Study of the influence of a DC electric field on the development of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A bioelectricidade pode influenciar a polarização de uma célula, responsável pela divisão assimétrica, pelo que tem um impacto significativo no desenvolvimento de tecidos ao contribuir para controlar a migração e orientação de células e também a proliferação, diferenciação e apoptose celulares. Estas propriedades da bioelectricidade em tecidos biológicos tornam-na numa ferramenta importante em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois permite controlar várias respostas fisiológicas a estímulos eléctricos e usá-las para fins benéficos. O nematóide Caenorhabditis elegans é um organismo primitivo, mas cuja fisiologia partilha várias características da biologia humana. Estas características, juntamente com a sua simplicidade de cultivar em grandes populações e de ser conveniente para análise e manipulação genética, tornam-no num dos organismosmodelo mais vastamente utilizados em investigação científica, existindo actualmente uma enorme quantidade de informação disponível sobre este nematóide. O embrião do C. elegans representa um modelo ideal para o estudo da divisão celular e da embriogénese, visto que o seu desenvolvimento é altamente reprodutível e facilmente observável. Além disso, o padrão de desenvolvimento do embrião é praticamente invariável, tornando possível construir um diagrama que representa toda a sua linhagem celular, o que facilita imensamente a análise da embriogénese. A motivação deste projecto surge do conhecimento de que vários seres vivos, como a hidra ou a salamandra, possuem uma grande capacidade de regeneração que está grandemente relacionada com a bioelectricidade. Compreender e controlar os seus mecanismos será certamente um grande avanço na área de engenharia de tecidos e terá como consequência o surgimento de diversas potenciais aplicações. Este projecto tem como objectivo aplicar a aplicação de um campo eléctrico DC num organismo vivo, de forma a induzir uma resposta por parte dele. Devido às suas características, o embrião do nematóide C. elegans foi escolhido como organismo modelo para a aplicação deste estímulo eléctrico. A principal assumpção é que o campo eléctrico aplicado ao longo do eixo antero-posterior do embrião do nematóide C. elegans, induza uma acumulação de carga oposta nas suas extremidades anterior e posterior com o intuito de alterar o potencial de membrana, onde se levantou a hipótese de poderem induzir respostas celulares diferentes em cada extremidade, causando alterações na embriogénese. A ideia surge de uma analogia à aplicação de um gradiente de temperatura ao longo desse mesmo eixo, sabendo-se actualmente que induz uma resposta relativamente à duração de ciclos celulares, visto que é fortemente dependente da temperatura. Através dos resultados, pretende-se também avaliar a utilidade deste embrião como um organismo-modelo para o estudo do impacto de campos eléctricos DC em tecido vivo, visto que outros embriões, como de anfíbios ou pintos, apresentam grandes distúrbios no seu desenvolvimento quando estimulados com campos eléctricos contínuos, com consequências catastróficas no organismo final. A tecnologia dos micro-sistemas permite controlar eficazmente o ambiente celular de uma forma bastante precisa. Assim, um sistema microfluídico é usado como plataforma para estudar o impacto da aplicação do campo eléctrico ao embrião. Este é colocado no interior de um microcanal contendo PBS (tampão fosfato-salino), um bom electrólito e ao mesmo tempo biocompatível para o seu desenvolvimento. Recorrendo a eléctrodos de platina, é aplicada uma diferença de potencial nas extremidades do canal, o que torna possível a existência de uma corrente eléctrica que deverá resultar numa acumulação de carga oposta nas extremidades do embrião, visto que a sua resistividade deverá ser superior à do PBS. A largura e altura do canal são semelhantes à espessura do embrião, o que garante que o campo eléctrico passa através do embrião ou que seja desviado por ele, no caso de este ser isolante. Tendo em conta que o campo eléctrico propaga-se através do canal em direcção ao embrião, é necessário saber qual a sua magnitude à volta dele. Além disso, interacções físicas como o efeito de Joule e reacções redox entre os eléctrodos e o electrólito podem alterar a temperatura e o pH no interior do canal e comprometer o desenvolvimento do embrião de forma indesejada. Assim é também efectuada uma caracterização física detalhada do sistema microfluídico, com o intuíto de saber quais os principais fenómenos físicos que podem ocorrer no interior do canal durante a aplicação do campo eléctrico. Esta caracterização permite tomar as medidas necessárias para minimizar estes efeitos secundários que possam perturbar o normal desenvolvimento do embrião. A caracterização física do sistema consiste essencialmente numa análise das interacções dos eléctrodos de platina com uma solução de cloreto de sódio, o principal constituinte do PBS e em determinar a relação entre a corrente eléctrica no canal e a diferença de potencial aplicada. Para isso são efectuadas medições experimentais e simulações recorrendo ao software de elementos finitos COMSOL Multiphysics. O procedimento experimental para a análise do impacto do campo eléctrico no embrião começa com a recolha de um embrião de um nematóide hermafrodita adulto, proveniente de uma cultura em pratos de agarose semeados com Escherichia coli como fonte de alimento. O embrião escolhido deve estar no início do desenvolvimento, de preferência após a meiose, de forma a poder ser estimulado o mais cedo possível. Sabese que perturbar os eventos iniciais da embriogénese pode ter consequências em todo o restante desenvolvimento, visto que este depende grandemente das primeiras divisões celulares. Recolhido o embrião, este é inserido no microcanal, onde é fixado e permanece durante todo o ensaio experimental. De seguida, o campo eléctrico é aplicado através da aplicação de uma diferença de potencial nos eléctrodos em contacto com as extremidades do canal. Pontes salinas de agarose são utilizadas em algumas experiencias para evitar a contaminação do electrólito com produtos das reacções químicas que ocorrem na superfície dos eléctrodos. O desenvolvimento do embrião é observado através de microscópios invertidos equipados com contraste de fase. Imagens de time-lapse são capturadas e posteriormente analisadas recorrendo ao software ImageJ. Eventos da embriogénese seleccionados para análise são comparados para embriões em experiencias de controlo e embriões estimulados com o campo eléctrico. Métodos de análise estatística são efectuados para auxiliar a comparação. Parâmetros a observar e comparar são os tempos de ocorrência dos eventos seleccionados e orientação e posição de células no embrião. O comportamento da minhoca juvenil após o nascimento também pode fornecer informação relativamente à embriogénese, pelo que também é analisado. A caracterização do chip revelou que uma tensão de 5V é apropriada para criar um campo eléctrico com dimensões fisiológicas (cerca de 0.3mV/μm), não aumentando a temperatura para valores fora dos limites de desenvolvimento normal do embrião. Alterações do pH foram minimizadas através da utilização das pontes salinas inseridas nas entradas do canal. A comparação entre embriões de controlo e embriões estimulados revela que não existem grandes diferenças entre os eventos da embriogénese de embriões de controlo e embriões estimulados pelo campo eléctrico, o que sugere que o embrião resiste ao campo eléctrico, talvez devido à barreira de permeabilidade presente na sua carapaça. Pequenas diferenças nos tempos embriológicos entre embriões de controlo e estimulados sugerem que o campo eléctrico possa ter efeitos a longo prazo na embriogénese, retardando os seus eventos mais tardios. As diferenças são demasiado pequenas para se poder tirar alguma conclusão, contudo, os resultados sugerem que deveria ser feita uma análise mais detalhada ao ciclo celular de certas células do início da embriogénese, o que não foi possível com o equipamento disponível. Comparando estes resultados com os de outros estudos com embriões, como por exemplo em anfíbios ou pintos, conclui-se que o impacto do um campo eléctrico DC no desenvolvimento do embrião do nematóide C. elegans não é tão significativo como nesses modelos, o que os torna preferíveis para estudos com embriões intactos. No entanto, existe ainda a possibilidade de estudos a nível de células isoladas extraídas do embrião e também não é de descartar a hipótese de aplicar um campo eléctrico AC ou de tentar remover a carapaça do embrião em futuras investigações.Bioelectricity has an impact on the development of tissues because it can influence cell polarization, essential for asymmetric cell division. This feature may be an important tool for tissue engineering and regenerative medicine applications. The nematode Caenorhabditis elegans is a primitive organism, but whose physiology shares several characteristics of human biology. Its embryo is an ideal model for the study of cell division and embryogenesis, since its development is almost invariant and highly reproducible and readily observable. This project has the objective of studying the impact of a DC electric field in the C. elegans embryo development and to assert if this organism is a good model for further research in this field. To accomplish it, a DC electric field is applied in a microchannel filled with PBS, where to the embryo is confined. Embryogenesis is studied by analysing selected development stages, which are compared for control and electric field experiments. To optimize the application of the electric field to the embryo and minimize other physical phenomena which can disturb embryogenesis, a detailed physical characterization of the microfluidic system is also performed. The results show that there are no big differences in the events of embryogenesis, suggesting that the embryo resists to the electrode field, perhaps due its eggshell. Nevertheless, small differences in embryological times suggest that the electric field can have long term effects on embryogenesis, and that a more detailed analysis should be performed. In summary, the embryo nematode C. elegans is not as suited to study the impact of DC electric fields in embryogenesis as other embryo models, such as amphibians. However, there is still the possibility of studies of single isolated embryo cells. Besides, it is not discarded the possibility of applying an AC electric field or attempting to remove the eggshell in future studies

The Evolution of Cleavage in Metazoans

Cleavage is the earliest developmental stage. During this stage, the fertilized oocyte gives rise to a cluster of smaller cells (blastomeres) with a particular spatial pattern (a cleavage pattern). Different metazoan species have different cleavage patterns, but most of them fit into a small set of basic types.Peer reviewe

Lab-on-a-chip technologies for manipulation and imaging of C. elegans worms and embryos

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism, owing notably to its short life cycle, genetic tractability, and optical transparency facilitating microscopic observation. This thesis deals with the realization of technological tools for the manipulation of worms and for studying thereby biologically relevant questions. The novel microfluidic devices that were developed are: #1 A microfluidic approach for size-dependent sorting of C. elegans nematodes on-chip. We take advantage of the external pressure-deformable profile of polydimethylsiloxane (PDMS) transfer channels that connect two on-chip worm chambers. The pressure-controlled effective cross-section of these channels creates adjustable filter structures that can be easily tuned for a specific worm sorting experiment, without changing the design parameters of the device itself. Considering that our sorting device is merely based on geometrical parameters and operated by simple fluidic and pressure control, we believe that it has strong potential for further use in advanced, automated, microfluidic C. elegans-based assay platforms. #2 A microfluidic device for studying signaling via diffusive secreted compounds between two specific C. elegans populations over prolonged durations. In particular, we designed a microfluidic assay to investigate the biological process of male-induced demise, i.e. lifespan shortening, in C. elegans hermaphrodites in the presence of a physically separated male population. For this purpose, male and hermaphrodite worm populations were confined in adjacent microchambers on the chip, whereas molecules secreted by males could be exchanged between both populations by periodically activating controlled fluidic transfer of ÎŒl-volume aliquots of male-conditioned medium. For male-conditioned hermaphrodites, we observe a reduction in mean lifespan of 4 days compared to non-conditioned on-chip culture. #3 Development of two reversible C. elegans immobilization methods for imaging applications. The first immobilization method takes advantage of a biocompatible and temperature-responsive hydrogel-microbead matrix. Our gel-based immobilization technique does not require a specific chip design and enables fast and reversible immobilization, thereby allowing successive imaging of the same single worm or of small worm populations at all development stages for several days. The second immobilization method takes advantage of the elastic properties of PDMS. We present two distinct microdevices, namely a micropillar array and a serpentine microchannel, for on-chip feeding and high-resolution imaging studies, respectively. Both devices consist of size-tunable PDMS structures that allow the same chips to be used for immobilization of worms at all development stages. Our microfluidic approach provides appropriate physiological conditions for long-term studies and enables worm recovery after the experiment. #4 A fully integrated microfluidic approach for the exploration of C. elegans early embryogenesis including the possibility of testing small-molecule inhibitors with increased throughput and versatility. Here, up to 100 embryos can be immobilized in parallel for simultaneous high-resolution time-lapse imaging of embryonic development from the 1-cell stage to hatching. We demonstrate time-controlled and reversible drug delivery to on-chip immobilized embryos, which is of relevance for biochemical and pharmacological assays

Development of a Caenorhabditis elegans model for the assessment of toxicity and its application in testing novel anthelmintics.

The nematode Caenorhabditis elegans is an alternative model used in biomedical research for the investigation of descriptive and mechanistic toxicity assessment of chemicals. There are considerable differences in published data, especially in terms of reproducibility and validation of toxicity endpoints, and the techniques used in the investigation of these endpoints. This thesis describes the evaluation of toxicological endpoints following the exposure of C. elegans to chemicals which include; zinc oxide nanoparticles (ZnONP), Diethylstilbestrol (DES) and derivatized target-specific anthelmintics.The results suggest that ZnONP prepared in anionic and cationic dispersants (AZNP and CZNP respectively) were the most toxic against the nematode resulting in the ‘bag of worms’ (BOW) phenotype which can be exploited as a marker for reproductive toxicity. Also, worms treated with ZnONP prepared in 0.1% FBS (FZNP), molecular grade water (WZNP) or E. coli OP50 supernatant (SZNP) presented three-fold embryo elongation showing fully differentiated tissues encapsulated within the eggshell and still within the hermaphrodite gravid adult. The phenotype has been named accelerated embryonic development (AED) and could be used as a developmental toxicity endpoint. The results suggest that the AED endpoint is the most sensitive while lethality endpoint appears to be the least sensitive despite its extensive use in the literature. Also, microRNA microarray expression appears to be the most sensitive molecular endpoint while behavioural endpoints such as speed should be interpreted with caution, especially when performed manually. Importantly, good C. elegans culture practice (GCeCP) is required for reproducible chemical toxicity assessment and different endpoints may be required for different types of toxicity assessment.Additionally, the thesis describes a second but related study which explores a potential for enhanced anthelmintic targeting. Novel fluorophore-based asparagine-containing oligopeptide substrate probes were used to target the helminth protease, legumain. These probes were selectively cleaved by legumain in C. elegans, Haemonchus contortus and Teladorsagia circumcincta. The protease-specific probes could potentially be exploited to achieve protease-mediated prodrug activation and drug delivery

Parasitic nematode ion channels: improving understanding of pharmacology and genetic composition

Parasitic nematode infections of humans, plants and animals are of major economic impact. These parasites cause losses of billions of dollars per year in crop damage and through livestock infection; the infections to humans are equally debilitating. Anthelmintics are the main chemotherapeutic agents used for treatment and prophylaxis of nematode infections because there is presently no effective vaccine on the market. Most of the anthelmintics presently used in treating nematode infections in humans were first developed for use in animals. In most cases, these anthelmintics have been used in humans without changing the properties of the drugs at all. However, resistance has been reported to the mainstay anthelmintics, namely AChR agonists (levamisole, pyrantel), benzimidazoles (albendazole) and macrocyclic lactones (ivermectin). There is therefore the urgent need to understand the genetics of the receptors targeted by these anthelmintics and the mechanisms of resistance, with the view to improving efficacy of the presently used drugs. In addition, there is the need to find alternative targets for developing new anthelmintics as well as fully studying the mechanism of action of any new anthelmintic. We have demonstrated the effects of the new novel-acting cyclooctadepsipeptide anthelmintic, emodepside, on the membrane potential and voltage-activated currents in the pig parasite Ascaris suum. Emodepside hyperpolarized the membrane in a slow, time-dependent manner without changing the input conductance. We show that the purported emodepside target receptors in C. elegans, SLO-1 and LAT-1 are expressed in the muscle flap of A. suum (Asu-slo-1 and Asu-lat-1). Emodepside potentiated the voltage-activated Ca2+-dependent K+ channel currents in a time- and voltage-dependent manner. We have demonstrated that emodepside effect on the K+ channel currents is inhibited by iberiotoxin, a selective SLO-1 channel inhibitor. The effects of emodepside on the membrane potential and K+ channel currents were modulated by NO and protein kinase activators/inhibitors. Last but not least, we demonstrate that diethylcarbamazine (DEC), a filarial anthelmintic, potentiates the effects of emodepside on the membrane potential and SLO-1-like currents. Our results clearly demonstrate effects of emodepside in a parasitic nematode and the modulation of emodepside effects by second messengers like protein kinases. We also show that a formulation of emodepside and DEC could be used for treating filarial parasites, slowing the development of resistance to emodepside. Finally, we show the cloning of four acetylcholine receptor subunit genes from another pig parasite, Oesophagostomum dentatum and the expression and characterization of these receptor subunits in Xenopus laevis oocytes. By employing the three ancillary factors of Haemonchus contortus, Hc-ric-3.1, Hc-unc-50 and Hc-unc-74, we have characterized four levamisole receptor subtypes of O. dentatum with different pharmacological properties. First, the receptor subtype we have termed Pyr-nAChR, was composed of Ode-unc-29 and Ode-unc-63 and responded to pyrantel as the most potent agonist. The second receptor subtype, Pyr/Tbd-nAChR, responded to pyrantel and tribendimidine as the most potent agonists and was composed of Ode-unc-29, Ode-unc-63 and Ode-unc-38. The third receptor subtype, nAChR, responded to ACh as the most potent agonist and was composed of Ode-unc-29, Ode-unc-63 and Ode-acr-8. The last receptor subtype, Lev-nAChR, responded to levamisole as the most potent agonist and was composed of Ode-unc-29, Ode-unc-63, Ode-acr-8 and Ode-unc-38. In the Lev-nAChR, derquantel distinguished receptor subtypes with pA2 values of 6.8 and 8.4 for levamisole and pyrantel, respectively. The calcium permeability (PCa/PNa) of three receptor subtypes differed. We measured PCa/PNa of 10.3, 0.38 and 0.38 for the Lev-nAChR, Pyr/Tbd-nAChR and nAChR subtypes, respectively. Unlike the receptors in Caenorhabditis elegans and Haemonchus contortus, all three ancillary factors were not absolutely required to reconstitute O. dentatum functional levamisole receptors. We reconstituted receptors with robust responses to the agonists when we sequentially removed these ancillary factors. However, removal of all three factors did not reconstitute any receptors, demonstrating the need for at least one of these ancillary factors. Our results demonstrate the plasticity in the levamisole receptors of O. dentatum and suggest that the subtypes may have different physiological roles and/or expressed in different tissues of the parasite

What determines cell size?

AbstractFirst paragraph (this article has no abstract) For well over 100 years, cell biologists have been wondering what determines the size of cells. In modern times, we know all of the molecules that control the cell cycle and cell division, but we still do not understand how cell size is determined. To check whether modern cell biology has made any inroads on this age-old question, BMC Biology asked several heavyweights in the field to tell us how they think cell size is controlled, drawing on a range of different cell types. The essays in this collection address two related questions - why does cell size matter, and how do cells control it