Caracterización de los mecanismos de defensa a sclerotinia sclerotiorum, agente causal de la podredumbre del estudio de perfiles metabólicos y transcripcionales

En Argentina, la podredumbre húmeda del capítulo, causada por el patógeno necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una enfermedad que provoca serias mermas en la producción y tiene una incidencia anual promedio sobre la producción de la pampa húmeda del 10-20%. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan al final de la etapa de floración o durante el llenado de granos por lesiones en el receptáculo que pueden extenderse y afectar todo el capítulo, produciendo la caída del mismo. En estados avanzados de podredumbre, se forman esclerocios, estructuras de resistencia del hongo, que pueden permanecer en los tejidos o en suelo y mantenerse viables por más de 8 años constituyendo el inóculo para futuras infecciones. La resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol es compleja, habiéndose detectado varios loci de carácter cuantitativo (QTL) específicos de línea, órganos y condiciones ambientales de crecimiento. Dicha complejidad ha limitado el desarrollo de germoplasma resistente por medio del mejoramiento clásico, reforzando la necesidad de la utilización de herramientas genómicas que incluyan tanto marcadores neutros para el mapeo de QTL como el desarrollo de marcadores funcionales desarrollados sobre genes candidatos para la resistencia al patógeno. El conocimiento de los factores determinantes de la patogénesis y las respuestas de defensa del hospedante constituyen factores claves para la identificación de dichos genes candidatos. Uno de los aspectos más destacados del mecanismo de invasión de S. sclerotiorum es la degradación de la pared celular, siendo el ácido oxálico producido por el patógeno uno de los determinantes de la patogénesis, a través de la acidificación y el secuestro de Ca^2+ de la pared celular del tejido hospedante. Asimismo, el ácido oxálico ejerce una regulación dual de la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS). Por un lado, en los primeros estadios de la infección el ácido oxálico induce la generación de ROS y la inducción de una muerte celular programada (PCD) en una marera dependiente del pH generando un ambiente favorable para el desarrollo del patógeno, la adquisición de nutrientes y el establecimiento de la relación necrotrófica. Por el otro lado a medida que la infección progresa y al ácido oxálico se acumula en los tejidos del hospedante, el pH disminuye acompañado de la inhibición del estallido oxidativo y la PDC provocando así la muerte celular pero de una manera necrotrófica. En el presente trabajo se abordó el análisis del perfil metabólico primario, el perfil transcripcional de genes candidatos y los perfiles hormonales de dos líneas de girasol con comportamiento contrastante frente a la infección producida por S. sclerotiorum (HA 89 susceptible y RHA801 moderadamente resistente). Aplicando un método de estudio de perfiles metabólicos basado en la técnica de GC/MS, fue posible detectar diferentes patrones involucrando 63 metabolitos entre ellos azucares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y algunos metabolitos secundarios en flores de girasol que constituyen el órgano principal de infección de este patógeno. Los análisis estadísticos paramétricos y multivariados mostraron diferencias metabólicas entre estos dos líneas, así como también efectos de interacción entre línea y los días post inoculación. Los análisis de correlación de redes sugieren que estos cambios metabólicos están sincronizados en una manera dependiente del tiempo en respuesta al patógeno. Se detectaron mayor cantidad de cambios metabólicos diferenciales en la línea susceptible que en la resistente, esto se evidencia en el mayor número de interconexiones que presenta la línea susceptible entre los módulos de metabolitos formados por compuestos pertenecientes a las mismas vías. Por otro lado, la línea resistente muestra mayor interconexión entre metabolitos pertenecientes a las mismas vías. La evaluación de estos datos también demuestra una regulación línea específica de las distintas vías metabólicas, sugiriendo la importancia de detección de patrones metabólicos, en lugar de cambios específicos de metabolitos individuales, cuando se buscan marcadores metabólicos que responden diferencialmente a la infección der patógenos. Por otra parte el análisis de patrones de actividad de enzimas claves del metabolismo primario del carbono (sacarosa sintasa y las invertasas de pared celular, citológica y vacuolar), foto-respiración (catalasa) y del metabolismo de los fenilpropanoides (fenilalanina-amonio-liasa-PAL), mostró también diferencias entre líneas a tiempos tempranos del proceso de infección. La actividad catalasa presentó un aumento significativo en la línea resistente, que indicaría una regulación diferencial de la fotorespiración frente a la infección del patógeno, disminuyendo el nivel de ROS. Para la identificación de nuevos genes candidatos involucrados en la resistencia a este patógeno se construyeron colecciones de ADNc basadas en la técnica SSH de flores de girasol inoculadas y no inoculadas a partir de una línea resistente a los 2 y 4 días post inoculación. Esta estrategia dio como resultado la obtención de secuencias diferencialmente expresadas entre las flores inoculadas y no inoculadas. La mayoría de estos genes están involucrados en los procesos de traducción de proteínas, en los procesos de óxido reducción entre los cuales se encuentra un gran número de genes de respuesta a estreses biótico y abiótico, numerosos genes involucrados en el metabolismo primario. Del mismo modo, también se detectó un alto porcentaje de secuencias sin similitud con secuencias disponibles en bases de datos, sugiriendo que podrían codificar para genes no descriptos previamente, involucrados en la respuesta del girasol frente a este patógeno. De las clonotecas generadas se seleccionó un conjunto de genes para validar su comportamiento por qRT-PCR. De este conjunto, los genes quitinasa, un elemento de respuesta a etileno y el factor de transcripción WRKY7 mostraron patrones de expresión diferenciales entre las muestras inoculadas y controles a los distintos días post inoculación, sugiriendo que estos genes se encuentran involucrados en la respuesta del girasol frente a S. sclerotiorum. Asimismo se identificó un número importante de genes asociados a defensa a patógenos que se expresan en altos niveles en flores de girasol de la línea resistente aún en condiciones control, sin inoculación con el patógeno. Se estudiaron los perfiles hormonales para el ácido salicílico y para el ácido jasmónico por medio de la técnica LC-ESI-MS/MS. Estos estudios corroboraron que el ácido salicílico no contribuye a la resistencia contra S. sclerotiorum y que además se acumula en los tejidos infectados por este hongo, particularmente en la línea susceptible. A su vez, estos estudios demostraron que el jasmónico estaría asociado a la resistencia frente a este patógeno en las flores de girasol de la línea resistente. La integración del análisis de perfiles metabólicos, transcripcionales y perfiles hormonales contribuyó a una mejor comprensión de los cambios en el metabolismo en los capítulos de girasol durante los primeros estadios de la infección facilitando la identificación de genes y vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno necrotrófico S. sclerotiorum. Asimismo la identificación de cambios en perfiles metabólicos y transcripcionales de genes candidatos, entre líneas resistentes y susceptibles, posibilita el desarrollo de biomarcadores metabólicos y marcadores funcionales para su aplicación en el mejoramiento asistido del cultivo de girasol.Sclerotinia sclerotiorum, the causal agent of sunflower head rot, represents one of the main constrains in sunflower production in Argentina, with an average annual incidence of 10-20% of total yield of the main growing area, especially when flowering takes place during periods ofexcessive rainfall. The symptoms appeared at the end of the flowering stage or during grain filling, as water-soaked lesions on the receptacles. The fungus can decay the entire receptacle leaving only a bleached, shredded skeleton with large sclerotia. These sclerotia are resistance structures that can remain viable for more than 8 years in the soil and are main sources of inoculum for future infection. S. sclerotiorum resistance in sunflower is complex; several underlying QTLs were found to be specific for genotype, organ and environmental conditions. This complexity has limited the development of resistant genotypes by classical breeding, thus strengthening the need of using genomic tools such as neutral markers for QTL mapping and the development of functional markers based on candidate genes for resistance to this pathogen, for association mapping.. Insights into pathogenesis determinant factors and host defense responses are key factors for the identification of candidate genes. Degradation of plant cell wall is of major importance in the S. sclerotiorum invasion. Oxalic acid (OA) secreted by this pathogen induced pathogenesis by lowering the pH and chelating host cell-wall-Ca^2+ In the early stages of the infection process, low levels of OA elicits reactive oxygen species production (ROS) in host plant tissues, triggering programmed cell death and thus, creating a favorable environment for its development. As OA accumulates, the pH is lowered and the interaction becomes necrotrophic in nature, with the concomitant suppression of ROS and PCD, enabling further pathogen invasion of plant tissue. In the present work primary metabolic profiling, transcriptional profiling of candidate genes and phytohormone profiling was conducted in two sunflower inbred lines with contrasting behavior to S.sclerotiorum infection (HA89 susceptible, RHA801 resistant) Applying a metabolic profiling approach based on GC/MS, different patterns were identified, involving 63 metabolites including major and minor sugars and sugar alcohols, organic acids, amino acids, fatty acids and few soluble secondary metabolites in the sunflower capitulum, the main target organ of pathogen attack. Both point-by-point and non-parametric statistical analyses showed metabolic differences between genotypes as well as interaction effects between genotype and time after inoculation. Network correlation analyses suggested that these metabolic changes were synchronized in a time-dependent manner in response to the pathogen. Differential metabolic changes were detected to a higher extent in the susceptible line rather than in the moderate resistant line, this is in the susceptible line a higher number of interconnection are observed between modules composed by intermediates of the same pathway. Instead, in the resistant one, larger connections of metabolites within modules were detected. Evaluation of these data also demonstrated a genotype specific regulation of distinct metabolic pathways, suggesting the importance of detection of metabolic patterns rather than specific metabolite changes when looking for metabolic markers differentially responding to pathogen infection. The enzymatic activity analysis of key enzymes of the primary carbon (sucrose synthase and cell wall, cytosolic and vacuolar invertases), photorespiratory (catalase) and phenylpropanoid metabolism (phenylalanine ammonia-lyase -PAL-) showed differences between genotypes at early time point of the infection progress. A significant threefold increase in the catalase activity of the resistant genotype was observed, indicating a differential regulation in photorespiration in response to pathogen infection by lowering ROS levels. Subtractive cDNA libraries of inoculated and mock inoculated flowers at 2 y 4 DPI were constructed for identification of candidate genes involved in S. sclerotiorum resistance using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) method. Differentially expressed sequences between inoculated and mock inoculated flowers were obtained, including sequences coding for genes involved in protein transduction process, oxidorreduction process, genes involved in abiotic and biotic stress responses, genes involved in primary metabolism and a high number of sequences with no homology to sequences deposited in data bases, suggesting that they could be coding for new genes involved in sunflower response to S. Sclerotiorum. A group of 16 genes was selected for validating these libraries by qRT-PCR, genes coding for chitinase (AN: ABJ74186), Ethylene responsive element (AN: XP_002275892) and the transcription factor WRKY7 showed differential expression patterns between inoculated and mock inoculated flowers, suggesting that these genes are involved in sunflower response to S. sclerotiorum. Besides, a large number of defense-related genes were identified as constitutively expressed in mock inoculated flowers of the resistant genotype. Hormonal profiling analysis of Salicylic and jasmonic acid levels were determined by LC-ESI- MS/MS at different time points after inoculation in inoculated and mock inoculated sunflower flowers. These studies support the findings that SA does not contribute to resistance against S. sclerotiorum, moreover SA accumulation was induced in diseased tissues particularly in the susceptible genotype. Furthermore this work showed that JA was associated to resistance against this pathogen in sunflower capitula. The integration of metabolic, transcription and hormone profiling analysis contributed towards a better understanding of sunflower capitulum metabolism changes during the early stages of infection, greatly facilitate the selection of candidate genes for this plant-pathogen interaction, thus allowing the development of metabolic biomarkers and functional markers based on candidate genes, for application in sunflower breeding programs.Fil:Peluffo, Lucila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Cytological characterization of sunflower by in situ hybridization using homologous rDNA sequences and a BAC clone containing highly represented repetitive retrotransposon-like sequences

In the present work we report new tools for the characterization of the complete chromosome complement of sunflower (Helianthus annuus L.), using a bacterial artificial chromosome (BAC) clone containing repetitive sequences with similarity to retrotransposons and a homologous rDNA sequence isolated from the sunflower genome as probes for FISH. The rDNA signal was found in 3 pairs of chromosomes, coinciding with the location of satellites. The BAC clone containing highly represented retroelements hybridized with all the chromosome complement in FISH, and used together with the rDNA probe allowed the discrimination of all chromosome pairs of sunflower. Their distinctive distribution pat-tern suggests that these probes could be useful for karyotype characterization and for chromosome identification. The karyotype could be subdivided into 3 clear-cut groups of 12 metacentric pairs, 1 submetacentric pair, and 4 subtelocentric pairs, thus resolving previously described karyotype controversies. The use of BAC clones containing single sequences of specific markers and (or) genes associated with important agricultural traits represents an important tool for future locus-specific identification and physical mapping.Fil: Talia, Paola Monica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Greizerstein, Eduardo Jose. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; ArgentinaFil: Díaz Quijano, C.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; ArgentinaFil: Peluffo, Lucila. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Fernández, L.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Fernández, P.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Paniego, Norma Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Heinz, Ruth Amelia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Poggio, Lidia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; Argentin

Diseño experimental aplicado al diseño de hibridación en chips multi-arreglo

Una iniciativa conjunta del Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina y el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España, permitió el desarrollo de una matriz de alta densidad de oligonucleótidos (chip) para el girasol (Helianthus annuus),incluyendo aproximadamente 42K unigenes. El propósito de esta iniciativa fue el análisis de los perfiles de expresión génica en respuesta a factores bióticos y abióticos. Estos estudios se llevan a cabo en una red de laboratorios financiados a través del proyecto ANPCyT PAE 37100, que representan los sectores públicos, gubernamentales y privados en la Argentina. La disponibilidad de este chip ha dado y dará origen una serie de proyectos de genómica funcional en girasol. El chip, basado en tecnología Agilent, cuenta con un diseño de cuatro micromatrices (arreglos) por 44 K sondas lo que permite hibridar simultáneamente cuatro muestras. La disponibilidad de cuatro arreglos por chip, representa una ventaja desde el punto de vista del diseño experimental, pero al mismo tiempo introduce una innovación que debe ser considerada tanto al momento del diseño de las hibridaciones como en el análisis estadístico posterior.Sociedad Argentina de Informática e Investigación Operativ

On Wheels : food trucks

Fil: Foster, Patricia Laura. Universidad de San Andrés. Escuela de Negocios; Argentina.Fil: Peluffo, María Lucila. Universidad de San Andrés. Escuela de Negocios; Argentina."El crecimiento de la cantidad de food trucks en el país es un hecho innegable. En este sentido, en el presente escrito se procederá a desarrollar la manera en que se aprovechará dicha oportunidad mediante la adquisición de un terreno en la ciudad de Martínez para el alquiler de estacionamiento a vehículos gastronómicos o food trucks. El negocio operará bajo el nombre de On Wheels. El diferencial del presente negocio se basa en su carácter permanente, a diferencia de las ferias aleatorias, como también en el diseño y acondicionamiento del predio, volviéndose atractivo para los clientes. Asimismo, en la locación elegida no hay ningún negocio similar, y se detecta una gran densidad poblacional del segmento target. En efecto, el negocio busca unir la oferta de food trucks con su correspondiente demanda. Para cumplir con la propuesta, uno de los pilares más importantes del negocio es una gran inversión en marketing, que genere awareness y construcción marcaria, y que le permita a On Wheels ocupar un lugar preponderante en la mente de los clientes, tanto finales como intermedios. En base a estimaciones de demanda que se realizaron en 10 restaurantes cercanos a la ubicación elegida, a entrevistas en la feria Gastronómada y Food Fest BA, y teniendo en cuenta la densidad poblacional, se ha llegado a concluir que On Wheels enfrentaría, en un primer momento, una demanda semanal aproximada de 1.060 personas, lo que es igual a una demanda mensual de 4.240 personas. Al cabo de 3 años se estima poder alcanzar una demanda mensual de 7.380 personas. En cuanto a los rasgos económicos del proyecto, la inversión inicial será de USD 288.776 y se la recuperaría en el mes 29. Se calcula un VAN de USD 110.696 y una TIR del 34%."Barraza, Santiag

Sunflower germin-like protein HaGLP1 promotes ROS accumulation and enhances protection against fungal pathogens in transgenic Arabidopsis thaliana

Germin-like proteins (GLPs) are a large, diverse and ubiquitous family of plant glycoproteins belonging to the Cupin super family. These proteins have been widely studied because of their diverse roles in important plant processes, including defence. The novel sunflower gene HaGLP1 encodes the first germin-like protein characterized from the family Asteraceae. To analyse whether constitutive in vivo expression of the HaGLP1 gene may lead to disease tolerance, we developed transgenic Arabidopsis plants that were molecularly characterized and biologically assessed after inoculation with Sclerotinia sclerotiorum or Rhizoctonia solani. HaGLP1 expression in Arabidopsis plants conferred tolerance to S. sclerotiorum at the first stages of disease and interfered with R. solani infection, thus giving rise to significant protection against the latter. Furthermore, HaGLP1 expression in Arabidopsis plants elevated endogenous ROS levels. HaGLP1-induced tolerance does not appear to be related to a constitutive induction of the plant defence or the ROS-related genes examined here. In conclusion, our data suggest that HaGLP1 is an interesting candidate for the engineering of plants with increased fungal tolerance and that this gene could also be useful for the selection of naturally overexpressing sunflower genotypes for conventional breeding purposes.Instituto de BiotecnologíaFil: Beracochea, Valeria Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Almasia, Natalia Ines. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Peluffo, Lucila. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Nahirñak, Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Paniego, Norma Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Heinz, Ruth Amelia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Vazquez Rovere, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Lia, Veronica Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

Development, Characterization and Experimental Validation of a Cultivated Sunflower (<em>Helianthus annuus</em> L.) Gene Expression Oligonucleotide Microarray

<div><p>Oligonucleotide-based microarrays with accurate gene coverage represent a key strategy for transcriptional studies in orphan species such as sunflower, <em>H. annuus L.</em>, which lacks full genome sequences. The goal of this study was the development and functional annotation of a comprehensive sunflower unigene collection and the design and validation of a custom sunflower oligonucleotide-based microarray. A large scale EST (>130,000 ESTs) curation, assembly and sequence annotation was performed using Blast2GO (<a href="http://www.blast2go.de">www.blast2go.de</a>). The EST assembly comprises 41,013 putative transcripts (12,924 contigs and 28,089 singletons). The resulting Sunflower Unigen Resource (SUR version 1.0) was used to design an oligonucleotide-based Agilent microarray for cultivated sunflower. This microarray includes a total of 42,326 features: 1,417 Agilent controls, 74 control probes for sunflower replicated 10 times (740 controls) and 40,169 different non-control probes. Microarray performance was validated using a model experiment examining the induction of senescence by water deficit. Pre-processing and differential expression analysis of Agilent microarrays was performed using the Bioconductor limma package. The analyses based on p-values calculated by eBayes (p<0.01) allowed the detection of 558 differentially expressed genes between water stress and control conditions; from these, ten genes were further validated by qPCR. Over-represented ontologies were identified using FatiScan in the Babelomics suite. This work generated a curated and trustable sunflower unigene collection, and a custom, validated sunflower oligonucleotide-based microarray using Agilent technology. Both the curated unigene collection and the validated oligonucleotide microarray provide key resources for sunflower genome analysis, transcriptional studies, and molecular breeding for crop improvement.</p> </div

qPCR results for ten selected differentially expressed genes.

<p>qPCR results for ten selected differentially expressed genes.</p

Box-plot of the normalized expression in each replicate of both treatments.

<p>Base line at 4.7 describes a sensitivity limit for detection of changes in RNA concentration.</p

CV estimation for technical and biological replicates.

<p>RC: relative concentration.</p><p>CT: control.</p><p>WD: water deficit.</p><p>Technical variability within biological replicates (columns: CT1, CT3, WD1, WD2); technical variability plus biological variability within each treatment (Columns: CT and WD).</p

Pie charts showing predicted gene products using Gene Ontology terms.

<p>Data was obtained from SUR v 1.0.</p