Generation and Repair of DNA damage caused by DNA-Alkylation in mouse and human hematopoietic cells

Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Frage, ob und gegebenenfalls wie sich Stamm- und Vorläuferzellen in ihrer Antwort auf genotoxischen Stress von weiter differenzierten Zellen der gleichen Entwicklungslinie unterscheiden. Experimentell untersucht wurde dies am Modell der murinen und der humanen Hämatopoese, weil hier Zellen unterschiedlicher Differenzierungsstufen bereits relativ gut charakterisiert sind, sich mit etablierten Methoden beispielsweise aus Knochenmark oder Nabelschnurblut isolieren lassen und ex vivo kultiviert werden können. Als DNA-reaktive Substanz wurde aus der Gruppe monoalkylierenden Verbindungen das Zytostatikum Temozolomid (TMZ) ausgewählt, dessen Stammzell-toxisches Potential und seine ausgeprägte Knochenmark- schädigende Wirkung ein erhebliches Problem in der onkologischen Klinik darstellen. Aus Untersuchungen an Zell-Linien war bekannt, dass (i) die zytotoxische Wirkung fast ausschließlich von dem Alkylierungsprodukt O6-Methylguanin (O6-meG) ausgeht, obwohl es nur einen geringen Teil (6 %) aller TMZ-induzierten DNA-Schäden darstellt. Dieses Addukt (ii) wird in den meisten Säugerzellen effizient durch die Methyltransferase MGMT aus der genomischen DNA eliminiert. Deshalb wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht welche biologischen Konsequenzen ein durch MGMT-Gentransfer erhöhte Reparaturkapazität für dieses Addukt in primären Stamm-/ Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems der Maus und in murinen hämatopoetisvchen Zell-Linien haben. Im Hinblick auf einen möglichen klinischen Einsatz zur Myeloprotektion bei einer Chemotherapie wurde dafür die Mutante MGMTP140K verwendet, die resistent gegen den pharmakologischen MGMT-Inhibitor BG ist. Eingesetzt wurden für den Gentransfer verschiedene Retrovirale Vektorkonstrukte, die ein breites Spektrum transgener MGMTP140K-Expression erlaubten. Als wichtigste Befunde ergab sich aus diesen Experimenten: Der MGMTP140K-Gentransfer führt zu einer erheblich verbesserten Reparaturkapazität für O6-meG bei hämatopoetischen Stamm-/ Vorläufer- zellen im Knochenmark TMZ-behandelter Mäuse Die drei eingesetzten Vektorkonstrukte vermittelten eine 50-, 200- bzw 1000-fache Überexpression von MGMT in primären hämatopoetischen Zellen, die in allen Fällen ausreichte, die in vivo durch TMZ induzierten O6-meG-Addukte vollständig aus der DNA zu entfernen Es besteht eine inverse Korrelation zwischen der transgenen MGMTP140K- Expression und der in vivo Chemoprotektion / Selektion hämatopoetischer Stamm-/ Vorläuferzellen im Knochenmark BG-TMZ-behandelter Mäuse. Hämatopoetische Maus 32D-Zellen zeigen bei sehr hoher transgener MGMTP140K-Expression Wachstumsstörungen, die vermutlich auf der veränderten subzellulären Lokalisation und der verstärkten DNA-Bindung des mutierten Proteins beruhen. Diese Erkenntnisse sollten bei dem geplanten gentherapeutischen Einsatz dieser Protektionsstrategie in der Klinik berücksichtigt werden, da eine Verschiebung des physiologischen Gleichgewichts durch transgene Expression von MGMTP140K die Schutzfunktion für die Zielzellen entgegenwirken kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die durch persistierende O6-meG-Addukte ausgelöste “DNA damage response“ bei primären humanen, hämatopoetischen Stamm-/ Vorläuferzellen im Vergleich zu differenzierten T-Lymphozyten untersucht. Da Gen-Veränderungen nach struktureller DNA-Modifikation in Stamm- und Vorläuferzellen ein besonderes Risiko für das Überleben vielzelliger Organismen darstellen, reagieren Stamm-/Vorläuferzellen möglicherweise anderes als differenzierten Zellen auf dieser Art von Schäden. An aus Nabelschnurblut isolierten, TMZ-behandelten CD34+- bzw. 34--Zellen wurden folgende Befunde erhoben: Auslöser der Apoptose sind in beiden Zellpopulationen nicht-reparierte O6-meG-Addukte. Der TMZ-induzierte Zelltod ist strikt an die DNA-Replikation gekoppelt. Stamm-/ Vorläuferzellen (CD34+) weisen 12-24 Stunden nach der Behandlung wesentlich höhere Apoptoseraten im Vergleich zu ausdifferenzierten T-Lymphozyten (CD34-) auf. Im Gegensatz zu differenzierten T-Lymphozyten zeigen Stamm-/ Vorläuferzellen keinen BG-TMZ-induzierten Zellzyklusarrest in der S-Phase. CD34+-Zellen exprimieren die Protein-Kinase ATR nur in geringem Maße und zeigen nach TMZ-Exposition eine vergleichsweise niedrige Phosphorylierung der „checkpoint“-Regulatoren CHK1 und RAD17. Bei Stamm-/Vorläuferzellen ist bereits sehr früh (6 Stunden) nach BG-TMZ-Exposition die Bildung von H2AX- und RAD51-Foci (als Indikatoren für DNA-Doppelstrangbrüche) im Kern nachweisbar, während bei differenzierten T-Lymphozyten solche Foci erst im zweiten Zellzyklus nach Behandlung auftreten Diese Befunde deuten darauf hin, dass hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen prinzipiell anders auf (potenziell mutagenen) genotoxischen Stress reagieren als Zellen später Differenzierungsstadien. Für den fehlenden Zellzyklus-Arrest sowie die rasche Induktion von Apoptose in der Stammzellfraktion könnten die reduzierte Aktivierung des ATR-CHK1- Checkpoints bzw. die frühe Entstehung von DNA-Doppelstrangsbrüchen durch persistierende O6-meG-Addukten verantwortlich sein. Die biologische Bedeutung dieses ungewöhnlichen Verhaltens könnte darin liegen, durch effiziente Elimination von Stammzellen mit DNA-Schädigung der Akkumulation von Mutationen in dieser wichtigen Zellpopulation konterkarieren. Ob es sich dabei um einen Hämatopoese-spezifischen Mechanismus handelt oder um eine generelle Schutzstrategie für somatische Stammzellen muss zukünftig abgeklärt werden

Designer lipid-like peptides

A crucial bottleneck in membrane protein studies, particularly G-protein coupled receptors, is the notorious difficulty of finding an optimal detergent that can solubilize them and maintain their stability and function. Here we report rapid production of 12 unique mammalian olfactory receptors using short designer lipid-like peptides as detergents. The peptides were able to solubilize and stabilize each receptor. Circular dichroism showed that the purified olfactory receptors had alpha-helical secondary structures. Microscale thermophoresis suggested that the receptors were functional and bound their odorants. Blot intensity measurements indicated that milligram quantities of each olfactory receptor could be produced with at least one peptide detergent. The peptide detergents' capability was comparable to that of the detergent Brij-35. The ability of 10 peptide detergents to functionally solubilize 12 olfactory receptors demonstrates their usefulness as a new class of detergents for olfactory receptors, and possibly other G-protein coupled receptors and membrane proteins

A Robust and Rapid Method of Producing Soluble, Stable, and Functional G-Protein Coupled Receptors

Membrane proteins, particularly G-protein coupled receptors (GPCRs), are notoriously difficult to express. Using commercial E.coli cell-free systems with the detergent Brij-35, we could rapidly produce milligram quantities of 13 unique GPCRs. Immunoaffinity purification yielded receptors at >90% purity. Secondary structure analysis using circular dichroism indicated that the purified receptors were properly folded. Microscale thermophoresis, a novel label-free and surface-free detection technique that uses thermal gradients, showed that these receptors bound their ligands. The secondary structure and ligand-binding results from cell-free produced proteins were comparable to those expressed and purified from HEK293 cells. Our study demonstrates that cell-free protein production using commercially available kits and optimal detergents is a robust technology that can be used to produce sufficient GPCRs for biochemical, structural, and functional analyses. This robust and simple method may further stimulate others to study the structure and function of membrane proteins.United States. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA-HR0011-09-C-0012)Massachusetts Institute of Technology. Undergraduate Research Opportunities Progra

Kinetic properties and small-molecule inhibition of human myosin-6.

Myosin-6 is an actin-based motor protein that moves its cargo towards the minus-end of actin filaments. Mutations in the gene encoding the myosin-6 heavy chain and changes in the cellular abundance of the protein have been linked to hypertrophic cardiomyopathy, neurodegenerative diseases, and cancer. Here, we present a detailed kinetic characterization of the human myosin-6 motor domain, describe the effect of 2,4,6-triiodophenol on the interaction of myosin-6 with F-actin and nucleotides, and show how addition of the drug reduces the number of myosin-6-dependent vesicle fusion events at the plasma membrane during constitutive secretion

Designer Lipid-Like Peptides: A Class of Detergents for Studying Functional Olfactory Receptors Using Commercial Cell-Free Systems

A crucial bottleneck in membrane protein studies, particularly G-protein coupled receptors, is the notorious difficulty of finding an optimal detergent that can solubilize them and maintain their stability and function. Here we report rapid production of 12 unique mammalian olfactory receptors using short designer lipid-like peptides as detergents. The peptides were able to solubilize and stabilize each receptor. Circular dichroism showed that the purified olfactory receptors had alpha-helical secondary structures. Microscale thermophoresis suggested that the receptors were functional and bound their odorants. Blot intensity measurements indicated that milligram quantities of each olfactory receptor could be produced with at least one peptide detergent. The peptide detergents' capability was comparable to that of the detergent Brij-35. The ability of 10 peptide detergents to functionally solubilize 12 olfactory receptors demonstrates their usefulness as a new class of detergents for olfactory receptors, and possibly other G-protein coupled receptors and membrane proteins.United States. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA-HR0011-09-C-0012)Massachusetts Institute of Technology. Undergraduate Research Opportunities Progra

Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions

Item does not contain fulltextMicroscale thermophoresis (MST) allows for quantitative analysis of protein interactions in free solution and with low sample consumption. The technique is based on thermophoresis, the directed motion of molecules in temperature gradients. Thermophoresis is highly sensitive to all types of binding-induced changes of molecular properties, be it in size, charge, hydration shell or conformation. In an all-optical approach, an infrared laser is used for local heating, and molecule mobility in the temperature gradient is analyzed via fluorescence. In standard MST one binding partner is fluorescently labeled. However, MST can also be performed label-free by exploiting intrinsic protein UV-fluorescence. Despite the high molecular weight ratio, the interaction of small molecules and peptides with proteins is readily accessible by MST. Furthermore, MST assays are highly adaptable to fit to the diverse requirements of different biomolecules, such as membrane proteins to be stabilized in solution. The type of buffer and additives can be chosen freely. Measuring is even possible in complex bioliquids like cell lysate allowing close to in vivo conditions without sample purification. Binding modes that are quantifiable via MST include dimerization, cooperativity and competition. Thus, its flexibility in assay design qualifies MST for analysis of biomolecular interactions in complex experimental settings, which we herein demonstrate by addressing typically challenging types of binding events from various fields of life science

Reverse Transcription of Threose Nucleic Acid by a Naturally Occurring DNA Polymerase.

Recent advances in polymerase engineering have enabled the replication of xenonucleic acid (XNA) polymers with backbone structures distinct from those found in nature. By introducing a selective amplification step into the replication cycle, functional XNA molecules have been isolated by in vitro selection with binding and catalytic activity. Despite these successes, coding and decoding genetic information in XNA polymers remains limited by the fidelity and catalytic efficiency of engineered XNA polymerases. In particular, the process of reverse transcribing XNA back into DNA for amplification by PCR has been problematic. Here, we show that Geobacillus stearothermophilus (Bst) DNA polymerase I functions as an efficient and faithful threose nucleic acid (TNA)-dependent DNA polymerase. Bst DNA polymerase generates ∼twofold more cDNA with threefold fewer mutations than Superscript II (SSII), which was previously the best TNA reverse transcriptase. Notably, Bst also functions under standard magnesium-dependent conditions, whereas SSII requires manganese ions to relax the enzyme's substrate specificity. We further demonstrate that Bst DNA polymerase can support the in vitro selection of TNA aptamers by evolving a TNA aptamer to human α-thrombin