Mélodie en Sous-Sol- Ecologie, évolution et virulences de pathogènes telluriques

Depuis le début de ma carrière scientifique, mes travaux ont été consacrés à l’étude de pathogènes microbiens multi-hôtes. Ces microorganismes phytopathogènes responsables de nombreuses émergences ces dernières années, posent un grand défi aux pathologistes par leur gamme d’hôte large, et le déterminisme génétique complexe sous-tendant leurs interactions avec leurs hôtes. Mon activité de recherche a débuté en 1998 par l’étude des bases génétiques de la spécificité d’hôte et de virulence chez Aphanomyces euteiches, un Oomycète tellurique responsable d’une maladie émergente très dommageable sur Légumineuses en France depuis 1993, en partenariat avec des généticiens- sélectionneurs du pois. La combinaison de tests phénotypiques et d’analyses génétiques par marqueurs neutres AFLP m’ont permis de montrer que les populations françaises étaient génétiquement variables mais non structurées par l’hôte, ni par la géographie. Les paramètres de structuration génétique des populations indiquaient qu’A.euteiches suit probablement le modèle épidémique de Smith (1993), ce qui nous a conduit à deux interprétations (i) le caractère polycylique des infections sur pois (confirmé ultérieurement par une approche épidémiologique), (ii) l’existence probable d’une population « environnementale » non échantillonnée, hautement diversifiée et recombinante. Mon activité de recherche s’est ensuite orientée en 2002 sur un autre modèle phytopathogène tellurique. Ralstonia solanacearum est une Beta-Proteobactérie présente dans toute la ceinture tropicale et subtropicale, émergente en zone tempérée, provoquant plusieurs maladies d’importance agronomique majeure, dont le flétrissement bactérien des Solanacées. Les souches affectant les Solanacées appartiennent aux 4 phylotypes (I, II, III, IV) constituant ce complexe d’espèces. Je me suis d’abord intéressé aux facteurs écologiques de l’émergence en Martinique du phylotypeIIB/sequevar4NPB. Des marqueurs PCR et de séquence ont établi que ce groupe constituait bien une nouvelle population, phylogénétiquement homogène (phylotype IIB/4NPB) et distincte des populations « historiques » composées uniquement de phylotype I (Asiatique) et IIA (Américain). Plusieurs enquêtes menées en partenariat de 2002 à 2006 ont permis d’établir les facteurs écologiques de cette émergence: l’acquisition de nouveaux hôtes (dont certains préalablement inconnus chez R.solanacearum), la propagation très rapide de ce groupe sur toute l’île, probablement par les eaux de rivière. L’analyse des compositions phylogénétiques de populations sur plusieurs historiques culturaux, nous a conduit à suggérer que les rotations cucurbitacées-solanacées, mais aussi bananier-Solanacées avaient un effet favorisant sur l’émergence de cette population. Ses traits biologiques spécifiques ont été déterminés en conditions contrôlées, dont sa gamme d’hôte sur Solanacées, Cucurbitacées, Solanacées. Les spécificités écologiques et phylogénétiques de ce groupe en constituent un écotype spécifique, appelé « Emergent ». Ces études ont servi de base aux projets ultérieurs de génomique comparative. La question de son caractère endémique ou introduit reste ouverte ; l’épidémiosurveillance de la zone Antilles-Guyane combinant MLST et PCR spécifiques ont démontré (i) son absence récente dans les petites Antilles, à l’exception de Trinidad, et (ii) sa présence dans des collections au Brésil. En revanche, cet écotype est établi en zone forestière de Guyane française depuis 2006, et en apparente expansion. L’étude de cet écotype m’a amené à partir de 2008 à m’intéresser aux facteurs génétiques et écologiques de l’adaptation de R.solanacearum à un nouvel hôte ou à une résistance variétale, dans le cadre d’un projet de caractérisation de la spécificité et durabilité de résistance des Solanacées au flétrissement bactérien, focalisé sur le modèle de l’aubergine (Solanum melongena) et notamment le gène de résistance Ers1 porté par l’accession AG91-25.Nous avons dans un premier temps recherché les facteurs génétiques et moléculaires expliquant la spécificité de virulence sur tomate et aubergine. Parce que l’analyse des contraintes évolutives pesant sur les gènes d’avirulence bactériens peut informer sur la durabilité des gènes de résistance correspondants, nous avons cherché à identifier le ou les effecteurs impliqués dans l’avirulence sur Solanacées, pour évaluer leur distribution dans les populations de R.solanacearum, puis estimer les contraintes évolutives auxquels ils étaient soumis. Nous avons rapidement focalisé cette recherche sur les effecteurs de type III, en combinant des données de génomique et phénotypiques (virulence aubergine-tomate). Notre démarche a consisté à (i) identifier 25 effecteurs de type III (T3E) candidats à l’avirulence ou virulence sur aubergine-tomate-piment, par une démarche proche de la génétique d’association, (ii) valider par PCR spécifique leur association au phénotype d’avirulence sur aubergine. Nous avons ainsi observé que l’avirulence sur aubergine et tomate n’était pas expliquée par le répertoire d’effecteurs présents, mais par l’effet individuel d’une dizaine d’effecteurs qui pourraient être les interacteurs du gène de résistance Ers1 identifié chez l’aubergine. La validation de leur fonction d’avirulence est en cours actuellement grâce à une collaboration tripartite. Pour déterminer les bases génétiques du potentiel évolutif de R.solanacearum, nous avons identifié les forces évolutives majeures modelant ce complexe d’espèces par une approche MLSA. Nous avons ainsi démontré que la recombinaison était une force évolutive majeure chez cette bactérie, mais aussi que les différents phylotypes présentent des dynamiques évolutives très spécifiques. Les phylotype I et III semblent posséder le potentiel évolutif le plus élevé. Nos analyses de phylogéographie nous ont d’ailleurs amené à proposer un centre de diversification primaire en Indonésie (phylotype IV) et deux centres de diversification secondaire en Afrique de l’Est (divergence du phylotype I et III) et Amazonie (divergence du phylotype IIA et IIB). Nous sommes ensuite focalisés sur la dynamique d’adaptation du phylotype I, groupe pandémique très recombinogène et variable en virulences. Les paramètres de génétique des populations ont été estimés à l’aide de sets de marqueurs micro- et minisatellites (schémas MLVA) spécifiques de phylotype. Pour étudier les forces évolutives impliquées dans l’adaptation du phylotype I à une résistance variétale, nous avons mis en regard virulence et structuration génétique des populations en considérant plusieurs échelles : (i) l’échelle globale à régionale, (ii) l’échelle locale, au niveau de la parcelle. A l’échelle globale, la combinaison de génotypage MLVA et de typage de virulence a permis de montrer (i) une variabilité de virulence insoupçonnée, notamment en Afrique et Guyane, (ii) la préexistence dans la nature de souches déjà capables de contourner le gène Ers1, (iii) l’existence de lignées clonales hautement virulentes dont la dynamique de population est absolument à suivre dans les prochaines années. A l’échelle locale, nous avons suivi l’évolution d’une population pathogène en réponse à la culture répétée d’aubergines sensibles et résistantes, par une approche d’évolution expérimentale in situ en parcelle naturellement contaminée. Les variations de diversité et structuration génétique des populations suggèrent que des phénomènes d’adaptation locale à l’aubergine sont en cours, tandis que l’aubergine résistante semble avoir sélectionné des isolats plus agressifs mais entraîné une forte chute quantitative de populations, empêchant ainsi le contournement de résistance.De ce projet de recherche, alliant recherche des déterminants de l’interaction microorganisme-plante et génétique des populations, il émerge que l’explication claire d’un phénotype de virulence ne sera pleinement satisfaisante que lorsqu’on aura pris en compte les interactions entre gènes de virulence à l’échelle du génome entier. Par ailleurs, l’existence de souches à large spectre de virulence dans plusieurs zones naturelles, préexistant donc à une pression de sélection par un gène de résistance, amène à questionner les facteurs qui ont mené à leur émergence en zone cultivée. Une perspective intéressante de ce travail serait donc de s’attacher plus spécifiquement à reconstruire les routes d’invasion et les dynamique d’acquisition d’hôtes de bactérioses vasculaires, par une approche de génomique des populations cette fois

Diversité des populations françaises d' Aphanomyces euteiches Drechs., agent de la pourriture racinaire du pois:variabilité pathogène et moléculaire

Préparée à l'Unité Mixte de Recherche "Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes" (UMR BiO3P) ENSAR-INRA Rennes-Le RheuThe common root rot of pea recently appeared in France, causing big damages in the major pea-producing areas. For a better understanding of the origin of this epidemic, and to search for breeding and cultural solutions, the pathogenic and molecular variability of the french populations of A.euteiches had to be investigated.The host specificity of a french collection of isolates, as well as some reference isolates from foreign countries, was estimated by their pathogenicity on pea, common vetch, alfalfa, faba bean and snap bean. It appeared that the french isolates were preferentially pathogenic on pea, but not specialised on this species, most of them attacking also vetch, alfalfa and faba bean. 10% of the isolates exhibited a broad-host range. The foreign isolates from other legume species were much more specialized to their host.To investigate the variability in virulence on pea of the A.euteiches french populations, a new set of differential genotypes was set up. Eleven virulence types were characterised, but a type highly predominated, virulent on the whole set and aggressive. The french isolates appeared to be more aggressive than the foreign isolates, and were virulent on some lines found resistant to foreign isolates. AFLP markers revealed a very high genotypical diversity within the french isolates, suggesting the endemic origin of the A.euteiches inoculum and a great amount of outcrossing. The French populations were found to be structured neither by their host specificity, nor by geography. However, the population structure of this soilborne fungus was found to be strongly homothallic. Hypotheses to explain this paradox are proposed.This study was the first one to investigate the population diversity of this fungus at this scale of study. It has many agronomical repercussions, regarding cultural control methods, and breeding strategies for A.euteiches resistance in pea.La pourriture racinaire causée par Aphanomyces euteiches est apparue brusquement sur pois en France, causant de gros dégâts. Une étude de diversité de populations françaises d' A.euteiches a été menée pour mieux comprendre l'origine de cette brutale épidémie, et pour contribuer à la mise en place de stratégies de lutte efficaces et durables.La variabilité de spécificité d'hôte sur Légumineuses a d'abord été estimée par inoculation de la collection française et d'isolats-référence étrangers sur pois, vesce commune, luzerne, féverole et haricot. Il apparaît que les isolats français sont préférentiellement pathogènes sur pois mais ne sont pas spécialisés sur cette espèce. Un type majoritaire a été mis en évidence (attaquant pois, vesce, luzerne et féverole), ainsi que 10% d’isolats polyphages. Les isolats étrangers piégés sur d'autres Légumineuses apparaissent en revanche beaucoup plus spécialisés sur leur hôte.L'étude de variabilité de virulence sur pois a nécessité la mise au point d'une nouvelle gamme différentielle à six génotypes. Onze types de virulence ont été mis en évidence, dont un est très majoritaire en France. Les isolats français se distinguent par leur agressivité plus élevée, et par leur virulence sur des lignées résistantes à certains isolats étrangers, notamment américains.Des marqueurs AFLP ont révélé une très forte variabilité génotypique des populations françaises d'A.euteiches à toutes les échelles d'étude, suggérant leur caractère endémique et un fort taux de recombinaison. Elles ne sont en revanche structurées ni par leur degré de spécificité d'hôte, ni par la géographie. La structure de population de ce champignon tellurique apparaît par contre fortement homothallique. Certaines pistes d'explication de ce paradoxe sont proposées.Cette étude est la première étude de diversité réalisée sur ce champignon à cette échelle (parcellaire, nationale et internationale). Elle ouvre de nombreuses perspectives, notamment dans la gestion des rotations, et dans la sélection variétale pour la résistance à A.euteiches

A new multi locus variable number of tandem repeat analysis scheme for epidemiological surveillance of Xanthomonas vasicola pv. musacearum, the plant pathogen causing bacterial wilt on banana and enset

Xanthomonas vasicola pv. musacearum (Xvm) which causes Xanthomonas wilt (XW) on banana (Musa accuminata x balbisiana) and enset (Ensete ventricosum), is closely related to the species Xanthomonas vasicola that contains the pathovars vasculorum (Xvv) and holcicola (Xvh), respectively pathogenic to sugarcane and sorghum. Xvm is considered a monomorphic bacterium whose intra-pathovar diversity remains poorly understood. With the sudden emergence of Xvm within east and central Africa coupled with the unknown origin of one of the two sublineages suggested for Xvm, attention has shifted to adapting technologies that focus on identifying the origin and distribution of the genetic diversity within this pathogen. Although microbiological and conventional molecular diagnostics have been useful in pathogen identification. Recent advances have ushered in an era of genomic epidemiology that aids in characterizing monomorphic pathogens. To unravel the origin and pathways of the recent emergence of XW in Eastern and Central Africa, there was a need for a genotyping tool adapted for molecular epidemiology. Multi-Locus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA) is able to resolve the evolutionary patterns and invasion routes of a pathogen. In this study, we identified microsatellite loci from nine published Xvm genome sequences. Of the 36 detected microsatellite loci, 21 were selected for primer design and 19 determined to be highly typeable, specific, reproducible and polymorphic with two- to four- alleles per locus on a sub-collection. The 19 markers were multiplexed and applied to genotype 335 Xvm strains isolated from seven countries over several years. The microsatellite markers grouped the Xvm collection into three clusters; with two similar to the SNP-based sublineages 1 and 2 and a new cluster 3, revealing an unknown diversity in Ethiopia. Five of the 19 markers had alleles present in both Xvm and Xanthomonas vasicola pathovars holcicola and vasculorum, supporting the phylogenetic closeliness of these three pathovars. Thank to the public availability of the haplotypes on the MLVABank database, this highly reliable and polymorphic genotyping tool can be further used in a transnational surveillance network to monitor the spread and evolution of XW throughout Africa.. It will inform and guide management of Xvm both in banana-based and enset-based cropping systems. Due to the suitability of MLVA-19 markers for population genetic analyses, this genotyping tool will also be used in future microevolution studies