempenho do crescimento dos peixes mostrou que o sistema ZEB316 oferece
condições de alojamento comparáveis à dos sistemas comercialmente disponíveis.
A maioria dos resultados obtidos no âmbito desta dissertação provêm da análise de
imagens de microscopia de campo claro e/ou fluorescência. Embora o uso de
imagens de microscopia seja comum na maioria dos laboratórios e permita obter uma quantidade considerável de informação, a análise destas imagens é geralmente um
processo moroso, em parte devido à falta de ferramentas
automáticas/semiautomáticas dedicadas que permitam a sua análise. Nesse sentido,
desenvolvemos diversas macros para o software ImageJ, com o objetivo de reduzir o
erro associado à análise pelo usuário, aumentando assim a reprodutibilidade dos
dados e a padronização das metodologias experimentais. Uma vez que o foco deste
trabalho está centrado no estudo da osteotoxicidade, é de salientar o
desenvolvimento de um conjunto de macros específicas para esse fim e denominadas
ZFBONE. Este conjunto de ferramentas permite aos usuários avaliar, a partir de
imagens 2D, parâmetros morfométricos de várias estruturas ósseas (por exemplo,
opérculo, raios e escamas da barbatana caudal), mas também a extensão e a
intensidade das colorações específicas do osso. Além disso, outras macros foram
desenvolvidas para outros fins, por exemplo, para analisar os vários parâmetros
morfométricos relativos aos embriões de peixe ou para avaliar cortes histológicos.
Uma vez desenvolvidos os meios e técnicas necessários para a execução dos
ensaios toxicológicos, e subsequente análise dos resultados, procedeu-se à
realização das várias experiências que visam compreender efeito biológico dos
microplásticos e contaminates no peixe-zebra. Assim, larvas de peixe-zebra foram
produzidas e mantidas no sistema previamente descrito, ZEB316, e expostas
cronicamente, durante o seu desenvolvimento, a partículas de polietileno de 20-
27 μm, inalteradas (MP) ou contaminadas com benzo[α]pireno (MP-BaP). Estas
partículas foram adicionadas à dieta dos peixes através de uma suplementação a 1%
m/m. Apesar de não se ter registado qualquer alteração ao nível dos parâmetros
morfológicos aos 30 dias pós-fertilização (dpf), a presença de MP e MP-BaP acabou
por ter um efeito negativo no crescimento dos espécimes aos 90 e 360 dpf. A
fecundidade relativa, a morfologia do ovo/embrião e a área do vitelo também sofreram
um impacto negativo em peixes-zebra alimentados com MP-BaP. No que respeita ao
estado geral do esqueleto, os peixes expostos a dietas experimentais contendo MP e
MP-BaP sofreram um aumento significativo na incidência de deformações
esqueléticas aos 30 dpf quando comparados com peixes alimentados com a dieta
controlo, bem como um desenvolvimento anómalo da barbatana caudal e escamas,
e uma diminuição da qualidade do osso aos 90 dpf. Um comprometimento da
formação óssea intergeracional foi também observado na prole de espécimes
expostos a MP ou MP-BaP, que se refletiu numa redução do osso opercular dos descendentes aos 6 dpf. Além de um claro efeito no desenvolvimento ósseo, a análise
histológica do intestino revelou ainda um número reduzido de células caliciformes em
peixes alimentados com dieta MP-BaP, um claro sinal de inflamação intestinal.
Finalmente, a exposição das larvas a MP-BaP levou a um aumento da expressão de
genes associados à via de resposta do BaP, ao mesmo tempo que impactou
negativamente na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo.
Os resultados obtidos indicaram um maior comprometimento do desenvolvimento
ósseo no peixe-zebra quando sujeito a uma dieta contendo microplásticos
contaminados com BaP (MP-BaP), por comparação com a dieta contendo
microplásticos não contaminados (MP). Outros autores demostraram também que a
presença de BaP afeta a formação das vértebras e o desenvolvimento generalizado
do esqueleto, no entanto os mecanismos envolvidos nestes fenómenos permanecem
pouco estudados. Desta forma, realizámos ensaios adicionais in vivo com o objetivo
de avaliar os efeitos osteotóxicos do BaP durante o desenvolvimento e regeneração
óssea em peixe-zebra. A exposição aguda de larvas de peixe-zebra entre os 3 e os 6
dpf ao BaP levou a uma redução do tamanho do osso opercular e uma diminuição
quantitativa de células positivas para osteocalcina, indicando um efeito composto na
maturação dos osteoblastos. Por sua vez, quando se trata de uma exposição crônica
das larvas de peixe-zebra ao BaP, entre os 3 e os 30 dpf, verificou-se que o
desenvolvimento do esqueleto axial é afetado, aumentando a incidência e gravidade
das deformações esqueléticas. Em peixes jovens adultos, observou-se ainda que a
exposição ao BaP afetou não só a mineralização dos raios da barbatana caudal e
escamas recém-formados, como prejudicou também o seu padrão morfológico,
fenómenos que têm por base uma remodelação óssea desequilibrada. Relativamente
às análises de expressão genética de vários marcadores verificou-se que o BaP
induziu a ativação das vias xenobióticas e metabólicas e impactou negativamente na
formação e organização da matriz extracelular. Curiosamente, a exposição ao BaP
regulou positivamente os marcadores de inflamação nas larvas e aumentou o
recrutamento de neutrófilos. Uma interação direta entre neutrófilos e a matriz
extracelular óssea, ou células responsáveis pela formação do osso, foi observada in
vivo, o que sugere um papel dos neutrófilos nos mecanismos subjacentes à
osteotoxicidade do BaP. Globalmente, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que a
exposição crónica a microplásticos inalterados e/ou contaminados não prejudica
apenas o crescimento dos peixes, mas também o seu desempenho a nível
reprodutivo, saúde geral do seu esqueleto, e compromete a descendência por meio
de efeitos intergeracionais. Além disso, este trabalho fornece novos dados sobre os
principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na osteotoxicidade do BaP
e aborda o possível papel dos neutrófilos na redução da resposta óssea inflamatória.The presence of microplastics in the aquatic ecosystem represents a major issue for
the environment and human health. The capacity of organic pollutants such as
benzo[α]pyrene (BaP) to adsorb onto microplastic particles raises additional concerns,
as it creates a new route for toxic compounds to enter the food web. Current
knowledge on the impact of pristine and/or contaminated microplastics on aquatic
organisms remains insufficient, and this work aims at providing new insights by
evaluating their biological effects in zebrafish (Danio rerio). The ZEB316, a standalone
housing system built with inert materials, and a comprehensive set of ImageJ
semi-automatic tools were first developed and optimized to perform state-of-the-art
toxicological studies and obtain meaningful data from morphometric analysis of brightfield/
fluorescence images. Zebrafish larvae were exposed throughout their
development to polyethylene microplastics, pristine or spiked with BaP, supplemented
in the fish diet. While exposure up to 30 days post-fertilization only increased the
incidence of skeletal deformities, long-term exposure to pristine/contaminated
microplastics not only jeopardized fish growth, reproduction performance, and skeletal
health, but it also caused an intergenerational effect. To further study the mechanisms
underlying BaP osteotoxicity, several bone-related in vivo assays were used to
evaluate the effects of waterborne exposure to BaP during bone development and
regeneration. BaP inhibited osteoblast maturation and ECM mineralization and
stimulated osteoclast activity, thus affecting bone remodeling. Transgenic and
transcriptomic approaches suggested that besides the activation of xenobiotic and
metabolic pathways, which may negatively impact extracellular matrix formation and
organization, BaP activates inflammatory mechanisms that recruit neutrophils, which
affect both osteoblast and osteoclast activity, possibly through a direct interaction of
the neutrophils with the bone matrix. This work provides novel data on the effects of
microplastics exposure during zebrafish development, in particular its osteotoxic
effects, and gives new insights into the cellular and molecular players involved in BaP
osteotoxicity.Marco Tarasco was supported by the Portuguese Foundation for Science and
Technology (FCT) through the PhD grant SFRH/BD/128634/2017 and
COVID/BD/151848/2021 and by NEUBIAS-COST STSM program as part of action
CA15124. This work was funded by FCT through projects UID/Multi/04326/2019,
UID/00350/2020, UIDB/04326/2020, UID/MAR/00350/2013 and from the operational
programs MAR2020 and COMPETE 2020 through projects OSTEOMAR
MAR-02.01.01-FEAMP-0057 and EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121
