From molecular targets to antitumor immunity

This thesis aimed at the development of strategies that could contribute to the evaluation of the clinical potential of new anticancer therapies. The work was divided into two main sections comprising the development of a therapeutic approach to target cancer genetic vulnerabilities and the development of 3D tumor models incorporating cues from the stromal and immune microenvironments. (...

Association between anthropometric indicators of nutritional status and length of stay in hospitalized patients

Trabalho Complementar apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de licenciada em Ciências da NutriçãoBackground: Undernutrition is highly prevalent in hospitalized patients worldwide and this condition has been associated with increased hospital length of stay (LOS). The diagnosis of undernutrition includes anthropometric measurements. The aim of this study was to measure the independent association of the anthropometric and derived indicators triceps skinfold thickness (TST), mid-upper arm circumference (MUAC), adductor pollicis muscle thickness (APMT), mid-upper arm muscle area (AMA) and mid-upper arm muscle circumference (AMC) with LOS, within a varied group of hospitalized patients. Methods: A total of 695 patients were enrolled in a prospective observational study, conducted in a Portuguese university hospital. Participants were dichotomized for the anthropometric and derived indicators TST, MUAC, APMT, AMA and AMC according to the percentiles 5th and 25th described in the literature, except for APMT, for which only the 5th percentile was used. Cox regression analysis was used to estimate adjusted hazard ratios (HR) and corresponding 95% confidence intervals (95% CI). Results: Patients that presented values lower than the 5th percentile for TST (HR=0.759, 95% CI=0.579;0.995), MUAC (HR=0.822, 95% CI=0.687;0.983), APMT (HR=0.791, 95% CI=0.671;0.933), AMA (HR=0.797, 95% CI=0.660;0.962) and AMC (HR=0.746, 95% CI=0.611;0.911), showed a lower probability of being discharged from the hospital to usual residence over time. For TST (HR 0.798, 95% CI=0.673;0.946), patients whose values were below the 25th percentile also presented a lower probability of being discharged from the hospital to usual residence over time. Conclusion: For all the anthropometric and derived indicators studied, patients that presented values lower than the 5th percentile had a lower probability of being discharged from the hospital to usual residence. For TST, values below the 25th percentile were also associated with lower probability of discharge. Thus, TST was found to be the best anthropometric indicator to predict LOS. This anthropometric indicator can present advantages for the diagnosis of undernutrition since it may allow an earlier detection of a poor nutritional status.Introdução: A desnutrição apresenta elevada prevalência em doentes hospitalizados e esta condição tem vindo a ser associada com maior tempo de internamento (TI). O diagnóstico da desnutrição inclui indicadores antropométricos. O objetivo deste trabalho foi estudar a associação independente entre os indicadores antropométricos prega cutânea tricipital (PCT), perímetro do meio braço (PB), espessura do músculo adutor do polegar (AP), área muscular do braço (AMB) e perímetro muscular do braço (PMB) e o TI em doentes hospitalizados. Métodos: 695 indivíduos participaram num estudo observacional realizado num hospital universitário Português. Os participantes foram dicotomizados para cada indicador antropométrico PCT, PB, AP, AMB e PMB de acordo com os percentis 5 e 25 descritos na literatura, exceto para o AP, para o qual apenas o percentil 5 foi utilizado. Utilizaram--se modelos de regressão de Cox para calcular os hazard ratios (HR) e os intervalos de confiança a 95% (IC 95%) correspondentes. Resultados: Os participantes que apresentaram valores abaixo do percentil 5 para PCT (HR=0,759; IC 95%=0,579;0,995), PB (HR=0,822; IC 95%=0,687;0,983), AP (HR=0,791; IC 95%=0,671;0,933), AMB (HR=0,797; IC 95%=0,660;0,962) e PMB (HR=0,746; IC 95%=0,611;0,911), revelaram uma menor probabilidade de alta para o domicílio. Para a PCT (HR=0,798; IC 95%=0,673;0,946), apresentar valores abaixo do percentil 25 também se associou a uma menor probabilidade de alta para o domicílio. Conclusão: Os participantes que apresentaram valores abaixo do percentil 5 para todos os indicadores antropométricos mostraram uma menor probabilidade de alta domiciliar. Para a PCT, o percentil 25 também foi associado com uma menor probabilidade de alta para o domicílio. A PCT foi então o melhor indicador antropométrico capaz de prever o TI hospitalar. Incluir este indicador antropométrico nos métodos de diagnóstico de desnutrição pode ser uma mais valia por poder detetar mais precocemente um pior estado nutricional.N/

Novel human central nervous system 3D in vitro models: useful tools for evaluation of viral vector-mediated gene delivery

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, estão ainda longe de se tornarem realidade. Embora as estratégias farmacológicas convencionais se tenham revelado pouco eficazes, resultados preliminares indicam que a terapia génica poderá ter grande potencial. Os vectores adenovirais baseados no serotipo canino 2 (CAV-2) transduzem preferencialmente neurónios em modelos animais, tendo o potencial de ser transportados a longa distância no cérebro via transporte axonal. A expressão epissomal a longo prazo permite uma entrega eficiente do material genético especificamente em neurónios. A aplicação da terapia génica está, no entanto, dependente da resolução de uma série de questões ainda em aberto - em particular, a necessidade de avaliar a sua exequibilidade, eficácia e segurança. O projecto europeu BrainCAV (www.braincav.eu), no qual este plano de trabalhos de mestrado está integrado, propõe-se avaliar o potencial de vectores CAV-2 para gerar modelos celulares geneticamente modificados que permitam estudar os mecanismos moleculares da doença de Parkinson (por introdução de genes com mutações associadas à doença) e como abordagem terapêutica para doenças neurodegenerativas. Tendo em vista a potencial aplicação dos vectores CAV-2 em ensaios clínicos, será necessário, numa primeira fase, avaliar estes efeitos em células humanas de cérebro. Dada a complexidade do sistema nervoso central (SNC), nomeadamente a importância da interacção neurónio-astrócito, é difícil encontrar modelos celulares adequados. Os modelos bi-dimensionais tradicionais de cultura têm-se mostrado ineficazes na recapitulação da fisiologia dos tecidos vivos. Assim, torna-se necessário recorrer a modelos tridimensionais, que apresentem os diferentes tipos celulares do SNC e que recapitulem as interações celulares no contexto tridimensional (3D) em que ocorrem. Visto isto, o principal objectivo deste trabalho era o desenvolvimento de um modelo celular 3D do SNC humano, com aplicação no estudo da doença de Parkinson. Para tal foram utilizadas células percursoras neurais derivadas do mesencéfalo fetal (hmNPCs), que apresentam capacidade de diferenciação nas 3 principais linhagens neurais (neurónios, astrócitos e oligodendrócitos), com forte potencial de diferenciação na linhagem dopaminérgica. Estas células são derivadas da região cerebral que, no adulto, é particularmente afectada com a doença de Parkinson, uma patologia que envolve, entre outros sintomas, a perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na zona sub-ventricular do cérebro. Uma metodologia para a geração de neurosferas de hmNPCs diferenciadas tinha sido previamente desenvolvida na unidade de tecnologia de células animais (ITQB-UNL/IBET) [1]. Este processo recorre a sistemas de agitação orbital – erlenmeyers – que são mantidos numa incubadora com atmosfera controlada. Tendo em vista as potenciais aplicações referidas, neste trabalho procedeu-se a uma caracterização detalhada, nomeadamente em termos de fenótipo dopaminérgico e em termos funcionais. A caracterização fenotípica com recurso a técnicas de análise de expressão génica (qRT-PCR) e análise proteica (microscopia de fluorescência e Western blot) revelou que no final do protocolo de diferenciação (uma fase de agregação das células, durante 7 dias, seguida de uma etapa de diferenciação, durante 14 dias) a cultura era composta por uma elevada percentagem de células neuronais. Estas apresentavam marcadores típicos de neurónios maturos (βIII-Tubulin+/MAPS+/Sinaptofisina+, este último num padrão de marcação vesicular, indicativo de vesículas pré-sinápticas). Considerando o objectivo futuro de desenvolver um modelo celular de doença de Parkinson, a diferenciação na linhagem dopaminérgica nesta cultura foi também analisada. No final da diferenciação verificou-se um enriquecimento em neurónios dopaminérgicos nas neurosferas. No entanto, os níveis atingidos mantiveram-se abaixo dos valores obtidos quando estas células são diferenciadas em sistemas bi-dimensionais. A reduzida expressão do factor de transcrição Nurr1, envolvido na manutenção e diferenciação terminal de neurónios dopaminérgicos, sugeriu que as culturas 3D diferenciadas se encontravam num estádio de maturação anterior ao observado nas culturas 2D diferenciadas. Assim, com o objectivo de aumentar a eficiência da diferenciação dopaminérgica, o período de diferenciação foi prolongado; após os 14 dias de diferenciação a cultura foi mantida em condições de maturação (sem morfogéneos), o que permitiu a manutenção de neurosferas diferenciadas em cultura por mais 18 dias, com elevada viabilidade. Adicionalmente foi observado um aumento significativo na expressão de TH, o gene que codifica para a enzima tirosina hidroxilase, da via de produção de dopamina, indicando que a diferenciação dopaminérgica foi favorecida pelas condições de maturação. O terceiro objectivo consistia na integração das etapas de agregação e diferenciação de neurosferas de hmNPC num sistema em biorreactor controlado. Este sistema de cultura tem importantes vantagens em relação à cultura em erlenmeyer, tais como permitir o controlo e monitorização em tempo real dos parâmetros de cultura (pH, pO2 e temperatura), mantendo-os estáveis ao longo da cultura. Para tal, biorreactores de tanque agitado foram inoculados com uma suspensão celular, permitindo um processo de agregação eficiente durante 7 dias. No final deste período, a caracterização fenotípica das neurosferas revelou que permaneciam num estado proliferativo e indiferenciado. Seguiu-se um período de 14 dias de diferenciação e, no final do mesmo, as neurosferas revelaram uma baixa eficiência de diferenciação neuronal. Esta discrepância relativamente ao processo de diferenciação implementado em erlenmeyer poderá resultar nas diferenças entre os dois sistemas, nomeadamente em relação à dinâmica de agitação. Esta está directamente relacionada como a força hidrodinâmica a que as células estão sujeitas, o que pode influenciar a diferenciação das mesmas. Além disto, tanto o pH como também os níveis de pO2 ao longo da cultura poderão contribuir para este resultado, pelo que estudos relativamente aos efeitos dos mesmos terão de ser feitos com vista à optimização da cultura em bioreactor. Assim, a cultura em erlenmeyer foi o sistema escolhido para, numa primeira fase, proceder à avaliação da transdução de neurosferas diferenciadas com vectores CAV-2. Tendo em conta os últimos avanços no campo de engenharia de vectores para terapia génica, a eficiência de transdução e impacto na sobrevivência celular e composição das neurosferas foram avaliados recorrendo a um vector CAV de terceira geração (hd-CAV-2) codificando a proteína repórter eGFP. Estes são vectores CAV-2 aos quais foi retirado a totalidade dos genes virais, o que lhes confere uma maior capacidade de clonagem e uma incapacidade de replicação, propriedades vantajosas em cenários de terapia génica. Por último, e no sentido de desenvolver o potencial deste sistema de cultura como modelo de doença de Parkinson, procedeu-se à transdução de neurosferas diferenciadas com um vector hd-CAV que codificava para uma proteína LRRK2 com a mutação G2019S que foi associada à etiologia da doença). Para tal, foram utilizadas as condições de transdução optimizadas utilizando o vector hd-eGFP. Os resultados revelaram níveis baixos de expressão do transgene nas culturas transduzidas. Isto poderá indicar problemas com a preparação viral, nomeadamente no que respeita ao rácio entre partículas totais e partículas com capacidade infecciosa. No caso desta razão apresentar valores baixos, poderá em parte justificar os elevados níveis de toxicidade observados, assim como os baixos níveis de expressão de transgene. Portanto, testes mais rigorosos à qualidade da preparação viral terão de ser efectuados previamente ao prosseguimento dos estudos; adicionalmente, outros stocks virais serão testados. Em resumo, esta tese contribuiu para o melhoramento do processo de diferenciação de hmNPCs em sistemas de agitação orbital, nomeadamente em termos de duração do tempo de cultura e de maturação neuronal. Foi ainda possível implementar um processo em biorreactores de tanque agitado para a agregação de hmNPCs, ainda que a integração da diferenciação das neurosferas no mesmo sistema necessite ser completamente optimizada. Por último, contribuiu para a caracterização do processo de transdução com recurso a vectores CAV de terceira geração como veículos de manipulação genética, com potencial aplicação tanto em terapia génica como para o desenvolvimento de modelos de doença. Assim, o processo estabelecido nesta tese contribuiu para o desenvolvimento de um modelo celular robusto e reprodutível do SNC, o que poderá contribuir para o aumento da relevância de ensaios pré-clínicos, tanto no desenvolvimento de novos fármacos como na avaliação de vectores de terapia génica.Central Nervous System (CNS) disorders remain a formidable challenge for the development of new and efficient therapies. Gene therapy has emerged as a promising alternative in treating the causes of the disease, instead of merely ameliorating symptoms. For this, hd-CAV vectors have arised as suitable tools, due to the higher safety and lack of immunological memory. Preclinical research of CNS disorders, such as Parkinson’s disease (PD), has traditionally relied on animal models and 2D in vitro cell models, which fail in mimicking in vivo human phenotype. This represents the main obstacle for the translation of CNS drugs into clinical trials. Thus, the main aim of this thesis was the development a human CNS cellular model using human midbrain-derived neural precursor cells (hmNPCs). A protocol for differentiation of hmNPC neurospheres using stirred cultured systems with orbital shaking was already implemented. In this thesis, further characterization showed that the neurospheres were enriched in dopaminergic neurons and were functional, as assessed by detection of synaptic vesicle trafficking using FM1-43 probe. Moreover, this culture system was improved in terms of dopaminergic differentiation. By the end of differentiation, higher values the dopaminergic neuron markers of Nurr1 and TH were detected both at mRNA and proteins levels. Importantly, the improved protocol allowed neurosphere viability for long periods of time by adding a maturation period of 18 days, in which differentiation factors were removed from the culture. Also, a long-term 3D culture system for neural differentiation using controlled stirred-tank bioreactors was implemented, which allowed for aggregation of hmNPCs and is currently under optimization. Furthermore, the potential of third generation canine adenoviral vectors for genetic manipulation of this cellular model was evaluated. This can be of great value as a powerful tool for disease modeling, namely PD through overexpression of Leucine-rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) carrying the PD-associated mutation G2019S. Additionally, these hd-CAV vectors could have important applications in gene therapy

Desenvolvimento e ensaio de um secador convectivo para alimentos

Dissertação de Mestrado em Qualidade e Tecnologia AlimentarA presente dissertação versa sobre a concepção e exploração de um secador convectivo de produtos alimentares. Partindo-se do invólucro exterior (secador), neste foi instalado o equipamento para promover o aquecimento e escoamento do ar interior. Para monitorizar e controlar o processo de secagem, procedeu-se à instrumentação da instalação para monitorização/controlo e registo de cada uma das variáveis, nomeadamente: temperatura e humidade do ar, assim como a pesagem contínua dos produtos durante a secagem. Com o objectivo de explorar o comportamento do secador, realizaram-se ensaios preliminares, em que se comparou a eficiência de secagem obtida com o secador desenvolvido e uma estufa. Nos ensaios finais comparam-se os resultados para duas variedades de maçã, a 'Golden Delicious' e a 'Granny Smith', ambas secadas no secador desenvolvido. Para efeitos de comparação realizaram-se várias análises, que envolveram a determinação da humidade, acidez, sólidos solúveis totais, a cor e a textura das respectivas maçãs, em fresco e depois de secadas, num intervalo de temperaturas de 30ºC e 60ºC. Além disso estudou-se também a cinética de secagem em termos de modelos de camada fina, e também por meio da equação de difusão de Fick. Assim, avaliaram-se algumas propriedades de transferência de massa, como a humidade de difusividade efectiva e o coeficiente de transferência convectiva de massa. Os resultados mostram que para ambas as variedades de maçãs estudadas, a secagem reduz a acidez e o teor em açúcares. No que respeita à cor, esta foi significativamente afetada pela secagem, resultando em elevados valores da diferença de cor total, entre 19.43 e 25,04. Quanto à textura, verificou-se que com a secagem as maçãs tornam-se menos duras e menos coesas. No que respeitou à cinética de secagem, os dados cinéticos foram tratados e ajustados de acordo com diferentes modelos de camada fina que foram: 'Page', 'Henderson' e 'Pabis', 'Logarítmico' e 'Vega-Lemus'. Dos modelos testados foi possível verificar que o modelo 'Vega-Lumus' foi o pior para descrever a cinética de secagem,sendo o de 'Page' o que mostrou melhor adaptação/comportamento. Além disso, verificou-se que a difusidade de massa aumenta com a temperatura, seguindo a função do tipo 'Arrhenius' para as variedades 'Golden Delicious' e 'Granny Smith'.ABSTRACT: This dissertacion examines the design and operation of a food convective dryer. Starting from the outer casing (dryer), all the equipment has been installed to promote the heating and air flow inside. To monitor and control the drying process, all the instrumentation for monitoring/control and registration of each variable was installed, in particular, regardind the variables such as temperature and humidity, as well as the continous weighing of the product during drying. In order to explore the behaviour of the dryer, preliminary tests were carried out, which compared the efficiency obtained by drying in the developed drier and in an oven dryer. In the definitive tests, two varieties of apples, 'Golden Delicious' and 'Granny Smith', were both dried in the developed drier and the results were compared. For this several tests were carried out, which involved the determination of humidity, acidity, total soluble solids, colour and texture of the respective apples, either in fresh and after dried at temperatures in the range of 30ºC to 60ºC. In addittion it was also studied the drying kinetics in terms of thin layer models, and also by Fick's diffusion equation. Thus, some mass tranfer properties were evaluated, such as moisture effective diffusivity and the coefficient of convective mass transfer.The results show that both varieties of apple at study, drying reduces the acidity and sugar content. As regards colour, this was significantly affected by drying, resulting in high values of total colour difference between 19.43 and 25.04. As to texture, it was found that drying turned the apples softer and less cohesive. With respect to drying kinetics, the experimental data were adjusted according to different thin layer models: 'Page', 'Henderson' and 'Pabis', 'logarithmic' and 'Vega-Lemus'. From the models tested, it was able to verify that the model Vega-Lemus was the worst to describe the kinetics of drying and the 'Page' showed the best fit/performance. Furthermore, it was found that the mass diffusivity increases with temperature, following an 'Arrhenius' function for varieties 'Golden Delicious' and 'Granny Smith'

Analysis of the organic acids and exopolysaccharides produced by the lactic acid microflora present in kefir and their potential applications

Tese de Mestrado Integrado. Bioengenharia (Área de Especialização de Engenharia Biológica). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 201