Mutationen des Fanconi-assoziierten Proteins 2 (FAP2) als Ursache einer erblichen renalen Tubulopathie

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine neuartige, autosomal-dominant vererbte Form des renalen Fanconi-Syndroms untersucht. Neben der klassischen proximalen Tubulopathie, die bereits in der Kindheit einsetzt und eher mild ausfällt, kommt es bei allen betroffenen Patienten im Erwachsenenalter zu einem terminalen Nierenversagen und zur Ausbildung fibrotischer Schrumpfnieren. Über Kopplungsanalysen konnte das betroffene Gen identifiziert werden, dessen Genprodukt als Stoffwechselenzym normalerweise in den Mitochondrien frühproximaler Tubuluszellen lokalisiert ist. Durch die Untersuchung des renalen Phänotyps einer FAP2 („Fanconi-assoziiertes Protein 2“) Knockout Maus konnte eine Haploinsuffizienz als Ursache der Krankheitsentstehung ausgeschlossen werden. Diese Mäuse zeigten keine Symptome eines Fanconi-Syndroms. Es hat sich herausgestellt, dass mutiertes FAP2 in der mitochondrialen Matrix mit sich selbst aggregiert und sich dort in Form langer Fibrillen ablagert. Dies konnte sowohl im verwendeten Zellmodell (stabil transfizierte, induzierbare LLC-PK1 Zellen), als auch in der untersuchten Patientenbiopsie nachgewiesen werden. Als Folge davon werden über einen bisher noch nicht im Detail bekannten Mechanismus schwere Entzündungs-prozesse, das Absterben von proximalen Tubuluszellen und eine Fibrose induziert. Als Mechanismus, der diese Entzündungsprozesse anstößt, wurde eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasomenkomplexes nachgewiesen. In unserem Zellmodell konnte eine Erhöhung von NLRP3 auf mRNA-Ebene beobachtet werden, sowie auch eine Erhöhung von IL-18 auf mRNA- und auf Protein-Ebene. IL-18 ist ein bekannter potenter Entzündungsmediator, der in der Literatur bereits mit der Entstehung der Nierenfibrose in Zusammenhang gebracht wurde. Als Fibrose-Marker waren im Zellmodell die mRNA- und Protein-Expression des extrazellulären Matrixproteins Fibronektin 1 und des mesenchymalen Markers Glattmuskel-Aktin erhöht. Die Untersuchung einer post mortem Patientenniere zeigte in Übereinstimmung mit den in vitro Daten eine starke Fibrose, die sich über das gesamte Nierengewebe erstreckte. Zusammenfassend sind sehr wahrscheinlich die Aggregate von mutiertem FAP2 die Ursache für die Entstehung der vorliegenden Erkrankung. Interessanterweise lässt sich durch spezielle Nahrungssupplementationen die Expression von FAP2 als Stoffwechselenzym beeinflussen. So könnte eine Reduktion der Expression von mutiertem FAP2 eine Therapieoption darstellen, da dadurch die die Aggregatbildung reduziert werden kann

Quantitative Analyse des Survival of Motor Neuron(SMN)-Komplexes unter Verwendung von absoluter Quantifizierung SMN-Komplex-spezifischer Peptide durch synthetische stabilisotopenmarkierte Peptidanaloga

Der SMN-Komplex ist eine makromolekulare Einheit, die aus neun festen Untereinheiten (SMN, Gemin2-Gemin8, Unrip) und verschiedenen transienten Faktoren (SmB/B’, SmE, SmF, SmG, SmD1-D3) aufgebaut ist. Die Hauptaufgabe des ubiquitären Komplexes umfasst die Assemblierung der U snRNPs im Cytoplasma und ihre Translokation in den Zellkern, wo sie am Aufbau des Spleißosoms beteiligt sind. Durch Mutation oder Deletion des SMN1-Gens kann dieser Prozess gestört sein und dadurch Spinale Muskelatrophie (SMA) auslösen. SMA ist die zweithäufigste autosomal rezessiv vererbbare Krankheit mit Todesfolge nach Mukoviszidose, die zu einer Degeneration der -Motorneuronen des Rückenmarks und damit zu einer Schwächung und einem Abbau der Muskulatur führt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des humanen Survival of Motor Neuron-Komplex (SMN) hinsichtlich Zusammensetzung und Stöchiometrie mittels Anwendung von massenspektrometrischen Methoden. In diesem Zusammenhang wurde die native stöchiometrische Zusammensetzung des zentralen SMN-Komplexes mit zwei rekombinanten Komplexen verglichen, die beide eine in Verbindung mit SMA bekannte Mutation (Y272C, E134K) integriert hatten. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp-SMN und die mutierten SMN-Analoga als GST-Fusions-Proteine zusammen mit Wildtyp-Gemin2, -Gemin6, -Gemin7 und -Gemin8 in Escherichia coli exprimiert. Nach Ernte und Lyse der Zellen wurde SMN auf einer Glutathion- Sepharose-Matrix angereichert und anschließend mittels verschiedener Methoden (Carbamidomethylierung, Trypsin-Verdau) für die massenspektrometrische quantitative Analyse vorbereitet. Des Weiteren wurden die Unterschiede zwischen dem cytoplasmatischen und dem nukleären SMN-Komplex, welche durch Zellkern-Cytoplasma-Trennung von HeLa-Zellen mittels eines modifizierten Roeder-Protokolls und anschließende Co-Immunopräzipitation gegen den SMNspezifischen Antikörper 7B10 erhalten wurden, untersucht. Für die Quantifizierung der SMN-Komplexe wurde Absolute Quantifizierung (AQUA) angewendet. Synthetische stabilisotopenmarkierte Petidanaloga wurden mit den nativen Proben in definierten Konzentrationen verdünnt und konnten während der massenspektrometrischen Analyse durch ihre Massendifferenz von 6 bis 10 Dalton im Vergleich zu den endogenen Peptiden detektiert werden. Zuvor mussten jedoch geeignete Peptidsequenzen ausgewählt werden, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu gewährleisten. Dazu mussten die Peptide definierten Spezifikationen entsprechen (z.B. keine leicht modifizierbaren Aminosäuren oder keine überlesenen tryptischen Schnittstellen beinhalten). Die MS-Analyse wurde mittels Selected Reaction Monitoring (S/MRM) auf zwei unterschiedlichen Triple-Quadrupol-Systemen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Übergänge und Systemparameter (Declustering Potential und Kollisionsenergie) für jedes einzelne Peptid optimiert und festgelegt. Alternativ wurde markierungsfreie Quantifizierung auf einem LTQ Obitrap Velos System angewandt. Die hohe Massengenauigkeit und Sensitivität des Hybrid-FT-MS-Systems erlaubt eine Quantifizierung der entsprechenden Mutterionen direkt aus der MS1-Spur (ohne Anwendung von Tandem-MS-Experimenten). Beide Strategien, S/MRM und MS1, erlauben eine Quantifizierung von Peptiden mit Konzentrationen bis 250 amol. Durch Optimierung des dargestellten Protokolls, war es möglich den Einfluss bekannter Patientenmutationen des SMN1-Gens auf die Stöchiometrie des SMNKomplexes zu untersuchen, sowie den Unterschied zwischen SMN-Komplexen des Cytoplasmas und des Zellkerns zu bestimmen. Dieses Projekt kann dazu beitragen sowohl die Assemblierung der U snRNPs besser zu verstehen, als auch neue Zielmoleküle für Diagnose und Therapie von genetischen Krankheiten wie SMA bereitzustellen.Summary The SMN complex is a macromolecular protein entity consisting of nine fixed subunits (SMN, Gemin2-Gemin8, Unrip) and several transient factors (SmB/B’, SmE, SmF, SmG, SmD1-D3). The main function of this housekeeping complex comprises the assembly of U snRNPs in the cytoplasm and their export to the nucleus where they build up the spliceosome. As a result of mutations in the SMN1 gene this process can be defective and elicits Spinal Muscular Atrophy (SMA). SMA is the second most common autosomal recessive hereditary disease beside cystic fibrosis resulting in death. It leads to a degeneration of the -motor neurons of the spinal cord and subsequently to muscular weakness and wasting. The aim of this study was the characterization of the human Survival of Motor Neuron (SMN) complex composition and stoichiometry by mass spectrometry. In this context, the native stoichiometric composition of the SMN core complex was compared with two recombinant complexes, each incorporating a known mutation (Y272C, E134K) involved in SMA. For this purpose wildtype SMN and mutated versions thereof were expressed as GST-fusion proteins together with full length Gemin2, Gemin6, Gemin7 and Gemin8 in E.coli. After harvesting and lysis of the cells the SMN complex was enriched on a glutathione-sepharose resin and further prepared by carbamidomethylation and tryptic digestion for a quantitaive massspectrometric analysis. Furthermore, the differences between the cytoplasmic and the nuclear SMN complex both derived from nuclei-cytoplasm separation of HeLa cells by a modified Roeder protocol and subsequent Co-immunoprecipitations against the SMN-specific antibody 7B19 were examined . In order to quantify the SMN core complex absolute quantification (AQUA) was applied. Stableisotope labeled peptide analogs were spiked to the native sample in defined amounts thus introducing a mass difference of 6-10 Da during the massspectrometric analysis. Preliminarily, appropriate peptides that meet several conditions (e.g. no labile amino acids, no missed tryptic digestion sites) to allow for a confident quantification were chosen. As MS-analysis was performed by Selected Reaction Monitoring (S/MRM) on two different triple quadrupol systems, transitions and parameters (Declustering Potential and Collision Energy) for each respective peptide were optimized . Alternatively, label-free quantitation on the LTQ Orbitrap Velos was applied. The high mass accuracy and sensitivity of this hybrid FT MS allows quantifying the respective parent ions directly from the MS1 trace. Both strategies, S/MRM and MS1, provide a linear quantification of peptides down to a concentration of 250 amol. By optimizing the current workflow, it was possible to determine the stoichiometry of SMN-complexes containing several known patient mutations within the SMN1 gene as well as discovering the differences between SMN-complexes originating either from cytoplasm or from nucleus. This project may help to throw a light on the assembly of U snRNPs and provide new targets in diagnosis and therapy for genetic diseases like SMA

Implementation and validation of a novel instrument for the grading of unexpected events in paediatric surgery: Clavien–Madadi classification

Background: Inconsistent definitions of complications and unexpected events have limited accurate analysis of surgical outcomes. Perioperative outcome classifications currently used for adult patients have limitations when used for children./ Methods: A multidisciplinary group of experts modified the Clavien–Dindo classification to increase its utility and accuracy in paediatric surgery cohorts. Organizational and management errors were considered in the novel Clavien–Madadi classification, which focuses on procedural invasiveness rather than anaesthetic management. Unexpected events were prospectively documented in a paediatric surgery cohort. Results of the Clavien–Dindo and Clavien–Madadi classifications were compared and correlated with procedure complexity./ Results: Unexpected events were prospectively documented in a cohort of 17 502 children undergoing surgery between 2017 and 2021. The results of both classifications were highly correlated (ρ = 0.95), although the novel Clavien–Madadi classification identified 449 additional events (organizational and management errors) over the Clavien–Dindo classification, increasing the total number of events by 38 per cent (1605 versus 1158 events). The results of the novel system correlated significantly with the complexity of procedures in children (ρ = 0.756). Furthermore, grading of events > grade III according to the Clavien–Madadi classification showed a higher correlation with procedure complexity (ρ = 0.658) than the Clavien–Dindo classification (ρ = 0.198)./ Conclusion: The Clavien–Madadi classification is a tool for the detection of surgical and non-medical errors in paediatric surgery populations. Further validation in paediatric surgery populations is required before widespread use

Understanding the Return of Genomic Sequencing Results Process: Content Review of Participant Summary Letters in the eMERGE Research Network

A challenge in returning genomic test results to research participants is how best to communicate complex and clinically nuanced findings to participants in a manner that is scalable to the large numbers of participants enrolled. The purpose of this study was to examine the features of genetic results letters produced at each Electronic Medical Records and Genomics (eMERGE3) Network site to assess their readability and content. Letters were collected from each site, and a qualitative analysis of letter content and a quantitative analysis of readability statistics were performed. Because letters were produced independently at each eMERGE site, significant heterogeneity in readability and content was found. The content of letters varied widely from a baseline of notifying participants that results existed to more detailed information about positive or negative results, as well as materials for sharing with family members. Most letters were significantly above the Centers for Disease Control-suggested reading level for health communication. While continued effort should be applied to make letters easier to understand, the ongoing challenge of explaining complex genomic information, the implications of negative test results, and the uncertainty that comes with some types of test and result makes simplifying letter text challenging

Mitochondrial physiology

As the knowledge base and importance of mitochondrial physiology to evolution, health and disease expands, the necessity for harmonizing the terminology concerning mitochondrial respiratory states and rates has become increasingly apparent. The chemiosmotic theory establishes the mechanism of energy transformation and coupling in oxidative phosphorylation. The unifying concept of the protonmotive force provides the framework for developing a consistent theoretical foundation of mitochondrial physiology and bioenergetics. We follow the latest SI guidelines and those of the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) on terminology in physical chemistry, extended by considerations of open systems and thermodynamics of irreversible processes. The concept-driven constructive terminology incorporates the meaning of each quantity and aligns concepts and symbols with the nomenclature of classical bioenergetics. We endeavour to provide a balanced view of mitochondrial respiratory control and a critical discussion on reporting data of mitochondrial respiration in terms of metabolic flows and fluxes. Uniform standards for evaluation of respiratory states and rates will ultimately contribute to reproducibility between laboratories and thus support the development of data repositories of mitochondrial respiratory function in species, tissues, and cells. Clarity of concept and consistency of nomenclature facilitate effective transdisciplinary communication, education, and ultimately further discovery

Peer-to-Peer-Konzepte zur Vermittlung von Informationskompetenz – Entwicklung einer neuen Informationsdienstleistung für die Campus-Bibliothek Finkenau der HAW Hamburg

Durch den Bologna-Prozess wurde die Studiendauer in einem Maße verkürzt, dass die Förderung der Fertigkeiten und Fähigkeiten hinsichtlich der Informationssuche, -bewertung und –aufbereitung nicht alleinig von den Hochschulen garantiert werden kann. Somit tritt die Hochschulbibliothek als Teaching Library sowie als Lern- und Lehr-raumgestalter zur Förderung von Informationskompetenz in den Fokus. Durch die Im-plementierung von innovativen didaktischen Ansätzen zur Förderung von IK, könnten Defizite und Probleme behoben und den Studierenden eine angenehme Lernat-mosphäre angeboten werden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem informellen, didaktischen Peer-Ansatz und des-sen praktische Umsetzung in wissenschaftlichen Hochschulbibliotheken. Der Theoretische Abschnitt gibt zunächst einen Überblick über die Hochschule für An-gewandte Wissenschaften Hamburg und dessen Infrastruktur. Folgen wird eine theore-tische Ausarbeitung der Thematik Informationskompetenz und die Rolle der Hoch-schulbibliothek als Teaching Library. Danach erfolgt die Darstellung des informellen Peer-Ansatzes. Dort werden mögliche Ausprägungen, Stand der Forschung und die Darstellung von Anwendungsbeispielen in Hochschulbibliotheken beschrieben. Der empirische Abschnitt enthält die Analyse der Interviews mit einem IK-Experten, der zukünftigen Leiterin der Campus-Bibliothek Finkenau, den Studierenden des Studi-engangs BIM B.A. sowie Peer-Experten. Auf Grundlage des theoretischen und empirischen Abschnitts wird ein Peer-to-Peer-Konzept für die neue Bibliothek entworfen

content analysis of counselling talks

Die stetige Zunahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas weltweit hat sich zu einem gravierenden Problem unserer Gesellschaft entwickelt. HausärztInnen kommt aufgrund ihrer guten Kenntnis der besonderen Situation von PatientInnen sowie der häufigen Patientenkontakte bei der Prävention und Behandlung der Adipositas eine entscheidende Rolle zu. Ursachen für die langfristig enttäuschenden Behandlungsergebnisse bei der Behandlung von Übergewicht sind auch in der Arzt-Patienten-Interaktion zu suchen, da unterschiedliche Sichtweise von ÄrztInnen und PatientInnen zum Krankheitskonzept Übergewicht nachgewiesen wurden. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sichtweisen sowohl der PatientInnen als auch der ÄrztInnen in Bezug auf die Ursachen, die Risikowahrnehmung und den Umgang mit Übergewicht durch ein qualitatives Studiendesign weiter zu vertiefen. Dazu wurden Beratungsgespräche der Gesundheitsuntersuchung (Check up 35) zwischen HausärztInnen und übergewichtigen PatientInnen (BMI ≥ 25kg/m²) in Berlin und Brandenburg auf Tonband aufgezeichnet und transkribiert. Es nahmen acht Ärztinnen und vier Ärzte an der Studie teil. 52 dieser Gespräche wurden mit Hilfe der qualitativen Inhaltsanalyse nach Mayring ausgewertet und durch das Datenanalyseprogramm „atlas.ti“ veranschaulicht. In Hinblick auf die Ursachenattribution konnten sowohl bei den ÄrztInnen als auch bei den PatientInnen verhaltensabhängige von nicht-verhaltensabhängigen Ursachen unterschieden werden. Sowohl ÄrztInnen als auch PatientInnen thematisierten u.a. intensiv verschiedene Aspekte zur Ernährung. Es konnte festgestellt werden, dass ÄrztInnen den Risikofaktor Übergewicht sehr unterschiedlich darlegten. PatientInnen benannten unterschiedliche Gefühlszustände, Folgeerkrankungen und Risikowahrnehmungen im Zusammenhang mit dem Übergewicht. Nicht alle ÄrztInnen sahen eine Gewichtsabnahme indiziert, selbst bei PatientInnen mit einem BMI ≥ 30 kg/m². Weiterhin zeigte sich, dass die von PatientInnen selbst eingebrachten Behandlungsvorschläge weitaus intensiver und umfassender waren, wenn diese spontan Lösungsansätze äußern konnten und nicht nur auf ärztliche Ratschläge reagierten. Die Analyse der Gespräche zeigte auch einen geschlechtsspezifischen Umgang mit der Thematik Übergewicht auf. Insgesamt konnten vielschichtige Aspekte zu den Beratungsinhalten der Check up-Untersuchung mit übergewichtigen PatientInnen dargestellt werden. Es zeigte sich, dass PatientInnen ein großes Potential von Lösungsansätzen mit in das Gespräch hineinbringen, das von ÄrztInnen für eine individuelle Adipositasberatung genutzt werden kann. Besonders auf ärztlicher Seite konnten Unstimmigkeiten über die Risikowahrnehmung der Adipositas erkannt werden. Die Therapieansätze der ÄrztInnen stellten sich außerdem teilweise als lückenhaft dar. Es ist zu vermuten, dass sich die Behandlungserfolge der Adipositas durch eine Optimierung dieser Aspekte verbessern lassen.The increasing prevalence of obesity is a major public health concern, since obesity is associated with several chronic diseases. General practitioners (GP) are uniquely placed to provide effective advice about weight management due to their knowledge of the patient’s social context and the frequent contacts. Reasons for the poor success in treating obesity can also be seen in the physician-patient-interaction, because different views of perceptions of the disease have been identified. The aim of this study was to explore the patients’ and the physicians’ beliefs and perceptions regarding causes, risks and treatment of obesity using a qualitative design. From April to September 2007, family physician encounters with obese patients (BMI ≥ 25kg/m²) were audiotaped. Four female physicians and eight male physicians participated in this study. After transcribing, a content analysis of 52 dialogues was performed using the method developed by Mayring. Patients and GPs attributed their overweight to both behavioural and non-behavioural-related causes. Especially different aspects of nutrition could be identified. GPs had different opinions about the health risks of obesity. The patients associated variable types of moods, diseases and risks with their overweight. Physicians had unequal opinions about addressing weight management issues, even in very obese patients. Some obese patients did not receive any advice. The aspects given by patients were remarkably more intense and widespread, if the patients had the chance to make own suggestions spontaneously. Furthermore, a gender- specific way of dealing with the topic overweight was elaborated. Summarised, a variety of aspects in the context of counselling overweight patients could be identified. The broad range of solutions provided by patients can be a chance for physicians to get valuable access to the patients’ perspectives and to give individual advice. Particularly the GPs showed contrary opinions of viewing obesity as health risk. The therapeutic approach revealed gaps in the GP’s knowledge of treating obesity. It can be assumed that the success of treating obesity can be improved if these aspects can be optimised