Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Despite the efforts towards eradication, malaria remains the most deadly parasitic and vector-borne disease, urging for the development of an effective antimalarial vaccine. Recently, a renewed interest in Plasmodium attenuated whole-organism vaccine strategies has emerged, long acknowledged to experimentally induce full and sterile immunity against malaria in mice, monkeys and humans. This approach involves the use of non-replicating but metabolic active sporozoites, either attenuated by exposition to radiation, the Radiation-Attenuated Sporozoites (RAS), or by genetic modification, the Genetically-Attenuated Sporozoites (GAS). These attenuated parasites are able to infect hepatocytes in vivo as normal sporozoites, but are unable to fully develop in the liver. This arrest in development has been associated with their apparent failure to prevent host cell apoptosis, which leads to the formation of apoptotic bodies filled with parasite antigens. Several pieces of evidence have suggested that these apoptotic bodies may provide an optimal source of antigens for dendritic cells cross-presentation, and therefore, immune response activation. The aim of this project was to assess whether apoptosis of RAS or GAS infected hepatocytes is involved in the induced protective immunity response against subsequent parasite challenges. Results obtained through the immunization of C57BL/6 background caspase-3 deficient mice with P. berghei RAS or p36p- GAS revealed that these mice are only partially protected against further infection. These suggest that at least to some extent, caspase-3 mediated apoptosis of infected hepatocytes may be important in generation of immunity by attenuated parasites.Em pleno século XXI, e apesar de todas as medidas de controlo implementadas ao longo dos anos, a malária continua a ser uma das doenças mais mortíferas a assolar a humanidade. Só no ano de 2008, a malária foi responsável por 243 milhões de casos de doença e quase um milhão de mortes, maioritariamente no continente Africano. A malária, ou paludismo, é causada por parasitas pertencentes ao género Plasmodium, um grupo de protozoários capazes de infectar grupos diversificados de animais vertebrados como mamíferos, aves e répteis. Em humanos, a malária é causada maioritariamente por quatro espécies, P. falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae, e é transmitida através da picada de mosquitos fêmea infectados do género Anopheles. Uma vez inoculado no hospedeiro mamífero, o parasita, sob a forma de esporozoíto, inicia a fase assexuada do seu ciclo de vida, desenvolvendo-se inicialmente assintomaticamente no fígado, onde milhares de merozoítos, a forma do parasita capaz de infectar eritrócitos, são originados. Uma vez libertados na corrente sanguínea, os merozoítos rapidamente infectam eritrócitos, dando origem a mais merozoítos, e iniciando a fase eritrocitária do seu ciclo de vida e sintomática da doença. Contudo, ao fim de alguns ciclos de multiplicação em eritrócitos, alguns merozoítos acabam por gerar gametócitos, as formas sexuais do parasita, que são ingeridas pelo mosquito aquando da sua refeição de sangue. No mosquito, os gametócitos dão início à fase sexuada do ciclo de vida do parasita, que culmina com a formação de esporozoítos capazes de infectar novos hospedeiros mamíferos. Durante décadas, muitos esforços têm sido empregues com o intuito de erradicar a malária. Contudo, estes têm-se revelado infrutíferos, e tanto parasitas como mosquitos resistentes às medidas de controlo empregues têm emergido nos últimos anos. Perante este cenário, tem-se sugerido que o desenvolvimento de terapias capazes de bloquear a transmissão do parasita do Homem para o mosquito, nomeadamente o de uma vacina eficaz contra a malária, é urgentemente necessário e crucial para se alcançar a erradicação da doença. Há muito que se tenta desenvolver uma vacina anti-malárica eficaz. No entanto, tal tem-se revelado um dos maiores desafios da medicina, principalmente devido à extraordinária complexidade do ciclo de vida do parasita, durante o qual este se desenvolve e diferencia em formas que apresentam uma morfologia, metabolismo e conteúdo antigénico completamente distintos consoante a fase em que o parasita se encontra. A fase hepática constitui um alvo ideal para o desenvolvimento de uma vacina, uma vez que o desenvolvimento de uma vacina pré-eritrocitária eficaz teria simultaneamente capacidade profiláctica e de bloqueio da transmissão: a eliminação das formas pré-eritrocitárias do parasita (o esporozoíto e a forma exo-eritrocitária em desenvolvimento – EEF - dentro dos hepatócitos), permitiria impedir o aparecimento dos sintomas da infecção e, consequentemente, a transmissão do parasita ao mosquito. Contudo, uma vacina pré-eritrocitária tem que ser 100% eficaz em eliminar o parasita: basta que um esporozoíto se desenvolva completamente no fígado para que ocorra doença e, consequentemente, transmissão. Vários estudos demonstram que a administração de esporozoítos atenuados mas metabolicamente activos é capaz de induzir uma resposta imune eficiente de longa duração em ratinhos, macacos e humanos, contra futuras infecções por esporozoítos. De facto, a desilusão relativa à eficácia de vacinas baseadas apenas em partes recombinantes de antigénios do parasita tem despertado um grande interesse para o desenvolvimento de uma vacina usando esporozoítos vivos atenuados que, em última análise, constitui uma vacina multi-antigénica e em tudo semelhante ao parasita infeccioso. Os esporozoítos podem ser eficientemente atenuados através da sua exposição a uma determinada dose específica de radiação ionizante (X ou γ) (radiation attenuated sporozoites - RAS), ou da sua manipulação genética, em que genes essenciais para o desenvolvimento das formas pré-eritrocitárias do parasita são danificados (genetically attenuated sporozoites - GAS). Em ambas as estratégias de atenuação, os esporozoítos atenuados mantêm a sua capacidade de invadir hepatócitos, tal como o parasita selvagem, mas demonstram uma grave deficiência no seu desenvolvimento uma vez dentro da célula hospedeira, que os impede de produzir merozoítos e assim, causar doença. Esta deficiência em completar o seu desenvolvimento dentro do hepatócito tem sido associada com a incapacidade que os parasitas atenuados têm de inibir a apoptose da célula hospedeira. Ao longo da evolução, os microrganismos intracelulares desenvolveram mecanismos que lhes permitem manipular os processos biológicos da célula hospedeira para seu benefício. Um dos processos que mais pressão selectiva tem imposto aos microrganismos intracelulares tem sido a morte das células hospedeiras por apoptose. Apesar de a apoptose poder ser desencadeada através de diversos estímulos e vias de sinalização, a via extrínseca, accionada por ligandos extracelulares, e a via intrínseca, desencadeada por sinais internos como o stress, são as mais comuns em células de mamíferos. Embora sejam despoletadas por diferentes estímulos, as duas vias apoptóticas convergem na activação de efectores comuns, as proteínas caspase, nomeadamente a da caspase-3, que aquando da sua activação, leva em última instância à morte celular e à resultante formação de corpos apoptóticos. Tal como em outros microrganismos intracelulares, tem sido demonstrado que os estádios pré-eritrocitários de Plasmodium possuem a capacidade de inibir a apoptose dos hepatócitos infectados, tanto aquando do processo de invasão, como durante os estádios iniciais e tardios do seu desenvolvimento. Aparentemente, a protecção da célula hospedeira à apoptose durante o desenvolvimento do parasita requer que este se mantenha vivo, e possivelmente, em processo de desenvolvimento. Várias observações sugerem que os parasitas atenuados, tanto RAS como GAS, são incapazes de evitar que a célula infectada entre em processo de apoptose e que, de facto, a imunidade gerada aquando da imunização com os parasitas atenuados resulta da sua incapacidade em proteger a célula hospedeira de entrar em apoptose aquando da infecção. Quando a célula infectada sofre apoptose, formam-se corpos apoptóticos carregados com antigénios celulares e do parasita. Estes podem depois ser fagocitados por células apresentadoras de antigénios, tais como macrófagos e células dendríticas. Posteriormente, estas células podem fazer a apresentação destes antigénios ao sistema imunitário, desencadeando respostas imunes específicas contra o parasita. Vários estudos têm associado as células dendríticas com o estabelecimento da imunidade protectora induzida pelos parasitas atenuados, apontando-as como o veículo entre as células infectadas em apoptose e o sistema imunitário. De facto, as células dendríticas encontram-se associadas com a apresentação de antigénios exógenos através de moléculas de histocompatibilidade de classe I a células T CD8+, os principais elementos da resposta imune celular gerada pelos parasitas atenuados. O presente trabalho pretende testar a hipótese de que a apoptose das células infectadas com os parasitas atenuados se encontra intimamente relacionada com o estabelecimento bem sucedido da resposta imune gerada por estes parasitas contra posteriores infecções por esporozoítos infecciosos. Recorrendo a ratinhos da linhagem C57BL/6 deficientes em caspase-3 (Casp3KO), um elemento-chave em diversas vias da apoptose, vários ensaios de imunização com parasitas P. berghei ANKA atenuados, quer por a radiação γ (Pb-RAS), ou por manipulação genética (Pbp36p-), foram realizados. Em cada ensaio, a posterior infecção foi efectuada com esporozoítos P. berghei ANKA que expressam constitutivamente a proteína de fluorescência verde (PbGFP) ou luciferase (PbLuci). Estes parasitas permitem, respectivamente através da análise por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) ou imagiologia in vivo em tempo real, inferir o nível de infecção no fígado e assim, a eficiência do regime de imunização. Contudo, o estabelecimento de uma resposta imunitária completamente eficiente contra a infecção foi apenas irrefutavelmente depreendida através da vigilância e seguimento do aparecimento de parasitas no sangue dos animais. Estes ensaios permitiram-nos verificar que os ratinhos Casp3KO encontram-se apenas parcialmente protegidos contra a infecção com esporozoítos infecciosos, sugerindo que as vias apoptóticas dependentes de caspase-3 se encontram possivelmente envolvidas no estabelecimento da imunidade induzida pelos parasitas atenuados. De modo a excluir a possibilidade de que a imunidade parcial observada nos ratinhos Casp3KO se deve a uma deficiência ao nível do sistema imunitário destes animais, uma vez que se pensa dever à diminuição do nível de apoptose das células infectadas no fígado, a medula óssea de ratinhos Casp3KO foi substituída pela de ratinhos C57BL/6 normais, e vice-versa. Os ratinhos quimera resultantes foram imunizados com Pb-RAS, e posteriormente infectados com PbLuci. Infelizmente, este ensaio não nos permitiu retirar quaisquer conclusões concretas, apesar de sugerir que o fenótipo observado nos ratinhos Casp3KO imunizados se deve à sua maior resistência à apoptose nas células hepáticas infectadas com os parasitas atenuados. Através de uma sonda fluorescente que permite detectar níveis de apoptose in vivo, foi-nos possível inferir que há um aumento do nível de apoptose no fígado de ratinhos C57BL/6 infectados com PbRAS, que é aparentemente superior ao observado em ratinhos Casp3KO infectados com os mesmos parasitas, e ratinhos C57BL/6 infectados com parasitas infecciosos. Estes resultados permitem-nos de certo modo confirmar as observações de que os parasitas atenuados por radiação são incapazes de proteger a célula hospedeira de sofrer apoptose. Em conjunto, os resultados aqui apresentados aparentam suportar a hipótese proposta, de que a apoptose das células infectadas com parasitas atenuados é relevante para o estabelecimento da resposta imune efectiva induzida por estes. Perante este panorama, planeámos construir um parasita P. berghei ANKA transgénico que expressa e exporta para o citoplasma das células hospedeiras caspase-2, um factor pró-apoptótico, com o intuito de induzir a apoptose das células infectadas e inferir se a infecção de ratinhos com este parasita é capaz de induzir uma resposta imune eficaz contra infecções posteriores com esporozoítos infecciosos P. berghei ANKA
