Macrophages Candida albicans infection upon bacterial endotoxin priming

Dissertação de mestrado em Bioquiímica , apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Candida albicans é o microorganismo mais prevalente nos casos de infecções fúngicas em humanos, principalmente entre a população de doentes immunocomprometidos, incluindo doentes com septicémia, nos quais a incidência de infecções por fungos têm vindo a aumentar. Nestas situações, a deficiência imunológica permite ao fungo suprimir os mecanismos de defesa do hospedeiro. A influência do estado de septicémia, que inclui uma resposta inflamatória generalizada e severa, no desfecho da infecção fúngica, é uma área pouco estudada. Nestes casos, a infecção fúngica pode resultar da falta de reconhecimento pelo sistema imunitário ou uma resposta inflamatória aguda. Este trabalho teve como objectivo estudar o efeito de macrófagos pré-activados com lipopolissacárido bacteriano, um agente inflamatório, na resposta do hospedeiro à infecção por C. albicans. Em particular, a viabilidade dos macrófagos, das leveduras internalizadas e a resposta inflamatória mediada pela libertação de citocinas do macrófago. A principal conclusão tirada deste estudo é que uma exposição aguda, embora curta, dos macrófagos à endotoxina de Escherichia coli, não aumenta a resposta imunitária à infecção fúngica. Em primeiro lugar, foi detectado um aumento na produção da citocina TNF-α quando o macrófago é estimulado, durante uma hora, com LPS e seguidamente infectado com C. albicans. Um aumento da viabilidade do número de leveduras internalizadas pelos macrófagos foi observado. Do mesmo modo, o fagolisossoma parece mais activado. Contudo, e muito importante, nestas condições a viabilidade dos macrófagos sofre um ligeiro decréscimo. Compreender os mecanismos biológicos associados a infecções por fungos, aquando de uma resposta inflamatória aguda, seria uma importante contribuição no desenvolvimento de tratamentos mais eficazes destas infecções em doentes com septicémia.Candida albicans is the most prevalent fungal species in human fungal infections, mostly among the immunocompromised population, including patients suffering from severe sepsis, in which the incidence of invasive fungal infection has been increasing. In these situations, the immunological deficiency allows the fungi to overcome the protective host defense mechanisms. However, the influence of sepsis, which induces a severe inflammatory response, in the outcome of C. albicans infection is an interesting field. In these cases does the fungal disease result from a lack of recognition by the innate immune system or overreaction of the inflammatory response? The main goal of this work was to study the effect of macrophages priming by bacterial endotoxin (LPS), the major inflammatory mediator, in the outcome of C. albicans infection. In particular, the viability of infected macrophages and internalized yeast, C. albicans escape mechanisms and the inflammatory response mediated by the macrophages release of cytokine. The main conclusion of this study is that a short, but severe exposure of the macrophages to bacterial endotoxin, does not enhance the immune response to a subsequent C. albicans infection. First, an increase in the proinflammatory cytokine TNF-α was detected when macrophages were stimulated with LPS for one hour and then infected with C. albicans. Then, a slight decrease in the viability of internalized fungi was observed, and cellular phagolysosome activated. However, and most importantly, macrophages viability decreases slightly in this situation. Understanding the biological mechanisms associated with the fungal infection upon a severe inflammatory response, would be a major contribution to the development of efficient treatment of invasive fungal infections among patients with severe sepsis

Aplicação das normas IFS, BRC e ISO 22000 na metodologia yourStep®

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia AlimentarO presente trabalho centra-se no relato das atividades desenvolvidas durante o estágio curricular realizado na empresa VLM Consultores. Este estágio foi cumprido com vista à finalização do Mestrado em Biotecnologia Alimentar. A segurança alimentar é cada vez mais um tema pertinente no ramo alimentar. A unidade de Segurança Alimentar, da VLM Consultores, centra-se assim na prestação de serviços de consultoria de gestão no ramo alimentar. A atividade central deste estágio baseou-se na implementação de um sistema de gestão da segurança alimentar na plataforma yourSTEP, que possa ser adaptado aos vários referenciais normativos usados no ramo alimentar, a norma ISO 22000:2005, a norma IFS Food versão 6 e a norma BRC Food versão 6. Foram criados procedimentos e outra documentação obrigatória para responder aos requisitos de cada uma das normas aqui abordadas. Através deste trabalho foi possível compreender cada referencial normativo e o nível de adaptação necessário por parte das empresas do sector aos mesmos, de forma a responderem às crescentes necessidades e exigências do mercado.The present study focus in the description of the activities undertaken during the internship in VLM Consultores in order to complete the MsC in Food Biotechnology. Food safety is nowadays an important theme in the food industry. VLM Consultores’ Food Safety Unit focus on providing consulting services to the food industries. The main objective of this internship was the implementation of a food safety management system, in the yourSTEP platform, that can be adapted to the diferente standards applied in this field of work, ISO 22000:2005, IFS Food 6th version and BRC Food 6th version. Procedures have been developed as long as other mandatory documents in order to ensure compliance with each standard’s requirements. It was possible, through this essay, to perceive each standard and the level of adaptation required by this sector’s organizations, in order to respond to the market’s increasing needs and demands

Lessons learned on the safety of GLP-1 receptor agonists from post-marketing experience

Tese de mestrado, Mestrado em Regulação e Avaliação do Medicamento e Produtos de Saúde, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Diabetes Mellitus (DM) is one of the most important diseases at public health level around the world. Over the last 25 years there has been a dramatic increase in the number of people with diabetes around the world. In Portugal, in 2014 the estimated prevalence of Diabetes in population with ages between 20 and 79 years was 13.1%, i.e. more than 1 million of Portuguese people in this age range had Diabetes. During the last decade, in Portugal, it has been observed a significant decrease in the number of potential years of life, lost by DM. Diabetes assumes a preponderant role in the causes of death, and it was the cause of 4.0% of deaths occurred in 2014. The treatment of diabetes has come a long way in the last century. Starting with the discovery of insulin in 1921, it has seen also the development of antidiabetic drugs. In recent years, newer drugs have become available, targeting specific components of the spectrum of pathophysiologic abnormalities, regulating glucose input, and also addressing glucose utilization and disposal through impacts on insulin resistance and insulin deficiency. The Glucagon-Like Peptide-1 receptor (GLP-1R) agonists mimic the GLP-1 function in order to enhance insulin secretion after food-intake, restoring the incretin function, while being protected from the DPP-4 deactivation. This is achieved by binding to a GLP-1R that resides in the β-cell. This work focused on drawing a safety profile for GLP-1R agonists and conclude on the need and/or opportunity of adapting their Risk Management Plans (RMPs) for the new markets, taking into account the safety data collected both in EU and U.S. The methodology herein used was based on the comparison nonclinical and clinical data and RMPs for each medicinal product. Following this, it was presented a resume table identifying the risks considered by European Medicines Agency (EMA) and those ones accepted by U.S. Food and Drug Administration (FDA). After that, a comparison of adverse reactions reported both in European Union (EU) and U.S. within each medicinal product was performed. It was concluded that the relevant safety information identified in the nonclinical phase was assessed and observed during the clinical phase. The results obtained from all the nonclinical and clinical studies were resumed in the RMP. When observing the post-marketing data, collected from the public databases of adverse reactions reports, it was realized that, although some exceptions, the risks identified previously were the ones mostly reported. In general, the safety concerns identified were similar to all GLP-1R agonists. Regarding the European and the U.S. data several discrepancies were identified, namely on what concerns to the malignancies occurrence. It became clear that the occurrence of adverse reactions was associated both to the pharmaceutical formulation of the medicinal products and to their mechanism of action. Although there are some areas of special concern which require further and thorough analysis (namely the occurrence of cardiovascular (CV) adverse effects and thyroid or pancreatic cancers), it was concluded that all safety concerns are very well monitored and followed either by the EMA/FDA or by the Marketing Authorisation Holders (MAHs). As final conclusion, it was clear that the safety profile of GLP-1R agonists remain unchanged after this evaluation and no additional minimisation measures, other than those already defined and implemented, seem to be necessary, and, therefore, the RMPs do not need to be updated.A Diabetes Mellitus (DM) é uma das doenças mais importantes para a saúde a nível mundial. Durante os últimos 25 anos houve um aumento dramático no número de pessoas com diabetes em todo o mundo. Em Portugal, em 2014 a prevalência estimada de Diabetes na população com idades compreendidas entre os 20 e os 79 anos era de 13.1%, isto é, mais de 1 milhão de Portugueses nesta faixa etária tinham Diabetes. Durante a última década, em Portugal, houve uma redução significativa do número de anos de vida, perdidos devido à DM. A Diabetes assume um papel preponderante entre as causas de morte, sendo a responsável por 4% das mortes ocorridas em 2014. O tratamento da diabetes percorreu um longo caminho no século passado. Começando com a descoberta da insulina em 1921, tendo-se também assistido a um grande desenvolvimento de medicamentos antidiabéticos. Nos últimos anos, novos medicamentos ficaram disponíveis, cujos alvos são componentes específicos do espectro das deficiências fisiopatológicas, regulando a entrada de glicose e também a utilização e eliminação de glicose através de ações na resistência à insulina e deficiência de insulina. Os agonistas do recetor do peptídeo-1 semelhantes ao glucagon (GLP-1R) imitam a função do GLP-1 de modo a aumentar a secreção de insulina após a ingestão de alimentos, restaurando a função incretina, enquanto são simultaneamente protegidos da desativação pelo DPP-4. Esta ação é alcançada pela sua ligação ao GLP-1R que se encontra na célula β. Este trabalho focou-se no desenho de um perfil de segurança para os agonistas do GLP-1R com vista a apurar a necessidade de adaptação dos Planos de Gestão de Risco (RMPs) aos novos mercados, tendo em conta os dados de segurança recolhidos na Europa (EU) e nos Estados Unidos (U.S.). A metodologia utilizada baseou-se na comparação dos dados não-clínicos e clínicos com os RMPs para cada medicamento. Apresentou-se em formato tabelar um resumo dos riscos considerados pela Agência Europeia do Medicamento (EMA) e os riscos aceites pela U.S. Food and Drug Administration (FDA). Após esta abordagem, foi realizada uma comparação entre as reações adversas reportadas na EU e nos U.S. para cada um dos medicamentos. Concluiu-se que a informação de segurança relevante identificada na fase não-clínica foi avaliada e observada durante a fase clínica. Os resultados obtidos nos estudos não-clínicos e clínicos foram resumidos no RMP. Pela observação dos dados pós-marketing, obtidos a partir das bases de dados públicas de notificações de reações adversas, concluiu-se que, apesar de algumas exceções, os riscos identificados anteriormente são os mais reportados. Em geral, os problemas de segurança identificados são semelhantes para todos os agonistas GLP-1R. Relativamente aos dados da EU e dos U.S., várias discrepâncias foram detetadas, nomeadamente no que se refere à ocorrência de tumores. Tornou-se evidente que a ocorrência de reações adversas está dependente quer da forma farmacêutica dos medicamentos quer do mecanismo de ação dos mesmos. Embora existam várias áreas de especial atenção que requerem mais e minuciosa análise (nomeadamente a ocorrência de efeitos adversos cardiovasculares (CV) e de cancros da tiroide e pancreáticos), considera-se que todos os problemas de segurança estão bem monitorizados e seguidos tanto pela EMA/FDA como pelos titulares de autorização de introdução no mercado (MAHs). Como conclusão, percebeu-se que o perfil de segurança dos agonistas GLP-1R permaneceu inalterado após esta avaliação. Deste modo, não parece ser necessário propor novas medidas de minimização de risco, para além das já definidas e implementadas, pelo que não é necessário atualizar os RMPs

Estudo de digestão anaeróbia de resíduos sólidos agro-alimentares em instalação piloto

Hoje em dia são várias as energias “verdes” que beneficiam de forma inequívoca o meio ambiente, de modo a aproveitar recursos naturais disponíveis na natureza. Entre todos os tipos de energias limpas, surge a produção de biogás. É de notar que apesar de ser uma forma de energia já utilizada há muitos anos, esta pode ser melhorada através de uma gestão adequada de todos os recursos envolvidos na sua produção. Consegue-se desta forma, optimizar a produção de biogás, contribuindo para uma rentabilização do funcionamento de uma instalação. Para esta optimização é necessária uma análise e caracterização detalhada dos resíduos utilizados na geração desta energia. O presente trabalho foca-se no estudo da produção de biogás através de digestão anaeróbica. Este trabalho baseia-se num estudo real de produção de biogás, num reactor à escala semi-industrial, e com uma temperatura de trabalho em regime mesofílico (37°C). O substrato utilizado para a alimentação deste reactor foi cedido por uma conhecida indústria do ramo alimentar e consistia numa mistura de “casca” de batatas e lamas, numa proporção de 30% e 30% respectivamente. Em termos de resultados Óbidos neste projecto, verificou-se uma redução de cerca de 40% dos sólidos totais, o que indicia, aparentemente, a existência de dificuldades na hidrólise dos compostos em suspensão. A remoção orgânica na sua globalidade oscilou numa ampla gama de valores, com um valor médio de cerca 50%. A larga variedade de resultados pode estar relacionada com a heterogeneidade da amostra da alimentação. Apesar da existência de algumas dificuldades inerentes à realização do trabalho prático, concluiu-se que o substrato utilizado neste estudo revela grande potencial de produção de biogás

Estudo do controlo pós-transcricional da hemojuvelina e sua influência na homeostase do ferro

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Uma classe importante das doenças humanas é representada por doenças hereditárias associadas à homeostase do ferro, entre as quais se destaca a Hemocromatose Hereditária (HH). Esta caracteriza-se por uma alteração dos mecanismos que regulam a absorção do ferro, levando ao aumento progressivo deste no organismo. Um dos tipos de HH é a Hemocromatose Juvenil (2A) causada por mutações no gene da hemojuvelina (HJV), envolvido na regulação do metabolismo do ferro através da modulação directa da transcrição do gene da hepcidina. De maneira a perceber o papel do controlo pós-transcricional do gene HJV na homeostase do ferro foram analisados vários aspectos do metabolismo dos transcritos HJV, nomeadamente ao nível do splicing, do controlo de tradução por grelhas de leitura a montante da grelha de leitura principal (uORFs) e a sua degradação pelo mecanismo de decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (NMD). Foi analisado o padrão de splicing em diferentes tecidos, transfectados e não transfectados, e os resultados indicam que o transcrito que codifica a proteína funcional não é produzido em quantidades elevadas, provavelmente fruto de um controlo rigoroso ao nível do splicing alternativo. Foi ainda detectada uma variante de splicing inicialmente referida no artigo de Papanikolaou e colaboradores (2004), mas cuja sequência não se encontra anotada nas bases de dados do transcriptoma. Verificou-se também que a HJV tem duas uORFs funcionais que inibem consideravelmente a eficiência de tradução da ORF principal, tendo a uORF1 um papel mais preponderante nesta inibição. O reconhecimento do AUG principal é feito, pelo menos, através do mecanismo de leaky scanning. Foi ainda demonstrado através de construções repórter que as uORFs da HJV são passíveis de induzir o NMD, sugerindo fortemente que na sua forma nativa o transcrito da HJV pode ser regulado por este mecanismo.An important class of human diseases is represented by inherited disorders related do iron homeostasis, among which is Hereditary Hemocromatosis (HH). It is characterized by an alteration of the mechanisms that regulate iron absorption, leading to its progressive increase in the body. Juvenile Hemocromatosis (2A) is a type of HH, caused by mutations in the hemojuvelin (HJV) gene, involved in the regulation of iron metabolism through direct modeling of the transcription of the hepcidin gene. In order to understand the role of the post-transcriptional control of the HJV gene in iron homeostasis, several aspects of the transcript metabolism were analyzed, namely its splicing pattern, its translational control through upstream open reading frames (uORFs) and its degradation through the nonsense mediated mRNA decay (NMD) mechanism. The splicing pattern was analyzed in different transfected and non transfected tissues, and the results reveal that the transcript that codifies for the functional protein is not easily detected, suggesting it is not present at high levels, probably due to a rigorous control at the alternative splicing level. Moreover, a splicing variant was detected, initially referred in Papanikolaou et al (2004), whose sequence, however, is not annotated in transcriptome databases. Additionally, we have observed that HJV mRNA has two functional uORFs which considerably inhibit the translational efficiency of the main ORF, having the first uORF a more prominent role in the translational control. The recognition of the main ORF is achieved, at least, by leaky scanning. It was also demonstrated through reporter constructions that HJV´s uORFs are sensitive to NMD, strongly suggesting that the native HJV mRNA could be naturally regulated by this mechanism

The impact of coronavirus on consumer behaviour in supermarket goods: the use of retail platforms/applications

Dissertation presented as the partial requirement for obtaining a Master's degree in Information Management, specialization in Marketing IntelligenceThe pandemic leads the world today and changed the consumer behaviour in numerous ways. The consumers were almost forced to change their habits immediately. Regarding the world economy, the pandemic is heading towards a global recession since March 2020. In this master thesis the objective is to study the impact of coronavirus in the consumer behaviour, more precisely in the supermarket goods. It is presented an empirical study within a real e-commerce usage context. Data were analysed with SEM/PLS method. The results indicate that behavioural intention and risk have a positive and significant impact on behavioural use, i.e., they are determinants of intention to use retail e-commerce platforms.Atualmente, a pandemia lidera e mudou o comportamento do consumidor de inúmeras maneiras. Os consumidores foram quase forçados a mudar imediatamente os seus hábitos. Relativamente à economia mundial, a pandemia está a caminhar para uma recessão global desde Março de 2020. Nesta dissertação, o objetivo é estudar o impacto do coronavírus no comportamento do consumidor, mais precisamente nos produtos de supermercado. É apresentado um estudo empírico dentro de um contexto real de utilização do comércio eletrónico. Os dados foram analisados com o método SEM/PLS. Os resultados indicam que a intenção comportamental e o risco têm um impacto positivo e significativo na utilização comportamental, ou seja, são determinantes para a intenção de utilizar plataformas de comércio eletrónico de retalho

Exploring anti-tuberculosis drugs through green solvents for effective treatment of tuberculosis

Tuberculosis is an airborne infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis that remains to be one of the deadliest infectious diseases worldwide. Despite being considered treatable, the treatment of this disease involves a combination of different antibacterial drugs administrated for several months. This may cause serious adverse effects and lead to low treatment compliance by the patient, contributing to the ineffectiveness of the therapy and the emergence of drug resistance. The approaches used for treating tuberculosis are the same since their development, around 50 years ago. Therefore, and given the emergence and persistence of drug resistance to the various antibiotics used, it is of the utmost importance to conduct a breakthrough investigation to find alternatives able to rapidly reduce the incidence of tuberculosis, mainly in low-income countries. Considering the drawbacks of tuberculosis therapy, it is proposed in this work to explore alternative strategies to address long term therapies and poor patient compliance, which include the use of alternative solvents, such as ionic systems, therapeutic liquid mixtures, and supercritical fluid technology. In a first step, the preparation of ionic systems (organic salts) and eutectic mixtures incorporating anti-tuberculosis drugs in their structure were explored. Then, all prepared compounds were fully characterized both in terms of their physicochemical properties and their in vitro biological performance through a myriad of different procedures and techniques, such as polarized optical microscopy, differential scanning calorimetry, nuclear magnetic resonance, infrared spectroscopy, solubility, permeability (using Franz cells and transwell inserts), cytotoxicity in different cell lines, antibacterial activity, among others. Additionally, eutectic mixtures were prepared by dissolving first-line treatment anti-tuberculosis drugs and an organic salt (isoniazid di-chloride, [INH][Cl]2) in the system composed by citric acid, ethambutol, and water in a ratio of 1:1:5. In order to obtain inhalable particles for targeted site-infection delivery of these formulations, supercritical fluid technology was used to encapsulate the eutectic mixtures and formulate biocompatible particles with a suitable size for pulmonary administration. In general, the main objectives of the work were achieved, being the alternative strategies explored (ionic systems, eutectic mixtures, and supercritical fluid technology) capable to improve some essential characteristics of anti-tuberculosis drugs, in particularly, its solubility and stability. Hereupon, their potential should be further explored with different and more complex biological models.A tuberculose é uma doença infeciosa transmitida por via aérea, causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, continuando a ser uma das doenças infeciosas que causa maior mortalidade mundialmente. Apesar de existir um tratamento eficaz para a tuberculose, este engloba uma combinação de diferentes antibióticos administrados durante vários meses, o que pode causar efeitos adversos graves e, consequentemente, levar à reduzida adesão ao tratamento pelo paciente, o que contribui para a ineficácia do tratamento e aparecimento de resistência aos diferentes antibióticos. O tratamento e a combinação de fármacos utilizada na tuberculose é o mesmo desenvolvido há mais de 50 anos. Posto isto, e considerando também o aparecimento e persistência da resistência aos vários antibióticos utilizados, torna-se urgente o avanço da investigação de forma a encontrar alternativas capazes de reduzir a incidência da tuberculose, principalmente em países subdesenvolvidos. Considerando os problemas existentes na terapia da tuberculose, o objetivo desta tese é explorar estratégias alternativas que visem melhorar as abordagens terapêuticas utilizadas no seu tratamento, as quais incluem o uso de solventes sustentáveis alternativos, como sistemas iónicos, misturas eutécticas e tecnologia supercrítica. Inicialmente, foram preparados diferentes sistemas iónicos (sais orgânicos) e misturas eutécticas que incluem na sua estrutura fármacos utilizados na terapêutica da tuberculose. De seguida, os sistemas foram caracterizados, relativamente às suas propriedades físico-químicas e biológicas através de diferentes técnicas e abordagens, tais como microscopia ótica de luz polarizada, calorimetria diferencial de varrimento, ressonância magnética nuclear, espectroscopia de infravermelho, solubilidade, permeabilidade (usando células de Franz e inserts transwell), citotoxicidade em diferentes linhas celulares, entre outras. Além de misturas eutécticas, também foram preparadas diferentes formulações baseadas na mistura composta por ácido cítrico, etambutol e água no rácio 1:1:5, em que foram dissolvidos diferentes fármacos utilizados na primeira linha de tratamento da tuberculose e um sal orgânico (di-cloreto de isoniazida, [INH][Cl]2). De modo a obter partículas inaláveis que possam ter uma ação específica no local da infeção, foi utilizada tecnologia supercrítica para encapsular as misturas líquidas e formular partículas biocompatíveis e com um tamanho adequado à administração pulmonar. Em geral, os principais objetivos deste trabalho foram alcançados, tendo sido exploradas diferentes estratégias alternativas (sistemas iónicos, misturas eutécticas e tecnologia supercrítica), capazes de melhorar algumas características essenciais dos fármacos administrados na tuberculose, como a sua solubilidade e estabilidade. Considerando os resultados obtidos neste trabalho e o potencial apresentado por este tipo de compostos, é importante continuar a estudar as suas propriedades e explorar as suas potencialidades em modelos biológicos mais complexos