Die Funktion von Munc-18 in der Exozytose sekretorischer Granulen

Die Calcium-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter aus sekretorischen Organellen wird durch eine Reihe konservierter Proteinfamilien präzise reguliert. Hierzu zählen u.a. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor ), Rab-GTPasen und SM-Proteine. SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE-Proteine können sich spontan und irreversibel zu einem Vier-Helix-Bündel („core complex“) zusammenlagern. Die Komplexbildung zwischen SNAREs auf Vesikelmembran und Plasmamembran führt zu einer Verkürzung der Proteine. Hierdurch werden die Membranen einander angenähert, was die Voraussetzung für die Membranfusion darstellt. Die funktionelle Bedeutung von SNARE-Proteinen für die Membranfusion wird durch die Vergiftung von Zellen mit den clostridialen Neurotoxinen Tetanustoxin und Botulinustoxin deutlich, die einzelne SNAREs proteolytisch spalten und die Neurotransmission hemmen. Das synaptische SM-Protein Munc-18-1 bindet hochaffin an das SNARE-Protein Syntaxin1. Hierbei konkurriert die Bindung von Munc-18-1 an Syntaxin1 mit dessen Einbindung in den „core complex“. Dies führte zu einem Modell, demzufolge Munc-18-1 durch seine Bindung an Syntaxin1 eine inhibitorische Rolle in der Exozytose übernimmt. Eine rein inhibitorische Funktion von Munc-18-1 läßt sich jedoch nicht mit seinem essentiellen Charakter für die Membranfusion in allen Spezies vereinbaren. Diese zentrale Rolle des Proteins im Membranfusionsvorgang ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Interaktion zwischen Munc-18-1 und Syntaxin1 für die Exozytose von sekretorischen Granulen neuroendokriner Zellen in einem kombinierten Ansatz aus biochemischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Die Interaktion zwischen Syntaxin1 und Munc-18-1 wurde gestört, indem zum einen Munc-18-1 überexprimiert wurde und zum andern in die Syntaxin1-Bindungsregion des Munc-18-1-Moleküls Punktmutationen eingeführt wurden (D34N und R39C). Nach der biochemischen Dokumentation der Störung der Syntaxin1-Bindung wurden die Mutanten sowie das Wildtyp- (WT-) Protein in der neuroendokrinen Zellinie PC12 überexprimiert und die Folgen der Überexpression mit Hilfe der Kohlefaser-Amperometrie elektrophysiologisch charakterisiert. Die Überexpression des Munc-18-WT-Proteins hatte keinen Effekt, was eine inhibitorische Funktion des Proteins unwahrscheinlich macht. Die R39C-Mutante wies eine gewisse Restbindung an Syntaxin1 auf, wohingegen die Bindung der D34N-Mutante an Syntaxin1 vernachlässigbar war. Trotz dieser gleichsinnig veränderten Syntaxin1-Bindung hatten die Mutanten gegensätzliche Effekte auf die Häufigkeit exozytotischer Ereignisse: die Zahl exozytotischer Ereignisse war durch R39C vermindert und durch D34N erhöht. Dies wies auf die Beteiligung eines weiteren Munc-18-1-Bindungspartners an den beobachteten Effekten hin, woraufhin die Interaktion von Mint1 mit Munc- 18-WT,-D34N und-R39C charakterisiert wurde. Mint1 ist ein synaptisches Multidomänen-Protein mit Phosphotyrosin-Bindungsdomänen sowie PDZ-Domänen, die die Interaktion mit weiteren präsynaptischen Proteinen vermitteln und Mint1 somit in die vielfältigen Protein-Interaktionen der Präsynapse einbetten. Die Beobachtung, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Syntaxin1 und Mint1 die D34N-Mutante und die R39C-Mutante unterschiedliche Proteininteraktionen bevorzugten (Mint1/Munc-18-Komplex, bzw. Munc-18/Syntaxin1-Komplex), führte zu der Hypothese, daß der stimulatorische Effekt der D34N-Mutante durch die beobachtete gehäuft auftretende Interaktion mit Mint1 verursacht wird. Eine elektrophysiologische Charakterisierung des Mint1-Proteins in PC12-Zellen zeigte, daß Mint1 eine Inhibition der Exozytose verursacht. Die stimulierende Wirkung der D34N-Mutante könnte somit auf eine vermehrte Interaktion mit Mint1 zurückzuführen sein und eine Disinhibition darstellen. Die R39C-Mutante entfaltete ihre inhibitorische Wirkung vermutlich über die abgeschwächte Syntaxin1-Bindung. Zusammengefaßt hat Munc-18-1 eine positive Funktion in der LDCV-Exozytose. Zudem beschränkt sich die Rolle von Munc-18-1 nicht auf seine Interaktion mit Syntaxin1. Munc-18-1 ist über die Interaktion mit Mint1 vermutlich in vielfältige präsynaptische Komplexe involviert und könnte während der Membranfusion ein entscheidendes Bindeglied zwischen der Membranfusionsmaschinerie und strukturgebenden Komponenten der Präsynapse darstellen

Biosensors based on modified carbon nanotubes

Tato práce se zabývá biosenzory pro detekci látek v roztocích pomocí modifikovaných uhlíkových nanotrubic. Shrnuje poznatky o uhlíkových nanotrubicích a elektrochemických analytických metodách využitých v této práci. V práci je řešen problém přímé elektrochemické detekce inzulinu pomocí CNTs modifikovaných tlustovrstvých planárních uhlíkových elektrod. Byly připraveny základní pracovní elektrody tvořeny komerční uhlíkovou pastou a následně modifikovány tenkým filmem CNTs, CNTs/oxid ruthenia a CNTs/chitosan. Nejlepších výsledků detekce inzulinu bylo dosaženo u pracovních elektrod modifikovaných nízkou koncentrací nečištěných CNTs, které vykazovaly i nízkou základní odezvu v elektrolytu a dobrou odezvu na přídavky inzulinu v koncentračním rozsahu od 0,25 do 10 mol/L. Ostatní modifikace způsobily zvýšení základní odezvy samotné elektrody, ale samotnou detekci nikterak významně neovlivnily.The aim of this work is to describe biosensors for detection of substances in liquids using modified carbon nanotubes. This work reports on knowledge about nanotubes and electrochemical analysis methods which were used. The matter of direct electrochemical detection of insulin using CNTs modified thick layer planar carbon nanotubes is discussed. The elementary working electrodes were created by using of commercial carbon paste and were modified by thin film CNTs, CNTs/ruthenium oxide and CNTs/chitosan then. The best results of the insulin detection were achieved with the working electrodes modified by low concentration non-purified CNTs which had low elementary response in electrolyte and good response to increasing concentration of insulin in the concentration range from 0, 25 to 10 mol/L. The other modifications caused increasing of the electrode elementary response, but they did not significantly affect the detection.

Influence of the pulsed amperometric detection on the passivation of working electrode

Department of Analytical ChemistryKatedra analytické chemiePřírodovědecká fakultaFaculty of Scienc

Laboratory Task for Verification of Sensor Properties by Cyclic Voltammetry

Bakalářská práce se zabývá návrhem laboratorní úlohy využívající metodu cyklické voltametrie. V teoretické části byla provedena rešerše zaměřená na voltametrické a amperometrické metody měření s důrazem na metodu cyklické voltametrie. Na základě literární rešerše byla navržena metodika cyklické voltametrie využívající průtokovou celu. Metodika byla ověřena na dvou typech vybraných komerčních senzorů společnosti BVT Technologies. Na těchto senzorech byl testován vliv vybraných parametrů na jejich elektrochemickou odezvu. V rámci práce byl rovněž testován vliv způsobu čištění senzorů. Na základě provedených experimentů byla sestavena a odzkoušena laboratorní úloha, která bude sloužit studentům pro snažší porozumění problematiky cyklické voltametrie.The bachelor thesis deals with the design of a laboratory task using the method of cyclic voltammetry. In the theoretical part, a research focused on voltammetric and amperometric measurement methods with emphasis on the cyclic voltammetry method was carried out. Based on the literature search, a cyclic voltammetry methodology using a flow cell was proposed. The methodology was validated on two types of selected commercial sensors from BVT Technologies. The effect of selected parameters on their electrochemical response was tested on these sensors. The influence of the cleaning method of the sensors was also tested. Based on the experiments performed, a laboratory problem was set up and tested, which will be used to facilitate students' understanding of cyclic voltammetry.450 - Katedra kybernetiky a biomedicínského inženýrstvívýborn

Determination of creatinine using pulsed amperometry

Tato diplomová práce se zabývá stanovením kreatininu pomocí kombinace průtokové injekční analýzy (FIA) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s pulsní amperometrií, elektrochemickou technikou založenou na vkládání potenciálových pulsů na zlatou pracovní elektrodu. Stanovení probíhalo v zásaditém prostředí borátového pufru s roztokem kreatininu o koncentraci 1∙10-4 mol∙l-1 . Byla optimalizována délka čistícího a aktivačního pulsu a pH nosného roztoku. Na elektrodu byl nejprve vkládán čistící puls o velikosti +1,8 V po dobu 100 ms, dále byl vkládán aktivační potenciál -0,5 V po dobu 150 ms a poté měřící potenciál +0,2 V po 300 ms. Z proměřených pH bylo vybráno optimální pH=9,4. K borátovému pufru byl přidán methanol a později i acetonitril, aby bylo vyzkoušeno, zda je možné s těmito organickými rozpouštědly stanovovat kreatinin a zda bude možné průtokovou injekční analýzu nahradit metodou HPLC. Methanol v systému způsoboval deformaci píků, acetonitril v systému nezpůsoboval deformaci píků, při vyšším obsahu docházelo k destabilizaci základní linie. Dále byla proměřena kalibrační závislost v rozsahu koncentrací od 2,5 ∙ 10-4 mol∙l-1 do 5 ∙ 10-6 mol∙l-1 pomocí PAD v kombinaci s FIA. U vyšších koncentrací docházelo k rozdvojení píků. Pomocí PAD s HPLC byl proměřen samotný kreatinin o...This diploma thesis deals with the determination of creatinine using a combination of flow injection analysis (FIA) or high-performance liquid chromatography (HPLC) with pulse amperometry, an electrochemical technique based on the application of potential pulses on a gold working electrode. The determination was performed in a basic environment of borate buffer with creatinine concentration of 1∙10-4 mol∙l-1 . The lenght of the cleaning and activation pulse was optimized as well as the pH of the running buffer. A cleaning pulse of +1.8 V was first applied to the electrode for 100 ms, then an activation potential of -0.5 V was applied for 150 ms and then a measuring potential of +0.2 V for 300 ms. The optimal pH was selected as pH=9,4. Methanol and acetonitrile were added to the borate buffer to test whether creatinine could be determined in presence of these organic solvents and whether flow injection analysis could be transformed into HPLC. Methanol in the system caused peak deformation, acetonitrile did not cause the peak deformation in the system, at higher contents the baseline was destabilized. Furthermore, the calibration dependence in the range of concentrations from 2.5∙10-4 mol∙l-1 to 5∙10-6 mol ∙ l-1 was measured using PAD in combination with FIA. At higher concentrations, peaks splitted....Department of Analytical ChemistryKatedra analytické chemiePřírodovědecká fakultaFaculty of Scienc

Labelfreie Detektion von Protein-DNA-Interaktionen durch elektrochemische Impedanzspektroskopie

Es wird ein impedimetrisches Sensorsystem für den Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen vorgestellt. Der Sensor nutzt kurze Thiol-markierte DNA (ssDNA), die über Chemisorption auf Goldchipelektroden immobilisiert wird. Aus den Impedanzspektren wurde der Durchtrittswiderstand (Rct) als Kenngröße für die zu untersuchenden Wechselwirkungen gewählt. In Anwesenheit des Redoxsystems Ferro-/Ferrycyanid konnte eine Zunahme des Durchtrittswiderstandes nach der Immobilisierung und anschließender Hybridisierung auf der Sensoroberfl äche registriert werden. Der Einsatz längerer Fänger-DNA (25- mer im Vergleich zu 18-mer) führte zu einer Abnahme der Konzentration an immobilisierten Fänger-Strängen, aber auch zu einer Vergrößerung der Durchtrittswiderstände sowohl für ssDNA als auch dsDNA. Bei ähnlichen Oberflächenkonzentrationen ließ sich eine annähernd gleiche Sensitivität des Hybridisierungsnachweises im Vergleich zu 18-mer Fänger-Strängen erzielen. Mit Hilfe des Elektrodensystems wurde die Nachweisbarkeit von Protein-DNA-Wechselwirkungen untersucht. Die Restriktion doppelsträngiger DNA durch die Restriktionsendonuklease BamHI konnte mit der Zyklovoltammetrie und markierungsfrei mit der Impedanzspektroskopie verfolgt werden. Des Weiteren wurde die sequenzspezifische Bindung des Transkriptionsfaktors NF-κB p50 anIn this work, the applicability of an impedimetric DNA sensor has been investigated for the detection of protein- DNA interactions. The sensor is based on short thiol-modified single-stranded DNA, which is chemisorbed to gold chip electrodes. In the presence of the redox system ferri-/ferrocyanide impedance measurements show an increase in charge transfer resistance after immobilization and hybridization of ssDNA to the sensor surface. The use of a longer capture oligonucleotide (a 25-mer instead of an 18-mer) results in a decreasing probe concentration on the surface. Furthermore it causes an increase of the charge transfer resistance for both ssDNA and dsDNA. The hybridization event, however, can be detected with a similar sensitivity compared to an 18-mer (with the same surface concentration) and allows a good discrimination between ssDNA and dsDNA. This electrode system is used to follow an enzyme reaction on the surface electrochemically. The cleavage of a double-stranded DNA by restriction endonuclease BamHI could be verified by cyclic voltammetry and impedance spectroscopy. The sequence specific DNAbinding of the transcription factor NF-κB p50 is found to cause a decrease in charge transfer resistance

Charakterisierung der Zellen des Glomus Caroticum

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Zellen des Glomus caroticum der Ratte alle notwendigen Komponenten zur Biosynthese, Speicherung und Freisetzung von Dopamin und Histamin besitzen und diese Transmitter bei Hypoxie freisetzen können. Erstmals wurde hier Histamin als Transmitter im Glomus caroticum nachgewiesen: es wurde gezeigt, dass die Sensorzellen des Glomus caroticum das Histamin synthetisierende Enzym exprimieren. Die Speicherung von Histamin in Vesikeln erfolgt mit Hilfe eines vesikulären Monoamintransporters (VMAT2). Bisher bekannte immunhistochemische Ergebnisse über die Expression dieses Transportproteins in den Sensorzellen konnten bestätigt und mittels RT-PCR-Untersuchungen belegt werden. Ferner wurde nachgewiesen, dass die Sensorzellen auch über wichtige Komponenten des Exozytoseapparates verfügen. Darüber hinaus zeigten RT-PCR- Untersuchungen, dass im Glomus caroticum die mRNA der Histaminrezeptoren H1, H2 und H3 exprimiert wird. Die Menge an Histamin im Glomus caroticum wurde mittels Radioimmunoassay bestimmt. Im Glomus caroticum ist mehr Histamin enthalten als in anderen Geweben der Ratte, und die Menge an Histamin ist um ein Vielfaches größer als die Menge des im Glomus caroticum enthaltenen Dopamins. In vitro Experimente zeigten, dass die Freisetzung von Histamin aus dem Glomus caroticum durch Hypoxie verstärkt wird. Eine vermehrte Freisetzung bei Hypoxie konnte amperometrisch auch für Dopamin bestätigt werden. Es wurde hier zum ersten Mal beschrieben, dass ein Zelltyp zwei verschiedene Amine als Transmitter nutzt. Damit spielt sowohl Dopamin als auch Histamin eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Sauerstoffversorgung des Organismus und, aufgrund der Lage des Glomus caroticum, besonders des Gehirns. Mit dem Nachweis von Expression und Aktivität des limitierenden Enzyms für die Tetrahydrobiopterin-Synthese wurde gezeigt, dass das Glomus caroticum sämtliche für die Dopaminsynthese notwendigen Schritte selbst durchführen kann. Damit erfüllt das Glomus caroticum die notwendigen Eigenschaften für eine erfolgreiche Autotransplantation in das Striatum bei Morbus Parkinson