Study of the role of SETD2 mutations in clear cell renal cell carninoma (ccRCC)

Trabalho de projecto de mestrado em Bioestatística, apresentado à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013Clear cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC, is the most common form of Renal Cancer, accounting for 90% of these cancers cases. It is well established that the majority of these cancers happen when both alleles of VHL (Von Hippel Lindau) tumour suppressor gene are mutated. It has also been observed that patients with this form of cancer present mutations on the SETD2 gene which applies its functions during transcription. In the last few years the growth within sequencing technologies has been astonishing. Next Generation Sequencing technology, NGS, provides tools for assessing full genomes to a reference sequence in a matter of days, being extremely accurate, while also increasingly cost effective. One of its many applications is RNA-Sequencing, a method for transcriptome analysis. Throughout this thesis we aimed at analysing RNA-Seq data from six samples: four with mutations on the SETD2 gene and two control samples. The main goal was to understand how the remaining genes on the transcriptome respond to these genes mutations. In the first part of this work we aimed at analysing several forms to normalize the data, resorting to R software packages (EDASeq, DESeq and edgeR). Data normalization is a crucial step on NGS techniques, as these techniques have some inherent bias that need to be accounted for. DESeq proved to be the most selective, while EDASeq is not as stringent. The second part of this work aimed at identifying deferentially expressed genes, to infer which genes behave in a significant way in the samples, packages edgeR, DESeq and RankProd. We identified six new genes as differentially expressed.O carcinoma renal de células claras, ccRCC, é o tipo mais comum de cancro renal, sendo responsável por cerca de 70% destes tumores, com a mais alta taxa de mortalidade entre todos os tipos de cancro renal. A grande maioria destes tumores deve-se a mutações no gene VHL, um gene supressor de cancro. Não obstante, vários estudos de sequenciação do ccRCC acabaram por revelar a ocorrência de mutações somáticas no gene SETD2, uma Histone methyltransferase que trimetila a lisina 36 na histona H3 (H3K36me3). Este gene tem um papel fundamental na transcrição, um dos principais passos na expressão genética { processo pelo qual são geradas proteínas perfeitamente funcionais, permitindo que o ADN se desenrole e seja posteriormente transcrito. Está localizado no braço curto do cromossoma 3 e as mutações deste gene conduzem à perda de funções deste mesmo cromossoma. O objectivo biológico da presente tese é avaliar as alterações do transcriptoma, induzidas pelas mutações no gene SETD2. Esta questão será abordada utilizando dados do transcriptoma completo, de linhas celulares mutadas no gene SETD2 e de linhas celulares não mutadas do gene wild tipe (WT), no ccRCC. Os dados desta análise consideraram 4 amostras biológicas de transcriptomas mutados do genoma SETD2 e 2 amostras wild tipe, dados estes que foram gerados pela unidade do investigador Sérgio Almeida, do Instituto de Medicina Molecular (IMM da FMUL). Recentemente, o desenvolvimento de novas tecnologias de métodos de sequenciação, designadas por Next Generation Sequencing (NGS), disponibilizou um novo método que, em simultâneo, executa o mapeamento e a quantificação de transcriptomas, chamado sequenciação de RNA (RNA-seq). Apesar de mais expendioso do que os estudos de microarrays e ainda com alguns problemas de análise de dados por resolver, a sequenciação do RNA pode avaliar o transcriptoma completo, disponibilizando a derradeira solução para a análise dos níveis e da estrutura de transcriptomas processados e não processados, sob diferentes condições. Esta técnica disponibiliza uma importante poupança de tempo (o genoma humano completo pode ser sequenciado em menos de uma semana, dependendo das opções do investigador) com qualidade, precisão de leitura (cerca de 98%) e poupanças de tempo. O transcriptoma completo de cada amostra _e convertido em cRNA e separado em pequenos fragmentos (cerca de 200, 300nt), estes fragmentos são posteriormente utilizados como modelos no passo de sequenciação, onde só uma pequena sequência da parte final do fragmento irá ser sequenciada (chamada de read). Este processo gera milhões de reads, que podem ser depois alinhadas com o genoma e originar uma tabela de contagens para cada gene (número de reads, por gene) por amostra. Algumas ferramentas bioinformáticas foram recentemente desenvolvidas, para analisar esta imensa informação gerada pela técnica RNA-seq. Estas ferramentas diferem entre si quanto à normalização e às técnicas estatísticas aplicadas, com impacto nos resultados finais. Assim, o objectivo da presente tese é explorar e comparar os diferentes métodos aplicados ao problema biológico acima mencionado. Para o efeito, a nossa análise recorreu ao Bioconductor. O Bioconductor é um software de utilização gratuita, não impondo quaisquer licenças de utilização, que disponibiliza código aberto para Bioinformática. Aqui, encontram-se packages que permitem processar a informação no que respeita aos 2 passos da análise: normalização e análise da expressão diferencial dos genes. O trabalho desta tese foi desenvolvido considerando a análise dividida nestes dois passos principiais: normalização e expressão diferencial. Os nossos estudos irão ser desenvolvidos em torno das diferentes formas de normalização dos dados, analisando posteriormente os diferentes resultados que se obtiveram na expressão diferencial dos dados. A normalização é o passo pelo qual se consegue que uma base de dados com contagens profundamente discrepantes entre si possa ser comparável, aplicando a estes dados um denominador comum que toma em consideração os erros associados à utilização desta técnica. A expressão diferencial é o passo onde se identificaram os genes que revelaram significativas alterações da expressão estatística, entre duas amostras, tal como a mutação do gene SETD2 e as linhas das células do ccRCC wild type. No essencial, isto significa que estes genes revelam uma alteração significativa da sua expressão, das amostras mutadas para as wild type. A nossa análise baseou-se na utilização de 4 packages, EDASeq, edgeR, DESeq e RankProd. Enquanto o primeiro foi desenhado apenas para realizar a normalização, o último foca-se apenas na análise da expressão diferencial. Ambos os packages edgeR e DESeq possuem abordagens próprias para realizar ambos os passos, podendo ao mesmo tempo receber contagens de dados normalizados pelo EDASeq. O método RankProd pode receber dados normalizados pelos métodos EDASeq e DESeq, e o método edgeR também pode receber dados normalizados obtidos pelo método DESeq. A forma como estes dados são normalizados vai depender das premissas que cada método utiliza para normalizar os dados: o edgeR e o DESeq consideram abordagens diferentes na normalização between lane, enquanto o método EDASeq realiza uma normalização na própria lane relativamente ao conteúdo em GC, antes de proceder à normalização textitbetween lanes. Observámos ainda que todas estas abordagens disponibilizam bons níveis de normalização, bem correlacionados entre si (obtendo valores de 0.98/1.00 no coeficiente de correlação de Pearson) e no que respeita aos dados em bruto. As combinações estudadas entre os vários métodos tiveram o objectivo de permitir uma comparação detalhada das metodologias, no que respeita aos seus próprios protocolos (normalização DESeq combinada com a análise de expressão diferencial com DESeq e normalização edgeR combinada com a análise da expressão diferencial com edgeR) e à juncão de protocolos: nomeadamente as diferentes abordagens no passo da normalização pelos métodos – EDASeq ou DESeq { e ainda as diferentes abordagens no passo da expressão diferencial dos métodos { edgeR, DESeq ou RankProd. No que respeita a protocolos próprios, observámos que o protocolo completo do método edgeR identificou muito mais genes que o método DESeq, independentemente dos níveis de significância considerados (1%, 5% e 10%). No que respeita à juncão de protocolos, quando se juntou a normalização do EDASeq à expressão diferencial do edgeR, obteve-se um número significativamente maior de genes identificados quando comparado com quaisquer outros métodos. O método RankProd acabou por apresentar uma nova perspectiva sobre os dados, tendo sido concebido para trabalhar os dados numa lógica de microarrays; contudo, ao assumir que cada lane dos nossos dados funciona como um array, propusemo-nos investigar se este package se podia ajustar aos nossos dados de NGS. Observámos que o RankProd se ajustava adequadamente ao receber dados normalizados oriundos do método DESeq, mas falhava quando recebia dados normalizados pelo método EDASeq. Observámos que, globalmente, o método DESeq, quando utilizado como processo de normalização, conduz à identificação de um número menor de genes diferencialmente expressos que o EDASeq, para todos os níveis de significância considerados (1%, 5% e 10%). Por outro lado, quando considerados todos os métodos para a expressão diferencial, detectamos que o método edgeR identificou mais genes que o RankProd ou o DESeq, para os mesmos níveis de significância. Observámos ainda que a maioria dos genes identificados com estes métodos (com excepção dos procedimentos de normalização do EDASeq) conduziram a um maior número de contagens para genes up regulated que para genes down regulated, o que significa que estes genes demonstram possuir maior expressão diferencial quando mutados do que nas amostras wt. O passo seguinte na análise foi perceber se os genes que estes métodos identificam como diferencialmente expressos são os mesmos. Considerando todos os métodos do R, identificamos 6 genes diferencialmente expressos comuns a todos eles (para uma FDR=5%): "SLC2A10", "COL14A1", "GPR173", "LOC100506178", "EREG" e "ADAMTSL1". Uma vez excluído o RankProd desta comparação, foram identificados 27 genes como diferencialmente expressos, considerando o mesmo valor para a FDR. Considerando investigações futuras, e no que respeita aos resultados obtidos pelo Bioconductor, a combinação entre técnicas que revelou um maior número de genes com expressão diferencial é entre o método EDASeq para a normalização com o método edgeR para a análise da expressão diferencial. Adicionalmente, todas as combinações de técnicas onde o método EDASeq executa a normalização, claramente resultaram em amostras com um maior número de contagens. No princípio deste projecto, propusemo-nos estudar 6 amostras de transcriptoma, obtidas com o RNA-Seq, duas correspondendo a amostras controlo, as outras quatro apresentando mutações no gene SETD2, o que leva à ocorrência do ccRCC. O desafio foi analisar os dados, procurando identificar genes que reagissem às mutações do SETD2, respondendo à questão de como este gene afecta os restantes genes no transcriptoma. Outro desafio a que nos propusemos, conforme indicado neste texto, foi a comparação de metodologias por forma a melhor aferir sobre o objectivo primário deste trabalho. Este trabalho permitiu identificar 6 novos genes que respondem às mutações do SETD2

The importance of apoptosis of Plasmodium-infected cells in the generation of immunity against malaria infection

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Despite the efforts towards eradication, malaria remains the most deadly parasitic and vector-borne disease, urging for the development of an effective antimalarial vaccine. Recently, a renewed interest in Plasmodium attenuated whole-organism vaccine strategies has emerged, long acknowledged to experimentally induce full and sterile immunity against malaria in mice, monkeys and humans. This approach involves the use of non-replicating but metabolic active sporozoites, either attenuated by exposition to radiation, the Radiation-Attenuated Sporozoites (RAS), or by genetic modification, the Genetically-Attenuated Sporozoites (GAS). These attenuated parasites are able to infect hepatocytes in vivo as normal sporozoites, but are unable to fully develop in the liver. This arrest in development has been associated with their apparent failure to prevent host cell apoptosis, which leads to the formation of apoptotic bodies filled with parasite antigens. Several pieces of evidence have suggested that these apoptotic bodies may provide an optimal source of antigens for dendritic cells cross-presentation, and therefore, immune response activation. The aim of this project was to assess whether apoptosis of RAS or GAS infected hepatocytes is involved in the induced protective immunity response against subsequent parasite challenges. Results obtained through the immunization of C57BL/6 background caspase-3 deficient mice with P. berghei RAS or p36p- GAS revealed that these mice are only partially protected against further infection. These suggest that at least to some extent, caspase-3 mediated apoptosis of infected hepatocytes may be important in generation of immunity by attenuated parasites.Em pleno século XXI, e apesar de todas as medidas de controlo implementadas ao longo dos anos, a malária continua a ser uma das doenças mais mortíferas a assolar a humanidade. Só no ano de 2008, a malária foi responsável por 243 milhões de casos de doença e quase um milhão de mortes, maioritariamente no continente Africano. A malária, ou paludismo, é causada por parasitas pertencentes ao género Plasmodium, um grupo de protozoários capazes de infectar grupos diversificados de animais vertebrados como mamíferos, aves e répteis. Em humanos, a malária é causada maioritariamente por quatro espécies, P. falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae, e é transmitida através da picada de mosquitos fêmea infectados do género Anopheles. Uma vez inoculado no hospedeiro mamífero, o parasita, sob a forma de esporozoíto, inicia a fase assexuada do seu ciclo de vida, desenvolvendo-se inicialmente assintomaticamente no fígado, onde milhares de merozoítos, a forma do parasita capaz de infectar eritrócitos, são originados. Uma vez libertados na corrente sanguínea, os merozoítos rapidamente infectam eritrócitos, dando origem a mais merozoítos, e iniciando a fase eritrocitária do seu ciclo de vida e sintomática da doença. Contudo, ao fim de alguns ciclos de multiplicação em eritrócitos, alguns merozoítos acabam por gerar gametócitos, as formas sexuais do parasita, que são ingeridas pelo mosquito aquando da sua refeição de sangue. No mosquito, os gametócitos dão início à fase sexuada do ciclo de vida do parasita, que culmina com a formação de esporozoítos capazes de infectar novos hospedeiros mamíferos. Durante décadas, muitos esforços têm sido empregues com o intuito de erradicar a malária. Contudo, estes têm-se revelado infrutíferos, e tanto parasitas como mosquitos resistentes às medidas de controlo empregues têm emergido nos últimos anos. Perante este cenário, tem-se sugerido que o desenvolvimento de terapias capazes de bloquear a transmissão do parasita do Homem para o mosquito, nomeadamente o de uma vacina eficaz contra a malária, é urgentemente necessário e crucial para se alcançar a erradicação da doença. Há muito que se tenta desenvolver uma vacina anti-malárica eficaz. No entanto, tal tem-se revelado um dos maiores desafios da medicina, principalmente devido à extraordinária complexidade do ciclo de vida do parasita, durante o qual este se desenvolve e diferencia em formas que apresentam uma morfologia, metabolismo e conteúdo antigénico completamente distintos consoante a fase em que o parasita se encontra. A fase hepática constitui um alvo ideal para o desenvolvimento de uma vacina, uma vez que o desenvolvimento de uma vacina pré-eritrocitária eficaz teria simultaneamente capacidade profiláctica e de bloqueio da transmissão: a eliminação das formas pré-eritrocitárias do parasita (o esporozoíto e a forma exo-eritrocitária em desenvolvimento – EEF - dentro dos hepatócitos), permitiria impedir o aparecimento dos sintomas da infecção e, consequentemente, a transmissão do parasita ao mosquito. Contudo, uma vacina pré-eritrocitária tem que ser 100% eficaz em eliminar o parasita: basta que um esporozoíto se desenvolva completamente no fígado para que ocorra doença e, consequentemente, transmissão. Vários estudos demonstram que a administração de esporozoítos atenuados mas metabolicamente activos é capaz de induzir uma resposta imune eficiente de longa duração em ratinhos, macacos e humanos, contra futuras infecções por esporozoítos. De facto, a desilusão relativa à eficácia de vacinas baseadas apenas em partes recombinantes de antigénios do parasita tem despertado um grande interesse para o desenvolvimento de uma vacina usando esporozoítos vivos atenuados que, em última análise, constitui uma vacina multi-antigénica e em tudo semelhante ao parasita infeccioso. Os esporozoítos podem ser eficientemente atenuados através da sua exposição a uma determinada dose específica de radiação ionizante (X ou γ) (radiation attenuated sporozoites - RAS), ou da sua manipulação genética, em que genes essenciais para o desenvolvimento das formas pré-eritrocitárias do parasita são danificados (genetically attenuated sporozoites - GAS). Em ambas as estratégias de atenuação, os esporozoítos atenuados mantêm a sua capacidade de invadir hepatócitos, tal como o parasita selvagem, mas demonstram uma grave deficiência no seu desenvolvimento uma vez dentro da célula hospedeira, que os impede de produzir merozoítos e assim, causar doença. Esta deficiência em completar o seu desenvolvimento dentro do hepatócito tem sido associada com a incapacidade que os parasitas atenuados têm de inibir a apoptose da célula hospedeira. Ao longo da evolução, os microrganismos intracelulares desenvolveram mecanismos que lhes permitem manipular os processos biológicos da célula hospedeira para seu benefício. Um dos processos que mais pressão selectiva tem imposto aos microrganismos intracelulares tem sido a morte das células hospedeiras por apoptose. Apesar de a apoptose poder ser desencadeada através de diversos estímulos e vias de sinalização, a via extrínseca, accionada por ligandos extracelulares, e a via intrínseca, desencadeada por sinais internos como o stress, são as mais comuns em células de mamíferos. Embora sejam despoletadas por diferentes estímulos, as duas vias apoptóticas convergem na activação de efectores comuns, as proteínas caspase, nomeadamente a da caspase-3, que aquando da sua activação, leva em última instância à morte celular e à resultante formação de corpos apoptóticos. Tal como em outros microrganismos intracelulares, tem sido demonstrado que os estádios pré-eritrocitários de Plasmodium possuem a capacidade de inibir a apoptose dos hepatócitos infectados, tanto aquando do processo de invasão, como durante os estádios iniciais e tardios do seu desenvolvimento. Aparentemente, a protecção da célula hospedeira à apoptose durante o desenvolvimento do parasita requer que este se mantenha vivo, e possivelmente, em processo de desenvolvimento. Várias observações sugerem que os parasitas atenuados, tanto RAS como GAS, são incapazes de evitar que a célula infectada entre em processo de apoptose e que, de facto, a imunidade gerada aquando da imunização com os parasitas atenuados resulta da sua incapacidade em proteger a célula hospedeira de entrar em apoptose aquando da infecção. Quando a célula infectada sofre apoptose, formam-se corpos apoptóticos carregados com antigénios celulares e do parasita. Estes podem depois ser fagocitados por células apresentadoras de antigénios, tais como macrófagos e células dendríticas. Posteriormente, estas células podem fazer a apresentação destes antigénios ao sistema imunitário, desencadeando respostas imunes específicas contra o parasita. Vários estudos têm associado as células dendríticas com o estabelecimento da imunidade protectora induzida pelos parasitas atenuados, apontando-as como o veículo entre as células infectadas em apoptose e o sistema imunitário. De facto, as células dendríticas encontram-se associadas com a apresentação de antigénios exógenos através de moléculas de histocompatibilidade de classe I a células T CD8+, os principais elementos da resposta imune celular gerada pelos parasitas atenuados. O presente trabalho pretende testar a hipótese de que a apoptose das células infectadas com os parasitas atenuados se encontra intimamente relacionada com o estabelecimento bem sucedido da resposta imune gerada por estes parasitas contra posteriores infecções por esporozoítos infecciosos. Recorrendo a ratinhos da linhagem C57BL/6 deficientes em caspase-3 (Casp3KO), um elemento-chave em diversas vias da apoptose, vários ensaios de imunização com parasitas P. berghei ANKA atenuados, quer por a radiação γ (Pb-RAS), ou por manipulação genética (Pbp36p-), foram realizados. Em cada ensaio, a posterior infecção foi efectuada com esporozoítos P. berghei ANKA que expressam constitutivamente a proteína de fluorescência verde (PbGFP) ou luciferase (PbLuci). Estes parasitas permitem, respectivamente através da análise por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) ou imagiologia in vivo em tempo real, inferir o nível de infecção no fígado e assim, a eficiência do regime de imunização. Contudo, o estabelecimento de uma resposta imunitária completamente eficiente contra a infecção foi apenas irrefutavelmente depreendida através da vigilância e seguimento do aparecimento de parasitas no sangue dos animais. Estes ensaios permitiram-nos verificar que os ratinhos Casp3KO encontram-se apenas parcialmente protegidos contra a infecção com esporozoítos infecciosos, sugerindo que as vias apoptóticas dependentes de caspase-3 se encontram possivelmente envolvidas no estabelecimento da imunidade induzida pelos parasitas atenuados. De modo a excluir a possibilidade de que a imunidade parcial observada nos ratinhos Casp3KO se deve a uma deficiência ao nível do sistema imunitário destes animais, uma vez que se pensa dever à diminuição do nível de apoptose das células infectadas no fígado, a medula óssea de ratinhos Casp3KO foi substituída pela de ratinhos C57BL/6 normais, e vice-versa. Os ratinhos quimera resultantes foram imunizados com Pb-RAS, e posteriormente infectados com PbLuci. Infelizmente, este ensaio não nos permitiu retirar quaisquer conclusões concretas, apesar de sugerir que o fenótipo observado nos ratinhos Casp3KO imunizados se deve à sua maior resistência à apoptose nas células hepáticas infectadas com os parasitas atenuados. Através de uma sonda fluorescente que permite detectar níveis de apoptose in vivo, foi-nos possível inferir que há um aumento do nível de apoptose no fígado de ratinhos C57BL/6 infectados com PbRAS, que é aparentemente superior ao observado em ratinhos Casp3KO infectados com os mesmos parasitas, e ratinhos C57BL/6 infectados com parasitas infecciosos. Estes resultados permitem-nos de certo modo confirmar as observações de que os parasitas atenuados por radiação são incapazes de proteger a célula hospedeira de sofrer apoptose. Em conjunto, os resultados aqui apresentados aparentam suportar a hipótese proposta, de que a apoptose das células infectadas com parasitas atenuados é relevante para o estabelecimento da resposta imune efectiva induzida por estes. Perante este panorama, planeámos construir um parasita P. berghei ANKA transgénico que expressa e exporta para o citoplasma das células hospedeiras caspase-2, um factor pró-apoptótico, com o intuito de induzir a apoptose das células infectadas e inferir se a infecção de ratinhos com este parasita é capaz de induzir uma resposta imune eficaz contra infecções posteriores com esporozoítos infecciosos P. berghei ANKA

Post-surgical outcome of the ventral slot procedure for cervical intervertebral disc disease in dogs

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaThe medical records of 18 dogs, including 12 Chondrodystrophic breed dogs and 8 Non-Chondrodystrophic dogs with Cervical Intervertebral Disc Disease (CIVDD) that were submitted to Ventral Slot decompression surgery and posterior rehabilitation physiotherapy were analyzed. Patients were diagnosed using CT Myelography and subsequently classified as having either Hansen Type I or Hansen type II disc herniation. The most frequent clinical presentation was non-ambulatory tetraparesis (33%). The most frequently affected site for CIVDD were the vertebral segments C3-C4 for Hansen Type I (28%) and C4-C5 for Hansen type II (11%). The patient’s neurological status was graded using the Modified Frankel Scale and the difference between their pre-surgical and post-surgical neurological grading was calculated to determine the treatment outcome. The short term post-surgical outcome was positive in 100% of dogs, including 72% with an excellent outcome. A significant correlation was found between the site of lesion and the outcome. Hansen Type I CIVDD patients also showed a more favorable improvement compared to Hansen Type II patients.RESUMO - As histórias clínicas de 18 cães, incluindo 12 de raças condrodistróficas e 8 de raças não condrodistróficas com hérnia cervical da coluna vertebral que foram submetidos à técnica cirúrgica Ventral Slot e posterior fisioterapia de reabilitação foram analisados. Os pacientes foram diagnosticados através de TAC com mielografia e subsequentemente classificados como afetados por hérnia do disco hansen tipo I ou tipo II. A apresentação clinica mais frequente foi tetraparésia não-ambulatória (33%). O local mais afetado da coluna cervical foi o segmento C3-C4 nos casos de hérnia hansen tipo I (28%) e C4-C5 nos casos de hérnia hansen tipo II (11%). O estado neurológico dos pacientes foi classificado utilizando a escala de Frankel modificada, sendo que a diferença entre as classificações pré e pós-cirúrgicas foi comparada para determinar o outcome do tratamento. O outcome pós-cirúrgico a curto prazo foi positivo em todos os cães, incluindo 72% com um outcome excelente. Foi encontrada uma correlação significativa entre o segmento afetado e o outcome. Os pacientes com hérnia hansen tipo I mostraram uma melhoria mais favorável comparando com os que sofreram de hérnia hansen tipo II.N/

Serological surveillance of West Nile virus and molecular diagnostic of West Nile virus, Usutu virus, avian influenza and Newcastle disease virus in wild birds of Portugal

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaABSTRACT - The worldwide changes in the environment and climate of natural ecosystems detected in the last few decades have been responsible for the emergence of new infectious diseases in both animals and humans. This work focused on surveillance of four zoonotic pathogens, namely West Nile virus (WNV), Usutu virus (USUV), avian orthoavulavirus-1 (AOaV-1), also known as Newcastle disease virus (NDV), and influenza A virus (IAV) in wild birds of continental Portugal. Blood and tissues samples from both live and dead birds (were collected in three wildlife rehabilitation centres of Portugal between 2018 and 2019: Wildlife Rehabilitation and Research Centre of Ria Formosa, Wildlife Rehabilitation Centre of Lisbon and University of Trás-os-Montes and Alto Douro Veterinary Teaching Hospital – Wildlife Rehabilitation Centre. Samples from a total of 192 animal were collected (82 in vivo and 110 post-mortem). A total of one hundred and eighty-two samples were tested for WNV, USUV, IAV and for AOaV-1 by real time RT-PCR (RT-qPCR) or RT-PCR. AOaV-1 positive samples from two Eurasian collared doves (Streptopelia decaocto) (1.10% sample positivity) collected in the south of Portugal were sequenced, and their phylogenetic relationships analysed. Phylogenetic analysis confirmed that these sequences clustered with other AOaV-1 sequences from genotype XXI, subgenotype XXI.2. Tissue samples were all negative for WNV, USUV and IAV. Plasma samples were also tested for WNV antibodies by seroneutralization test. WNV neutralizing antibodies were detected in ten (13.70%) out of 73 samples namely: four Buteo buteo, two Hieraaetus pennatus, an Accipiter nisus, a Aegypius monachus, a Circaetus gallicus, and a Ciconia ciconia. This study has established a baseline for future epidemiological studies of WNV and AOaV-1 in wild birds of continental Portugal. Further monitoring and epidemiological studies of both diseases in Portugal is advised, considering the threat that both diseases can pose to humans, animals and to the ecosystems themselves.RESUMO - MONITORIZAÇÃO SEROLÓGICA DO VÍRUS DO NILO OCIDENTAL E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO VÍRUS DO NILO OCIDENTAL, VÍRUS USUTU, INFLUENZA AVIÁRIA E VÍRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE EM AVES SELVAGENS DE PORTUGAL - As profundas alterações ambientais e climáticas dos ecossistemas naturais que o mundo tem sofrido nas últimas décadas têm sido responsáveis pelo aparecimento de novas doenças infeciosas em animais e humanos. Este trabalho focou-se na monitorização de quatro agentes zoonóticos em aves selvagens de Portugal continental, nomeadamente vírus do Nilo Ocidental (WNV), vírus Usutu (USUV), orthoavulavirus-1 aviário, também conhecido como vírus da doença de Newcastle (NDV) e vírus influenza A (IAV). Amostras de sangue e tecidos de animais vivos e mortos foram recolhidas entre 2018 e 2019 em três centros de recuperação de fauna selvagem em Portugal: Centro de Recuperação e Investigação de Animais Selvagens da Ria Formosa, Centro de Recuperação de Animais Silvestres de Lisboa e Centro de Recuperação de Animais Selvagens do Hospital Veterinário da UTAD. Foram recolhidas amostras de um total de 192 animais (82 in vivo e 110 post-mortem). Um total de cento e oitenta e duas amostras foram testadas para a presença de WNV, USUV, IAV e AOaV-1 por RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e RT-PCR convencional. Duas amostras positivas de duas rolas turcas (Streptopelia decaocto) (1.10% positividade) recolhidas no sul de Portugal foram sequenciadas e as suas relações filogenéticas foram analisadas. A análise filogenética confirmou que estas sequências agrupam com estirpes de AOaV-1 do genótipo XXI, subgenótipo XXI.2. Amostras de tecidos foram todas negativas para a presença de WNV, USUV e IAV. Amostras de plasma foram testadas para a presença de anticorpos neutralizantes de WNV pelo teste da seroneutralização. Das 73 amostras, dez (13.70%) apresentavam anticorpos neutralizantes para WNV: quatro Buteo buteo, duas Hieraaetus pennatus, um Accipiter nisus, um Aegypius monachus, uma Circaetus gallicus e uma Ciconia ciconia. Este estudo estabeleceu uma base para futuros estudos epidemiológicos sobre WNV e AOaV-1 em aves selvagens em Portugal continental. Aconselha-se a realização futura de outros estudos epidemiológicos e monitorizações, considerando a ameaça que ambas as doenças apresentam para humanos, animais e para os próprios ecossistemas.N/

Bird talk, the soap opera: vocal and behavioural repertoire of a zoo population of rainbow lorikeets (Trichoglossus moluccanus)

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Se a comunicação é a base de todas as interações e relações sociais, a comunicação acústica é uma das mais predominantes. Esta forma de transmissão e receção de sinais é muito variada e existe praticamente em todos os animais, mas há certamente alguns que se destacam. Os psitaciformes – ordem que inclui papagaios, araras, catatuas, periquitos, entre outros – são universalmente e historicamente reconhecidos não só pelas suas vocalizações inatas e aptidões de mímica, mas também pelas suas capacidades cognitivas, comparadas às dos primatas. A origem destas duas características ainda é discutida a nível evolutivo, neurobiológico, ecológico, fisiológico, comportamental e acústico. As principais hipóteses evolutivas que as procuram explicar – a social brain hypothesis e a relationship intelligence hypothesis (hipótese de cérebro social e hipótese de inteligência relacional) – baseiam-se muito na complexa estrutura social, na predominância de monogamia e na variação diária de estratégias de alimentação destas aves para o aparecimento destes atributos. Além do mais, os psitaciformes são de grande interesse para a investigação sobre a evolução da linguagem, visto exibirem deriva cultural devido a migração de indivíduos entre populações, resultando em dialetos nos reportórios vocais. Contudo, os psitaciformes estão ainda pouco estudados, sobretudo comparando com a sua fama mundial como mímicos e aves decorativas. São animais de estimação exóticos comuns cujas populações selvagens estão sob pressão devido ao tráfico internacional de longa data, e que, ao mesmo tempo, se tornaram invasores de ambientes diferentes do seu por escaparem de cativeiro ou por serem libertados intencionalmente. Graças a estas duas condições, estão em ação programas de conservação para aumentar os números das populações naturais de várias espécies deste grupo taxonómico em perigo, enquanto elementos de outras espécies se tornaram vizinhos numerosos e inesperados em áreas humanizadas. Propus-me a descrever os reportórios vocal e comportamental numa espécie australiana pouco conhecida de psitaciformes, os rainbow lorikeets (Trichoglossus moluccanus) ou lórios-arco-íris, e correlacioná-los com hipóteses de aprendizagem vocal e evolução de cognição. Esta espécie invasora exibe interações sociais complexas, neofilia e bioacústica diversa e ainda por estudar. Este objetivo foi conseguido através de observações e gravações de comportamento e vocalizações, durante várias semanas, e foram feitas análises estatísticas e acústicas usando espectrogramas e 20 parâmetros acústicos selecionados. Estas revelaram uma dinâmica de grupo complexa entre os 11 indivíduos analisados, com sinais de hierarquia independente do sexo através de interações agonísticas e o casal como a unidade social do grupo. Os seus reportórios comportamental e vocal aqui apresentados são os mais completos nesta espécie até agora, incluindo descrições de 45 comportamentos discretos e as características acústicas de 12 tipos de vocalizações distintos, com a respetiva associação contextual entre os dois repertórios. Um evento de acasalamento completamente registado, sem precedentes em lórios arco-íris, é descrito em detalhe do início ao fim. Adicionalmente, há indícios de uma possível convergência das vocalizações dentro do grupo, devido à falta de diferenças acústicas significativas entre as vocalizações dos indivíduos ou entre as dos dois sexos, o que poderia indicar uma adaptação de indivíduos de origens diferentes origens à vida num grupo fechado ao longo dos últimos anos. Grupos numerosos de Trichoglossus moluccanus têm surgido em algumas das maiores cidades da Austrália, uma mostra do forte poder adaptativo destes psitaciformes de comportamento complexo e capacidades vocais dinâmicas. Analisadas através de um estudo descritivo, algo raramente observado hoje em dia, estas características fazem desta espécie uma mais-valia na investigação tanto de populações selvagens como em cativeiro, em temas como a ecologia de psitaciformes, a influência da presença humana no seu comportamento, a evolução de dialetos e comportamentos ritualizados devido a diferenciação cultural, as capacidades de aprendizagem e mímica vocal, e por fim a evolução da cognição, inteligência e linguagem em geral e em não-primatas. Em simultâneo, descobertas em espécies como estas podem ajudar a melhorar esforços de conservação em espécies semelhantes em vias de extinção, ao aumentar o conhecimento sobre Psittaciformes e ao realçar a importância da assimilação cultural em programas de reintrodução.Psittaciformes, or parrots, are universally and historically recognized not only for their innate vocalizations and mimicry skills, but also for their cognitive skills, compared to the ones of primates. The origin of these two features is still discussed, many times symbiotically, on various biological and scientific levels. The two main evolutionary hypotheses that explain these – the social brain hypothesis and the relationship intelligence hypothesis – greatly draw on the complex social structure, predominance of monogamy and daily foraging variety of these birds as a basis for the appearance of these attributes. Psittaciformes are, furthermore, of interest on the research of the evolution of language, since they too exhibit cultural drift from flow of individuals between populations, resulting in dialects in the vocalization repertoires. Parrots are, however, not very well studied in relation to their worldwide fame. They are common exotic pets whose wild populations are under threat due to long-lasting intense trading market, and at the same time have become invaders of new environments by escaping or being deliberately released. My aim was to describe the vocal and behavioural repertoires of a previously less-know Australian parrot, Trichoglossus moluccanus, or rainbow lorikeets, and correlate these with hypotheses on vocal learning and evolution of cognition. Through a descriptive study complete by and acoustical approach, these birds showed complex group dynamics between the 11 analysed individuals and evidence of a possible convergence of vocalizations within the group. Their behavioural and vocal repertoire here described are the most complete on this species so far, including 45 behaviours and the acoustic characteristics of 12 call types, with respective contextual association between the two. One fully recorded mating event, unprecedented in rainbow lorikeets, is described in detail. These features make this species one of good value for research on both its healthy wild and captive populations, on themes such as parrot ecology, the influence of the human presence on their behaviour, the evolution of dialects and ritualized behaviours from cultural differentiation, vocal learning and mimicry, and the evolution of non-primate and general cognition, intelligence and language. Findings on species such as these could help improve conservation efforts to similar endangered species, through the increase of knowledge on this taxonomic group, while calling attention to the importance of cultural assimilation in programs for reintroduction

Quality Evaluation of Requirements Models: The Case of Goal Models and Scenarios

Context: Requirements Engineering approaches provide expressive model techniques for requirements elicitation and analysis. Yet, these approaches struggle to manage the quality of their models, causing difficulties in understanding requirements, and increase development costs. The models’ quality should be a permanent concern. Objectives: We propose a mixed-method process for the quantitative evaluation of the quality of requirements models and their modelling activities. We applied the process to goal-oriented (i* 1.0 and iStar 2.0) and scenario-based (ARNE and ALCO use case templates) models, to evaluate their usability in terms of appropriateness recognisability and learnability. We defined (bio)metrics about the models and the way stakeholders interact with them, with the GQM approach. Methods: The (bio)metrics were evaluated through a family of 16 quasi-experiments with a total of 660 participants. They performed creation, modification, understanding, and review tasks on the models. We measured their accuracy, speed, and ease, using metrics of task success, time, and effort, collected with eye-tracking, electroencephalography and electro-dermal activity, and participants’ opinion, through NASA-TLX. We characterised the participants with GenderMag, a method for evaluating usability with a focus on gender-inclusiveness. Results: For i*, participants had better performance and lower effort when using iStar 2.0, and produced models with lower accidental complexity. For use cases, participants had better performance and lower effort when using ALCO. Participants using a textual representation of requirements had higher performance and lower effort. The results were better for ALCO, followed by ARNE, iStar 2.0, and i* 1.0. Participants with a comprehensive information processing and a conservative attitude towards risk (characteristics that are frequently seen in females) took longer to start the tasks but had a higher accuracy. The visual and mental effort was also higher for these participants. Conclusions: A mixed-method process, with (bio)metric measurements, can provide reliable quantitative information about the success and effort of a stakeholder while working on different requirements models’ tasks

How companies evaluate their investment in social media? : a field study of B2B and B2C cases

Purpose – The primordial purpose of this thesis is to understand which are the main measures of return on investment (ROI) used by B2B and B2C companies to evaluate social media marketing (SMM) programmes. Secondly, the research aims to understand how these companies invest in these kinds of marketing programmes and the metrics used to assess their effectiveness. Method – A multiple case-studies approach was employed for this study. Data was collected from personal interviews with eight marketing managers responsible for social media activity, from four B2B and four B2C companies, in order to understand the importance of their presence on social platforms for their companies, the budget allocated to social media marketing and the measures of ROI used. Then, to go deeper in the study, an online survey based on the results of case studies was performed with 28 other companies’ marketing managers. Findings – In general, marketing managers for both B2B and B2C companies are closer to the vision that SMM programmes “can be readily measured” through simple metrics. The principal measures used by the cases studied relate to objectives of awareness, engagement, reach and revenue. Some of the metrics identified are interaction data, conversions to sales and number of leads. Moreover, some constraints have been noted when explaining the ROI measurement process of SMM campaigns in certain companies. The case studies show some differences between B2B and B2C companies in the management of SMM, but the survey just confirms differences in the definition of SMM goals. Research limitations and future directions – Given the complexity of the topic approached and the differences between the findings of the case studies and the survey, interviews with marketing managers from more companies or more answers to the digital survey would provide a more comprehensive view of the topic as well as the generalisation to the population. Practical implications – The research identifies several measures for B2B and B2C companies to evaluate the effectiveness of SMM programmes. Theoretical implication – Given the increasing development of social media and its use for business purposes, this thesis is an exploratory step toward the ways firms use and evaluate the return of their investment in these channels, namely for B2B companies, where there is still little research

Development of a membrane based detection of Candida albicans

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica , apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Candida é uma família de fungos, normalmente, presente na flora gastrointestinal, nos orgãos genitais, no sistema respiratório e na pele de pessoas saudáveis e, até determinada quantidade, não trazem nenhum risco. Apenas 17 espécies de Candida podem ser consideradas como patogénicas para o ser humano e, dentro deste grupo, Candida albicans é a espécie mais comum e pode ser facilmente encontrada em ambiente hospitalar, comida, solo e outros animais, sendo, por isso, a probabilidade de adquirir este fungo elevada. Candida albicans é unicelular e com forma ovóide, tendo entre 4 e 6 μm de diâmetro. Esta espécie reproduz-se produzindo blastoconídios (ou gêmulas) e quando o processo de divisão não está completo produz pseudo-hífas ou, dependendo das condições, pode mesmo produzir hífas. O nível de desenvolvimento de hífas promove a patogenicidade deste tipo de fungos. C. albicans cresce aerobicamente em ambientes com temperaturas entre 25 e 37ºC e formam colónias redondas e brancas após 48 - 72h de incubação em pratos de agar. Como foi referido, C. albicans é geralmente inofensiva. No entanto, certas alterações no corpo, como variações de pH, podem provocar o crescimento excessivo deste fungo, potenciando a sua patogenicidade e tornando-se a causa de uma série de condições médicas incluindo infecções vaginais ou orais. Estas infecções podem ter também fontes exógenas, como uso de catéteres ou transmissão entre pessoas. Quando a infecção por C. albicans, designada por Candidíase, atinge a corrente sanguínea facilmente se dissemina para outros orgãos internos. Este é o estágio de infecção mais grave pois o seu diagnóstico é difícil e, caso não seja feito em tempo útil, pode ter consequências graves. Este fungo pode atingir a corrente sanguínea quando o sistema imunitário do doente se encontra comprometido. O uso excessivo de antibióticos, o crescimento do números de tratamentos invasivos aplicados (como quimioterapia e o transplante de órgãos) que comprometem o sistema imunológico dos doentes, juntamente com o aumento de portadores de HIV faz com que o grupo de risco seja elevado e tem provocado um aumento do número de casos de Candidíase Invasiva. As espécies de Candida são a causa de 70-80% de infecções do sangue causadas por fungos, e 45-65% destes casos são causados por Candida albicans. Para além dos custos médicos que estes casos representam, 40% deles levam os pacientes à morte, sendo as infecções causadas por Candida albicans consideradas um problema de saúde pública. A principal razão para a elevada taxa de mortalidade referida deve-se ao facto deste tipo de infecções gerarem sintomas que são comuns a outros tipos de problemas, como febre ou outro tipo de sintomas dependendo do orgão atingido. Caso o organismo não responda ao tratamento utilizado, os órgãos do paciente podem parar de funcionar. Outra razão que contribui para dificultar o tratamento eficiente deste tipo de infecções são as próprias técnicas de diagnóstico presentes no mercado. O uso de técnicas de cultura é o mais utilizado para diagnóstico de infecções por fungos. No entanto, esta técnica demora entre 4 a 16 dias até confirmação do resultado definitivo e, para além disso, é muito pouco sensível, sendo 50% dos resultados falsos negativos. Outra técnica utilizada é ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), um teste imunoenzimático que permite a detecção de antigénios específicos (por exemplo, determinados anticorpos no plasma sanguíneo). Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças e baseia-se na ligação do analito a ser detectado ao anticorpo específico desse analito e na posterior adição de um substracto que, caso essa ligação antigénio-anticorpo se verifique, muda de cor. Em adição, a densidade óptica deste produto dá informações sobre a concentração de antigénio presente. Esta técnica é altamente sensível mas bastante complexa e trabalhosa, demorando entre 2 a 3 dias para o resultado final. Concluindo, os métodos de detecção utilizados actualmente, são, em geral, complexos e demorados. Sendo por isso necessária a investigação de métodos mais rápidos, sensíveis e fáceis de utilizar. A área de biosensores está em grande desenvolvimento pelo seu potencial de redução da duração do processo de detecção e obtenção do resultado final, no entanto, ainda é necessário mais investigação para que eles sejam eficientes o suficiente para o seu uso na prática. Um biosensor é um sistema que converte uma resposta biológica a um analito específico num sinal mensurável. Os sistemas de transdução destes sinais podem ser, por exemplo, piezoeléctricos, ópticos ou electroquímicos. Os sensores electroquímicos são bastante utilizados na área de biosensores, inclusive com aplicações biomédicas com o objectivo de estudar as propriedades electroquímicas dos materiais e reações entre diferentes elementos biológicos. Um tipo de elementos biológicos associados aos sensores electroquímicos são anticorpos que funcionam como o elemento que permitem a identificação e detecção de diferentes tipos de antigénios, como fungos. Esta associação entre biossensores electroquímicos e anticorpos têm apresentado bons resultados em termos de sensibilidade e selectividade. Assim, tendo em conta a necessidade existente de um novo sistema de detecção de Candida albicans mais eficiente, este projecto consistiu no desenvolvimento de um biossensor electroquímico baseado na funcionalização de eléctrodos de ouro aplicados na superfície de uma membrana com anticorpos específicos C. albicans e cuja a reacção entre anticorpos e células provoca uma alteração da impedância da superfície dos eléctrodos permitindo assim a detecção da presença de Candida albicans na amostra analisada. A produção dos eléctrodos é feita sobre uma membrana pois a ideia do projecto final, que deverá continuar em desenvolvimento, é a produção de um sistema de filtragem que permita a separação dos vários elementos constituintes do sangue das células de C. albicans, de modo que o processo de tratamento da amostra e a sua detecção sejam feitos no mesmo dispositivo e em simultâneo. O projecto foi dividido em três grandes etapas. A primeira etapa consistiu na utilização da técnica ELISA, por ser um método já bastante desenvolvido e utilizado, para analisar os anticorpos utilizados e ter esta experiência como referência para os resultados futuros. No entanto, embora seja uma técnica comum, é bastante difícil de optimizar. Ainda assim, foi possível concluir que tipo de anticorpos a utilizar nas etapas seguintes é anti-candida policlonal e qual o limite de detecção desta técnica, 1680 CFU/ml (CFU significa unidade formadora de colónias e corresponde ao número de colónias contabilizadas na amostra em análise). A segunda etapa consistiu no estudo de qual a técnica de funcionalização mais eficiente a ser aplicada nas superfícies de ouro dos eléctrodos. Esta é uma das fases mais críticas no desenvolvimento de um sensor, pois é através da funcionalização adequada dos eléctrodos que é possível que a detecção ocorra. Assim, dependendo do processo de modificação da superfície, o sensor vai ser mais ou menos eficiente, quer a nível de selectividade, quer a nível de sensibilidade. Foram testados dois métodos diferentes, sendo que ambos utilizam a molécula LC-SPDP (succinimidyl 6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate) como cross-linker. No Protocolo 1, esta molécula foi previamente ancorada aos anticorpos e só depois eles foram aplicados à superfície. No Protocolo 2, o cross-linker foi primeiro aplicado à superfície dos eléctrodos e só depois os anticorpos foram utilizados para finalizar a modificação da superfície. Como método de avaliação da eficiência dos protocolos as células foram marcadas com um marcador de fluorescência, e após o tratamento das superfícies, incubação das células e lavagem para remoção das células que não foram capturadas pelos anticorpos, as superficies foram analisadas ao microscópio e o número de células à superfície foi contado. O Protocolo 1 verificou-se mais eficiente e, por isso foi o aplicado à última etapa do projecto. A última etapa do projecto consistiu no desenvolvimento do sistema electroquímico de detecção de Candida albicans em meio de cultura. Para tal, foi aplicado o Protocolo 1 de funcionalização e analisados vários espectros de impedância obtidos nas várias experiências que foram efectuadas de forma a caracterizar o sensor e optimizar o processo de detecção. Foram estudadas várias fases, desde optimização do processo de limpeza da superfície dos eléctrodos sem a degradar; testadas várias concentrações de anticorpos na funcionalização dos eléctrodos e, por fim, foram realizados testes para estudar a sensibilidade e selectividade do sensor na detecção de C. albicans. Dentro das várias experiências efectuadas foram obtidos resultados bastante promissores tendo sido possível atingir níveis de detecção de concentrações relevantes para a aplicação em ambiente clínico, 150 CFU/ml.Candida albicans (C. albicans) is a yeast that can be found in 80% of the population. It is a normal constituent of the human flora and is commonly found in the gastrointestinal tract and in the female genital tract. In people with low immunity, such as HIV (human immunodeficiency virus) patients and radiotherapy patients, this common yeast can cause serious problems. In fact, Candidemia is one of the most common fungal infections in human and it is difficult to eradicate due to the resistance of this yeast. The detection systems available nowadays involve techniques such yeast culturing and PCR (polymerase chain reaction) that are in general time consuming. In order to reduce the time of detection and also to identify early stages of the infection (low concentrations of yeast) we propose a new system of filtration of the blood sample integrated with electrochemical gold electrodes functionalized with specific antibodies to detect C. albicans. The novel sensor consists of the gold electrodes directly fabricated on a filter membrane. Electrochemical sensors are widely used in the biosensor field in order to study and detect reactions between different biological elements transforming these reactions into electrical signals. The first step of building a functional sensor is the development of the functionalization protocol. Here, we tested two different protocols of antibody immobilization. Protocol 1 consists of the attachment of a cross-linker on the tip of the antibody allowing for a better affinity to the surface and an oriented position of the antibody during the functionalization. Protocol 2 has the same purpose as Protocol 1, to allow a better affinity and orientation of the antibodies, but it is made with a different order. The attachment of a cross-linker is directly made on to the gold electrodes’ surface and, only after the preparation of the surface, the antibody is incubated to bind to the cross-liker. In order to compare both protocols, the C. albicans cells were marked with a fluorescent cell tracker and the number of cells in each sample was counted. The protocol with best results was Protocol 1. After the selection of the best functionalization protocol, the developed membrane-based sensor capable of detecting Candida albicans yeast in culture broth is presented in this work. The yeast cells were captured on electrodes specifically functionalized with anti-C.albicans antibodies during 15 minutes incubation and detection is achieved by electrochemical impedance spectroscopy. The sensor allows for quick detection of the yeast cells at clinically relevant concentrations (150 CFU/ml)