Chemical inhibition of β-glucocerebrosidase does not affect phagocytosis and early containment of Leishmania by murine macrophages

Gaucher disease is a lysosomal storage disease in which a genetic deficiency in β-glucocerebrosidase leads to the accumulation of glycosphingolipids in lysosomes. Macrophages are amongst the cells most severely affected in Gaucher disease patients. One phenotype associated with Gaucher macrophages is the impaired capacity to fight bacterial infections. Here, we investigate whether inhibition of β-glucocerebrosidase activity affects the capacity of macrophages to phagocytose and act on the early containment of human pathogens of the genus Leishmania. Towards our aim, we performed in vitro infection assays on macrophages derived from the bone marrow of C57BL/6 mice. To mimic Gaucher disease, macrophages were incubated with the β-glucocerebrosidase inhibitor, conduritol B epoxide (CBE), prior to contact with Leishmania. This treatment guaranteed that β-glucocerebrosidase was fully inhibited during the contact of macrophages with Leishmania, its enzymatic activity being progressively recovered along the 48 h that followed removal of the inhibitor. Infections were performed with L. amazonensis, L. infantum, or L. major, so as to explore potential species-specific responses in the context of β-glucocerebrosidase inactivation. Parameters of infection, recorded immediately after phagocytosis, as well as 24 and 48 h later, revealed no noticeable differences in the infection parameters of CBE-treated macrophages relative to non-treated controls. We conclude that blocking β-glucocerebrosidase activity during contact with Leishmania does not interfere with the phagocytic capacity of macrophages and the early onset of leishmanicidal responses.publishe

Microscopic Image Segmentation to Quantification of Leishmania Infection in Macrophages

The determination of infection rate parameter from in vitro macrophages infected by Leishmania amastigotes is fundamental in the study of vaccine candidates and new drugs for the treatment of leishmaniasis. The conventional method that consists in the amastigotes count inside macrophages, normally is done by a trained microscope technician, which is liable to misinterpretation and sampling. The objective of this work is to develop a method for the segmentation of images to enable the automatic calculation of the infection rate by amastigotes. Segmentation is based on mathematical morphology in the context of a computer vision system. The results obtained by computer vision system presents a 95% accuracy in comparison to the conventional method. Therefore, the proposed method can contribute to the speed and accuracy of analysis of infection rate, minimizing errors from the traditional methods, especially in situations where exhaustive repetitions of the procedure are required from the technician.A determinação de parâmetros como taxa de infecção em monocultura de macrófagos cultivados in vitro com Leishmania é fundamental no estudo de candidatos vacinais e novos fármacos para o tratamento de leishmanioses. O método convencional que consiste na contagem de amastigotas no interior de macrófagos, normalmente é realizada por um especialista treinado em microscopia óptica, o que está sujeito a erros de interpretação e amostragem. O objetivo do trabalho é desenvolver um método para a segmentação de imagens como etapa preliminar para o cálculo automático da taxa de infecção por amastigotas. A segmentação é baseada em morfologia matemática no contexto de um sistema de visão computacional. Os resultados obtidos pelo método computacional demonstraram acerto de 95% quando comparados ao método convencional. Conclui-se que a metodologia computacional baseada na segmentação de imagem como pré-requisito para o cálculo de taxa de infecção, pode contribuir para a rapidez e a precisão na obtenção dos resultados e na minimização de erros cometidos no método tradicional, especialmente em situações em que exaustivas repetições do procedimento são exigidas ao observador

Automatic annotation of cellular data

Life scientists often need to count cells in microscopy images, which is very tedious and a time consuming task. Henceforth, automatic approaches can be a solution to this problem. Several works have been devised for this issue, but the majority of these approaches degrade their performance in case of cell overlapping. In this dissertation we propose a method to determine the position of macrophages and parasites in uorescence images of Leishmania-infected macrophages. The proposed strategy is mainly based on blob detection, clustering and separation using concave regions of the cells' contour. By carrying out a comparison with other approaches that also addressed this type of images, we concluded that the proposed methodology achieves better performance in the automatic annotation of Leishmania infections.A anotação de células é uma tarefa comum a diversas áreas da investigação biomédica. Normalmente, esta tarefa é realizada de forma manual, sendo um processo demorado, cansativo e propício a erros. Neste trabalho, focamos o nosso interesse na anotação de imagens de uorescência com infeções de Leishmania, que representa um destes casos. Leishmania são parasitas unicelulares que infectam mamíferos, sendo responsáveis por um conjunto de doenças conhecidas por leishmanioses. Leishmania usam vertebrados como hospedeiros residindo dentro dos seus macrófagos. Por conseguinte, um modelo adequado para o estudo destes parasitas é infectar in vitro culturas de macrófagos. A capacidade de sobrevivência/replicação da Leishmania nessas condições arti - ciais pode então ser avaliada por parâmetros, como, por exemplo, a percentagem de macrófagos infectados, o número médio de parasitas por macrófagos infectados e o índice de infeção. Essas métricas são geralmente determinadas pela contagem de parasitas e macrófagos ao microscópio. Ambos os tipos de células podem ser facilmente distinguidos com base no seu tamanho e cor, resultante de diferentes a nidades de corantes uorescentes. A passagem desta tarefa do microscópio para o computador já foi conseguida através de aplicações como o CellNote, contudo, apesar de mais fácil e interativa, a anotação continua a ser manual. A evolução da abordagem manual para um processo automático representa um passo natural e lógico, constituindo o principal objetivo deste trabalho. Para isto iniciámos a investigação pela revisão dos principais métodos de deteção e contagem celular. As características das imagens com infeções de Leishmania impossibilitam a utilização dos métodos estudados, de tal modo que optámos por desenvolver uma nova abordagem, capaz de lidar com as várias especi cidades destas imagens. Também durante o processo de revis ão de literatura analisámos os dois métodos previamente propostos para realizar a anotação automática de infeções de Leishmania. Estes revelaram um desempenho abaixo do requerido pelos parasitologistas, justi cando também o desenvolvimento de uma nova abordagem. Durante a concepção do sistema investigámos diversas técnicas de deteção celular, onde a deteção de blobs se destacou pelos resultados positivos. Para segmentar as regiões citoplasmáticas optámos pela utilização de algoritmos de clustering. Estes não foram capazes de solucionar casos em que existia sobreposição de estruturas celulares, motivando assim o método de separação desenvolvido. Este método baseia-se maioritariamente na análise de contorno, sendo as suas concavidades geradoras de separação entre citoplasmas. Através da combinação destas fases foi possível detetar macrófagos e parasitas com mais precisão. Para con rmar esta conclusão testámos não só a nossa abordagem mas também as duas abordagens previamente desenvolvidas para este problema. Os desempenhos alcançados evidenciam não só uma melhoria comparativamente às restantes abordagens como também mostram que a nossa abordagem assegura resultados satisfatórios comparativamente aos obtidos manualmente. Em suma, o trabalho desenvolvido produziu um sistema capaz de realizar a anotação automática de imagens de uorescência com infeções de Leishmania, tendo originado um artigo aceite para publicação na conferência International Conference on Image Analysis and Recognition (ICIAR) 2013

Analysis and parametrisation of an IBM of a Leishmania infantum in vitro culture

Leishmaniasis is a vector borne protozoan parasitic disease with the ninth highest burden amongst infectious diseases. There is a pressing need for the development of novel, improved drugs for its treatment. Currently, the knowledge of the mechanisms of action of the parasite and the drugs that treat it is still limited. As a consequence, drug research begins with in vitro screening. This makes an increase in the understanding of Leishmania infected macrophage cultures necessary for the improvement of drug screening methods. Aim: The purpose of this work is to parametrise an individual based model (IBM) of a Leishmania infantum and murine cell line RAW 264.7 in vitro culture. This process consists of the comparison of experimental results and the simulation outcome of the IBM. It is a necessary process in order to adjust the parameters of the model so that it gives the closest representation of the real system. On the one hand, this serves to shed light on the behaviour of this particular culture. On the other hand, the work proposes a mathematical methodology for parametrisation that is extensible to other cultures (different strains, cell lines, parasite species and medium composition). Experimental methods: The experimental design used to obtain the experimental data for the parametrisation of the model is described. The percentage of infected macrophages and the number of parasites per cell was determined at several time-points after infection. Parametrisation: The mathematical methodology for parametrisation is described and applied to this particular model. A preliminary analysis of the model was carried out in order to determine, for each parameter, the interval of values where simulation outcome and experimental results were most similar. The combination of these intervals, the parameter space, was then sampled using the Latin Hypercube Sampling (LHS) technique. Finally, the sampled combinations were implemented in the model and the outcome analysed. Results: On the one hand, a mathematical methodology for the parametrisation process was developed, extensible to different cultures. One the other hand, the combination that best reproduces the experimental results was determined. Conclusion: The development of the IBM has the potential to increase our understanding of the system and, therefore, lead to a more accurate approach in understanding and evaluating drug assays. However, the model still requires further expansion. In spite of the satisfactory results, there are still some improvements to be made to the parametrisation methodology.La leishmaniosi és una malaltia parasitària provocada per un protozou transmès per un vector. La seva incidència la situa com la novena malaltia infecciosa a nivell mundial. La necessitat de desenvolupar fàrmacs nous i millors és imperiosa. Actualment, encara, els coneixements sobre el mecanisme d'acció del paràsit i dels fàrmacs són limitats. Com a conseqüència, la recerca de nous fàrmacs s'inicia amb assajos in vitro. Això fa imprescindible per a la millora dels mètodes de triatge de fàrmacs una millor comprensió dels cultius de macròfags infectats per Leishmania. Objectiu: El propòsit d'aquest treball és parametritzar un model basat en l'individu (IBM) del cultiu in vitro de Leishmania infantum i la línia cel·lular murina RAW 264.7. Aquest procés implica la comparació de resultats experimentals amb les sortides del simulador i és necessari per a ajustar els paràmetres del model de manera que aquest representi amb màxima fidelitat el sistema real. Per una banda, serveix per a incrementar la comprensió del comportament d'aquest cultiu en particular. Per altra banda, el treball proposa una metodologia matemàtica per a la parametrització que pretén ser extensible a altres cultius (diferents soques, línies cel·lulars, espècies i composicions del medi). Mètode experimental: Es descriu el mètode experimental emprat per a obtenir les dades utilitzades per a la parametrització. Es determinen a diferents instants de temps el percentatge de macròfags infectats i el nombre de paràsits per cèl·lula. Parametrització: Es desenvolupa una metodologia matemàtica per a la parametrització i s'aplica a aquest model en particular. Un anàlisi preliminar permet establir en quins rangs de valors dels paràmetres la sortida del simulador s'assembla més a les dades experimentals. El conjunt d'aquests intervals, l'espai de paràmetres, és mostrejat amb la tècnica Latin Hypercube Sampling (LHS). Finalment, les combinacions de paràmetres mostrejades són implementades en el model i s'analitza el resultat. Resultats: Per una banda, s'ha desenvolupat una metodologia matemàtica per al procés de parametrització que és extensible a diferents cultius. Per altra banda, s'ha determinat la combinació de paràmetres mostrejats que millor reprodueix els resultats experimentals. Conclusions: El desenvolupament d'una metodologia per parametritzar models basats en l'individu té el potencial d'incrementar la nostra comprensió del sistema i, per tant, portarà a un enfocament més apropiat per a la comprensió i avaluació dels assajos de fàrmacs. Malgrat els bons resultats es constata que es poden realitzar, encara, algunes millores en la metodologia de parametrització.La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria provocada por un protozoo transmitido por un vector. Su incidencia la sitúa como la novena enfermedad infecciosa a nivel mundial. La necesidad de desarrollar fármacos nuevos y mejores es imperante. Actualmente, los conocimientos sobre el mecanismo de acción del parásito y los fármacos son aún limitados. Como consecuencia, la investigación de nuevos fármacos empieza con ensayos in vitro. Es necesaria para la mejora de los métodos de elección de fármacos una mejor comprensión de los cultivos de macrófagos infectados por Leishmania. Objetivo: El propósito de este trabajo es parametrizar un modelo basa en el individuo (IBM) del cultivo in vitro de Leishmania infantum y la línea celular murina RAW 264.7. Este proceso implica la comparación de resultados experimentales con las salidas del simulador y es necesario para ajustar los parámetros del modelo de manera que este represente con máxima fidelidad el sistema real. Por un lado, sirve para incrementar la compresión del comportamiento de este cultivo en particular. Por otro lado, el trabajo propone una metodología matemática para la parametrización que pretende ser extensible a otros cultivos (diferentes cepas, líneas celulares, especies y composiciones del medio). Método experimental: Se describe el método experimental utilizado para obtener los datos usados para la parametrización. Se determinan a diferentes instantes de tiempo el porcentaje de macrófagos infectados y el número de parásitos por célula. Parametrización: Se desarrolla una metodología matemática para la parametrización y se aplica a este modelo en particular. Un análisis preliminar permite establecer en qué rangos de los valores de los parámetros la salida del simulador es más parecida a los datos experimentales. El conjunto de estos intervalos, el espacio de parámetros, se muestrea con la técnica Latin Hypercube Sampling (LHS). Finalmente, las combinaciones de parámetros muestreados son implementados en el modelo y su resultado es analizado. Resultados: Por un lado, se ha desarrollado una metodología matemática para el proceso de parametrización que es extensible a diferentes cultivos. Por otro lado, se ha determinado la combinación de parámetros muestreados que mejor reproduce los resultados experimentales. Conclusiones: El desarrollo de un IBM tiene el potencial de incrementar nuestra comprensión del sistema y, por tanto, llevará a un enfoque más apropiado para la comprensión y evaluación de los ensayos de fármacos. Sin embargo, el modelo requiere expansión. A pesar de los buenos resultados, se constata que se pueden realizar mejoras en la metodología de parametrización

Síntesis, evaluación biofísica y biológica de derivados de N-fenilbenzamida dirigidos al ADN mitocondrial de parásitos cinetoplástidos

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Farmacia, leída el 15-07-2022Kinetoplastid parasites are responsible for three most common and neglected vector-bornehuman diseases, which are the focus of this Thesis: leishmaniasis, which is caused byLeishmania spp., human African trypanosomiasis caused by Trypanosoma brucei spp., andChagas disease caused by Trypanosoma cruzi. All of them display high morbidity and mortalityrates mainly in developing countries.Kinetoplastid parasites are characterised by the presence of a disk-shaped mitochondrial DNA,named as “kinetoplast DNA” (kDNA), comprising > 70% AT base pairs. Kinetoplastid cellshapes change during the complex differentiation processes that occur in their life cycles. Thesedifferentiations are key to the successful transfer of the parasite between vector and host, andvice versa.Despite the social and economic burden of kinetoplastid diseases, the chemotherapeutic arsenalto treat them remains underdeveloped. Hence, there is an urgent need for new safeantitrypanosomal and leishmanicidal treatments...Los parásitos cinetoplástidos son responsables de las tres enfermedades humanas desatendidas que son transmitidas por vectores, y que son el centro de esta Tesis: la leishmaniasis, que es causada por Leishmania spp., la tripanosomiasis africana humana causada por Trypano somabrucei spp., y la enfermedad de Chagas causada por Trypanosoma cruzi. Todos ellos presentanaltas tasas de morbilidad y mortalidad principalmente en países en vías de desarrollo.Los parásitos cinetoplastídicos se caracterizan por la presencia de un ADN mitocondrial enforma de disco, denominado “ADN cinetoplasto” (ADNc), que comprende > 70 % de pares debases AT. Las formas de las células de los cinetoplastos cambian durante los complejosprocesos de diferenciación que ocurren en sus ciclos de vida. Estas diferenciaciones son clavepara la transferencia exitosa del parásito entre el vector y el huésped, y viceversa.A pesar de la carga social y económica de las enfermedades cinetoplástidas, el arsenalquimioterapéutico para tratarlas sigue estando poco desarrollado. Por lo tanto, existe unanecesidad urgente de nuevos tratamientos antitripanosómicos y leishmanicidas que ofrezcanseguridad y eficacia...Fac. de FarmaciaTRUEunpu

In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation.

Regulatory T cells (Tregs) have been shown to be critical in the balance between autoimmunity and tolerance and have been implicated in several human autoimmune diseases. However, the small number of Tregs in peripheral blood limits their therapeutic potential. Therefore, we developed a protocol that would allow for the expansion of Tregs while retaining their suppressive activity. We isolated CD4+CD25 hi cells from human peripheral blood and expanded them in vitro in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 magnetic Xcyte Dynabeads and high concentrations of exogenous Interleukin (IL)-2. Tregs were effectively expanded up to 200-fold while maintaining surface expression of CD25 and other markers of Tregs: CD62L, HLA-DR, CCR6, and FOXP3. The expanded Tregs suppressed proliferation and cytokine secretion of responder PBMCs in co-cultures stimulated with anti-CD3 or alloantigen. Treg expansion is a critical first step before consideration of Tregs as a therapeutic intervention in patients with autoimmune or graft-versus-host disease

Galectin-3. One molecule for an alphabet of diseases, from A to Z

Galectin-3 (Gal-3) regulates basic cellular functions such as cell–cell and cell–matrix interactions, growth, proliferation, differentiation, and inflammation. It is not surprising, therefore, that this protein is involved in the pathogenesis of many relevant human diseases, including cancer, fibrosis, chronic inflammation and scarring affecting many different tissues. The papers published in the literature have progressively increased in number during the last decades, testifying the great interest given to this protein by numerous researchers involved in many different clinical contexts. Considering the crucial role exerted by Gal-3 in many different clinical conditions, Gal-3 is emerging as a new diagnostic, prognostic biomarker and as a new promising therapeutic target. The current review aims to extensively examine the studies published so far on the role of Gal-3 in all the clinical conditions and diseases, listed in alphabetical order, where it was analyzed

Marine algae extracts as source of natural antileishmanial compounds

This thesis aimed to identify Cystoseira macroalgae compounds displaying antileishmanial activity. Concerning the need to ensure the identification of the samples used for the drug screening, a second aim was determined to evaluate the usefulness of mitochondrial markers for identification of Cystoseira. A comprehensive review showed that marine algae, and in particular Cystoseira, are important sources of bioactive compounds, which can be used as antiparasitic agents (Chapter I and II). This work revealed that these algae contains compounds with antileishmanial activity. Forty five extracts from 15 species was submitted to bio-guided fractionation and its activity against L. infantum promastigotes and their cytotoxicity evaluated. Among the studied algae, Cystoseira extracts (C. baccata, C. barbata, C. nodicaulis and C. tamariscifolia) displayed the most interesting activities against this parasite (Chapter III). C. baccata baccatabaccata hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was hexane extract was further investigated, to the isolation of two active active active active active meroterpenoids meroterpenoids meroterpenoids meroterpenoids : the the (3R)- and (3S)-tetraprenyltoluquinone with an unknown structure, and the (3R)- and (3S)-tetraprenyltoluquinol previously isolated and active against Leishmania intracellular amastigote forms. Promastigote ultrastructural alterations, DNA fragmentation and mitochondrial potential variations suggest that the mechanism of action of these compounds interfere with the mitochondrial metabolism (Chapters IV). Moreover, the investigation of the chemical composition of the Cystoseira crude extracts showed that these algae contain fatty acids, triacylglycerols, carotenoids, steroids and meroterpenoids (Chapter III). This characterization complement published data, suggesting that these compounds might also be involved in the antileishmanial activity here unravelled (Chapter II). Concerning the identification of Cystoseira, samples from twenty-two Cystoseira species were analysed generating 135 new sequences of three mitochondrial regions (COI, 23S and mt-spacer). This work demonstrated that these three markers are suitable to distinguish these species. The results allowed for the correct identification of Cystoseira samples used for drug screening, encouraging the study of taxonomy and evolutionary elucidation of these brown algae using genetic tools (Chapter V)