Development of the Assay Methods for Pesticides by Immunological Technique

博士（学術）京都女子大

Multicomponent Analysis by Surface Plasmon Resonance-based Immunosensor for Control of Food Hygiene

博士(学術)京都女子大

Κατασκευή και εφαρμογές απορριπτόμενων αισθητήρων για τον ηλεκτροχημικό προσδιορισμό οργανικών ενώσεων

Στο πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη ηλεκτροχημικών αισθητήρων εκτύπωσης και μεθόδων και για τον προσδιορισμό ορισμένων σημαντικών οργανικών ενώσεων. Κατασκευάστηκαν εκτυπωμένα ηλεκτρόδια, τροποποιημένα με πρόδρομες ενώσεις του βισμουθίου, για τον προσδιορισμό τριών νιτροφαινολών (2-νιτροφαινόλη, 4-νιτροφαινόλη, 2,4-δινιτροφαινόλη) Αναπτύχθηκε μέθοδος καθοδικής βολταμμετρίας διαφορικού παλμού για τον προσδιορισμό αυτών των νιτροφαινολών σε νερό. Τα όρια ποσοτικοποίησης σε 3 δείγματα νερού ήταν στην περιοχή 1,1-2,2 μmol L-1 ενώ χρησιμοποιώντας εκχύλιση στερεάς φάσης, τα όρια ποσοτικοποίησης κυμάνθηκαν στο εύρος 0,021-0,025 μmol L-1. Η μέση % ανάκτηση σε δείγματα νερού κυμάνθηκε στην περιοχή από 87 έως 108 %. Επίσης, αναπτύχθηκε μέθοδος καθοδικής βολταμμετρίας διαφορικού παλμού για τον προσδιορισμό πέντε νεονικοτινοειδών φυτοφαρμάκων (Imidacloprid, Thiamethoxam, Clothianidin Nitenpyram, Dinotefuran) σε νερό με εκτυπωμένα ηλεκτρόδια, τροποποιημένα με παχύ φιλμ βισμουθίου. Τα όρια ποσοτικοποίησης ήταν από 0,76 έως 2,10 mg L-1 ενώ μετά εκχύλιση στερεάς φάσης ήταν στην περιοχή από 9.0 έως 17 μg L-1, με την ανάκτηση να κυμαίνεται στην περιοχή από 89 έως 109 %. Η τρίτη εφαρμογή αφορά τον προσδιορισμό 4 αζωχρωμάτων (Ponceau 4R-CarmoisineSunset Yellow-Tartrazine) σε μη αλκοολούχα ποτά με εκτυπωμένα ηλεκτρόδια γραφίτη. Τα όρια ανίχνευσης κυμάνθηκαν από 0,02 έως 0,04 mg L-1 και οι ανακτήσεις στα δείγματα ήταν στην περιοχή από 95 έως 109 %. Τέλος, κατασκευάστηκαν εκτυπωμένα ηλεκτρόδια, τροποποιημένα με γραφένιο/Nafion, και αναπτύχθηκε μέθοδος ανοδικής αναδιαλυτικής βολταμμετρία για τον προσδιορισμό καφεΐνης σε τρόφιμα. Το όριο προσδιορισμού ήταν 0,06 μmol L-1 και οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν στην περιοχή από 101 έως 106%. Οι εκτυπωμένοι αισθητήρες παρουσιάζουν σχετικά ικανοποιητική ευαισθησία (ιδίως όταν προηγείται στάδιο προκατεργασίας/προσυγκέντρωσης) ενώ το μεγαλύτερο μειονέκτημά τους είναι η μειωμένη εκλεκτικότητα, συνεπώς η εφαρμοσιμότητα τους εξαρτάται από το δείγμα υπό ανάλυση. Οι αισθητήρες είναι κατάλληλοι για γρήγορη ανίχνευση (screening) νιτροφαινολών και νεονικοτινοειδών φυτοφαρμάκων σε νερό, για τον προσδιορισμό μεμονωμένων χρωστικών σε ποτά και για τον προσδιορισμό καφεΐνης σε τρόφιμα.In the present study we have developed and evaluated disposable sensors for the determination of some important organic compounds. Screen-printed disposable sensors modified with bismuth precursors were fabricated and applied for the first time to organic cathodic electroanalysis, namely to the determination of 2-nitrophenol, 4-ntrophenol and 2,4-dnitrophenol, in water samples by differential pulse cathodic voltammetry. The limits of quantification in 3 different water matrices were in the range 1.1-2.2 μmol L-1. Using a simple solid-phase extraction procedure, the limits of quantification were in the range 0.021-0.025 μmol L-1 while the recoveries of samples spiked with the 3 target nitrophenols were between 87 % and 108 %. The applicability of sputtered thick-film bismuth electrodes was tested for the determination of five pesticides (Imidacloprid, Thiamethoxam, Clothianidin, Nitenpyram, Dinotefuran) in different water matrices by differential pulse cathodic voltammetry. The limits of quantification in 4 different water matrices were in the range 0.76 to 2.10 mg L-1. Using a simple solid-phase extraction procedure, the matrix effects were substantially reduced and the limits of quantification were in the range 9.0 to 17 μg L-1, while the recoveries were in the range 89 to 109%. In the third part of this thesis, the application of bare screen-printed electrodes in the voltammetric determination of 4 azo-dyes (Ponceau-4R, Carmoisine, Sunset-Yellow, Tartrazine) in beverages was examined. The limits of detection were in the range 0.02 to 0.04 mg L-1 while the recoveries were in the range 95 to 109%. Finally, screen-printed electrodes modified with graphene/Nafion were fabricated for the determination of caffeine in food samples by anodic adsorptive stripping voltammetry. The limit of quantification was 0.06 μmol L-1, while the recoveries were in the range 101 to 106%. The proposed screen-printed sensors exhibit satisfactory sensitivity (especially when a preconcentration step is included), while their biggest drawback is their reduced selectivity, especially in samples with complex matrices. The electrodes are ideal for on-site assays and rapid screening of nitrophenols and neonicotinoid pesticides in water, for the determination of single food-colorants and caffeine in different beverages and drinks

favorece la infección por nosema ceranae y altera la expresión de genes involucrados en inmunidad humoral

Tesis (Magíster en Biotecnología)La disminución de la población de la abeja europea, Apis melífera, es un problema global. Numerosos factores aparecen como potenciales causas y se cree que una combinación de estos agentes contribuye con la pérdida de las abejas. Dentro de esos factores se encuentran la exposición no intencional de pesticidas contra plagas de la agricultura, siendo imidacloprid, un pesticida de la familia de los neonicotinoides, uno de los más tóxicos que se aplican en los cultivos agrícolas. Por otro lado, uno de los patógenos más importantes asociado a la desaparición de las abejas y presente en Chile es Nosema ceranae, un patógeno intracelular obligado formador de esporas que disminuye la vida media de las abejas. El objetivo del estudio fue evaluar in vitro, si existe un efecto sinérgico entre la exposición oral a imidacloprid y la infección con N. ceranae en A. mellifera, a través del registro de la sobrevida, el grado de infección y la expresión de genes relacionados con inmunidad individual humoral en abejas adultas. Se evaluó, a los 4 y 7 días post infección (dpi), el grado de infección de N. ceranae y los niveles de expresión de genes involucrados en la respuesta inmune (abaecina, defensina-2 e himenoptaecina), estos fueron medidos por análisis de qPCR, mientras que la sobrevida fue analizada diariamente. Para esto, abejas adultas fueron expuestas el tercer día de vida a una dosis subletal de 150 y 300 ppb de imidacloprid y a los dos días post exposición, se infectaron con 120.000 esporas de N. ceranae. Los resultados muestran que la sobrevida de las abejas expuestas a 150 ppb de imidacloprid e infectadas con N. ceranae, disminuyó en un 18% y 37% a los 4 y 7 dpi, mientras que, en abejas expuestas a 300 ppb e infectadas, la sobrevida disminuyó en un 60% y 85% a los 4 y 7 dpi. Junto con ello, se registró un aumento significativo en el grado de infección por N. ceranae en abejas expuestas a 150 ppb de imidacloprid, alcanzando las 180.000 y 300.000 esporas/abeja a los 4 y 7 dpi. Los niveles de expresión para los genes abaecina, defensina-2 e himenoptaecina, disminuyeron significativamente a los 4 dpi en abejas expuestas previamente al pesticida (150 ppb) e infectadas, esta inhibición se mantienes a los 7 dpi, al compararlo con el control de infección. Los resultados muestran que entre la exposición a dosis subletales de imidacloprid y la infección por N. ceranae, se genera un efecto sinérgico en la mortalidad de A. melífera. Lo anterior podría ser explicado porque tras la exposición al pesticida se produce una inhibición en la expresión de genes que codifican para síntesis de péptidos antimicrobianos, lo que favorecería el aumento en los niveles de infección por N. ceranae. Esto 7 puede ayudar a entender de mejor forma la potencial contribución de estos factores en el despoblamiento de las abejas.The decline of the European honey bee, Apis mellifera, is a global concern. Several factors appear as potential causes and it is believe that a combination of these factors contribute to honey bee loss. One of these factors is the unintentional exposure to pesticides, being imidacloprid one of the most toxic neonicotinoid pesticides, applied in agricultural crops. On the other hand, one of the most important pathogens associated with honey bee loss described in Chile is Nosema ceranae, an intracellular obligate spore-forming pathogen, which decrease the half-live of bees. The aim of this thesis was to evaluate in vitro the synergistic effect between sub-lethal oral exposition to imidacloprid and Nosema ceranae infections in A. mellifera, through the recording of survival, grade of infection and expression of genes related to individual humoral immunity in adult bees. At 4 and 7 days post infection the genes expression level related to immune response (abaecin, defensin-2 and hymenoptaecin) were quantified by q-PCR analysis, the level of N. ceranae infection was also assessed and survivorship was observed daily. For this, adults honey bees at 3 days post emergence (dpe) were exposed to imidacloprid 150 and 300 ppb and at 5 dpe were infected with 120,000 N. ceranae spores. The results show that the honey bees exposed to imidacloprid (150 ppb) and infected with N. ceranae, decreased in a 18% and 37% their survival at 4 and 7 dpi, while honey bees survival exposed to imidacloprid (300 ppb) and infected, decreased in a 60% and 85% at 4 and 7 dpi respectively. Along with it, a significant increase in the infection level was observed, reaching 180,000 and 300,000 spores/bee in honey bee exposed to imidacloprid 150 ppb at 4 and 7 dpi. The gene expression levels showed, a significant decrease for abaecin, defensin-2 and hymenoptaecin when honey bees were previously exposed to imidacloprid 150 ppb and inoculated, this inhibition is maintained at 7 dpi when compared to infection control. These findings demonstrate a synergistic effect between sub-lethal imidacloprid exposition and N. ceranae infection. This could be explained because after exposure to the pesticide there is an inhibition in the expression of genes coding for antimicrobial peptide synthesis, which would advantage the increase in N. ceranae infection levels. This could help better to understand the potential contribution of these factors to honey bee depopulation

Última generación de sistemas luminiscentes multiconmutados en flujo con aplicación en los campos agroalimentario y farmacológico

En esta Memoria se proponen una serie de mejoras científico-técnicas relativas al desarrollo y aplicación de sistemas automatizados en flujo para el análisis de moléculas de diferente índole en los campos farmacológico y agroalimentario, plasmadas en las nueve publicaciones científicas que se presentan, mostrando su versatilidad y aplicabilidad analítica. Se ha puesto especial hincapié en incrementar el nivel de automatización de los sensores en flujo descritos hasta la fecha, perfeccionando el uso de los sistemas multiconmutados en flujo en este tipo de sistemas analíticos. Se han empleado técnicas de detección luminiscentes, incidiendo especialmente en aquellas que han permitido un incremento en la selectividad y cuyo desarrollo hasta la fecha ha sido reducido, como es el caso de la Fluorescencia Inducida Fotoquímicamente. Igualmente, se han utilizado nanopartículas fluorescentes para poder llevar a cabo la determinación luminiscente de analitos que no presentan fluorescencia nativa.In this Report, several scientific/technical improvements concerning the development and the application of automated flow systems are proposed. The systems developed were applied to the analysis of molecules of different nature in the pharmacological and agri-food fields, showing its versatility and its analytical applicability. The research here described gave origin to nine scientific publications in scientific international journals. Special emphasis was placed on increasing the level of automation of the flow sensors described to date, particularly improving the potential of multicommutated flow injection analysis methods. The selection of luminescent detection techniques was performed by paying special attention to two aspects: a) increasing the selectivity of the analytical methods; b) the use of detection techniques that have been underused in flow systems, such as Photochemically Induced Fluorescence. Likewise, fluorescent nanoparticles have been used to carry out the luminescent determination of analytes that do not exhibit native fluorescence.Tesis Univ. Jaén. Departamento Química Física y Analítica. Leída el 26 de noviembre de 2018

モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法による食の安全・安心の確保

博士（家政学）京都女子大

Development of Immunoassay Based on Monoclonal Antibody Reacted with the Neonicotinoid Insecticides Clothianidin and Dinotefuran

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on a monoclonal antibody (MoAb) was developed for the neonicotinoid insecticide clothianidin. A new clothianidin hapten (3-[5-(3-methyl-2-nitroguanidinomethyl)-1,3-thiazol-2-ylthio] propionic acid) was synthesized and conjugated to keyhole limpet hemocyanin, and was used for monoclonal antibody preparation. The resulting MoAb CTN-16A3-13 was characterized by a direct competitive ELISA (dc-ELISA). The 50% of inhibition concentration value with clothianidin was 4.4 ng/mL, and the working range was 1.5–15 ng/mL. The antibody showed high cross-reactivity (64%) to dinotefuran among the structurally related neonicotinoid insecticides. The recovery examinations of clothianidin for cucumber, tomato and apple showed highly agreement with the spiked concentrations; the recovery rate was between 104% and 124% and the coefficient of variation value was between 1.8% and 15%. Although the recovery rate of the dc-ELISA was slightly higher than that of HPLC analysis, the difference was small enough to accept the dc-ELISA as a useful method for residue analysis of clothianidin in garden crops