El receptor nicotíco α7 y la inflamación: modulación endógena por dupα7 y vías de señalización involucradas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de Lectura: 17 de febrero 2014.Los receptores nicotínicos neuronales para la acetilcolina del subtipo α7 (α7 nAChR), se encuentran ampliamente distribuidos en SNC y periférico, así como en células de naturaleza no neuronal, como queratinocitos, astrocitos, linfocitos, microglía, monocitos y macrófagos. En neuronas, el α7 nAChR presináptico modula la liberación de numerosos neurotransmisores, mientras que aquél situado postsinápticamente induce impulsos excitatorios en la correspondiente neurona. Adicionalmente, la activación de este receptor se ha asociado a fenómenos de plasticidad neuronal y supervivencia celular en SNC, mientras que en células no neuronales dicha activación regula procesos relacionados con la migración, neo-angiogénesis, proliferación, muerte celular e inflamación. Las múltiples funciones asignadas al α7 nAChR permiten deducir que una deficitaria actividad y/o una reducida expresión del mismo hayan sido implicadas en la etiopatogenia de ciertas enfermedades como el Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia, neoplasias o en aquellas que cursan con una excesiva respuesta inflamatoria/inmune. Todo lo anterior justifica nuestro interés por el estudio de mecanismos de modulación endógena de este subtipo de receptor, así como por la identificación de nuevas vías de señalización implicadas en alguna de sus funciones. En el año 2011, nuestro grupo demostró, por primera vez, el papel funcional del gen CHRFAM7A resultante de la duplicación parcial del gen CHRNA7 que codifica para la subunidad nicotínica α7. El gen duplicado, solo presente en el genoma humano, codifica para una nueva subunidad nicotínica (dupα7) que actúa como regulador endógeno negativo de la actividad del α7 nAChR en ovocitos de Xenopus. Dada la gran homología entre las secuencias peptídicas de α7 y dupα7, no existe actualmente ningún anticuerpo específico capaz de distinguir entre una u otra subunidad nicotínica. Esta limitación ha impedido conocer el mecanismo por el que dupα7 ejerce su efecto sobre el α7 nAChR en ovocitos, así como si dicho efecto también se produce en células de mamíferos y, en caso afirmativo, cual es su posible repercusión funcional en células que expresan endógenamente α7 y dupα7, como las neuronas o los macrófagos humanos. En esta tesis se ha tratado de dar respuesta a estas cuestiones mediante la preparación de diversas construcciones conteniendo los ADNc de α7 y dupα7 marcados con diferentes epítopos o proteínas de fusión, utilizando para ello técnicas de ADN recombinante. Tras expresar estas construcciones en varias líneas celulares de mamíferos, se ha recurrido a utilizar una combinación de técnicas, incluyendo las de biología celular y molecular, bioquímicas, inmunocitoquímica y de microscopía confocal, con objeto de analizar la interacción de las subunidades nicotínicas expresadas. Nuestros resultados revelan que ambas subunidades interaccionan físicamente entre sí generando receptores mixtos α7/dupα7 en la membrana celular así como en el RE. Más aún, nuestros resultados permiten constatar que la formación de estos receptores mixtos en la membrana de células inmunes transfectadas con dupα7 tiene consecuencias funcionales; así, el efecto antiinflamatorio de nicotina observado tras la activación del α7 nAChR homomérico es parcialmente revertido cuando se trata del receptor mixto α7/dupα7. Adicionalmente, en esta tesis se ha logrado identificar una nueva vía de señalización inducida por nicotina en macrófagos humanos. Esta vía, iniciada por la activación del α7 nAChR y la consiguiente señalización a través de JAK2/STAT3/PI3K, conduce a la sobreexpresión de la serina/treonina quinasa-M asociada al receptor de interleuquina-1 (IRAK-M), un regulador negativo de la respuesta inmune innata mediada por TLR. Nuestros datos demuestran que el incremento de expresión de IRAK-M está implicado en el efecto antiinflamatorio así como en la generación de un estado de “tolerancia” inducido por nicotina en macrófagos. Ambos efectos de nicotina sobre los macrófagos pueden explicar las diferencias de riesgo y evolución clínica observadas entre pacientes fumadores y no fumadores que sufren ciertas patologías infecciosas o inmunes

Human α6β4 nicotinic acetylcholine receptor: heterologous expression and agonist behavior provide insights into the immediate binding site

Study of α6β4 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) as a pharmacological target has recently gained interest because of their involvement in analgesia, control of catecholamine secretion, dopaminergic pathways, and aversive pathways. However, an extensive characterization of the human α6β4 nAChRs has been vitiated by technical difficulties resulting in poor receptor expression. In 2020, Knowland and collaborators identified BARP (β-anchoring and regulatory protein), a previously known voltage-gated calcium channel suppressor, as a novel human α6β4 chaperone. Here, we establish that co-expression of human BARP with human α6β4 in Xenopus oocytes, resulted in the functional expression of human α6β4 receptors with acetylcholine-elicited currents that allow an in-depth characterization of the receptor using two electrode voltage-clamp electrophysiology together with diverse agonists and receptor mutations. We report: 1) an extended pharmacological characterization of the receptor, and 2) key residues for agonist-activity located in or near the first shell of the binding pocket. SIGNIFICANCE STATEMENT: The human α6β4 nicotinic acetylcholine receptor has attained increased interest because of its involvement in diverse physiological processes and diseases. Although recognized as a pharmacological target, development of specific agonists has been hampered by limited knowledge of its structural characteristics and by challenges in expressing the receptor. By including the chaperone β-anchoring and regulatory protein for enhanced expression and employing different ligands, we have studied the pharmacology of α6β4, providing insight into receptor residues and structural requirements for ligands important to consider for agonist-induced activation

Defects in G-Actin Incorporation into Filaments in Myoblasts Derived from Dysferlinopathy Patients Are Restored by Dysferlin C2 Domains

International audienceDysferlin is a transmembrane C-2 domain-containing protein involved in vesicle trafficking and membrane remodeling in skeletal muscle cells. However, the mechanism by which dysferlin regulates these cellular processes remains unclear. Since actin dynamics is critical for vesicle trafficking and membrane remodeling, we studied the role of dysferlin in Ca2+-induced G-actin incorporation into filaments in four different immortalized myoblast cell lines (DYSF2, DYSF3, AB320, and ER) derived from patients harboring mutations in the dysferlin gene. As compared with immortalized myoblasts obtained from a control subject, dysferlin expression and G-actin incorporation were significantly decreased in myoblasts from dysferlinopathy patients. Stable knockdown of dysferlin with specific shRNA in control myoblasts also significantly reduced G-actin incorporation. The impaired G-actin incorporation was restored by the expression of full-length dysferlin as well as dysferlin N-terminal or C-terminal regions, both of which contain three C2 domains. DYSF3 myoblasts also exhibited altered distribution of annexin A2, a dysferlin partner involved in actin remodeling. However, dysferlin N-terminal and C-terminal regions appeared to not fully restore such annexin A2 mislocation. Then, our results suggest that dysferlin regulates actin remodeling by a mechanism that does to not involve annexin A2