Kinetic studies of a xyloglucan endotransglycosylase, a key enzyme in plant cell morphogenesis

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat.El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato.The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis

The grape phylloxera plague as a natural experiment: the upkeep of vineyards in Catalonia (Spain), 1858-1935

We present a comparative analysis of the impact and outcome in Catalonia of the wine rush and crash unleashed by the spread of the Grape Phylloxera plague in Europe (1865-1890). In order to explain why many rural districts in the provinces of Barcelona and Tarragona were able to resume winegrowing after the plague, while most in the provinces of Girona and Lleida were not, a statistical model is used to check the economic resilience of the Catalan districts to the external ecological and economic shock. The model combines the population densities as a proxy of the opportunity cost in labour allocation, the demand pull of commercial growth measured by the time-distances to the city of Barcelona, and the agroclimatic land's suitability for growing vines, as measured by the Hugling and Winkler indices or the mean slopes of land. After comparing the vineyard allocation in every district in 1860, 1889 and 1920, these variables are used to explain the differing capacities to endure the Phylloxera plague in Catalonia

Explaining vineyard specialization in the province of Barcelona (Spain) in the mid-19th century

We present a statistical model of agrarian vineyard specialization in the province of Barcelona towards 1860, that combines the Boserupian push of population increase, the demand pull of a Smithian-type of growth (measured by the time-distances to the nearest seaport), and the agrological lands suitability for sowing grain or growing vines (as measured by water stress, slopes and frost risk). The overall outcome of the adjusted R2 levels, which range from 0.608 to 0.826, can be considered very successful. The inequality in land ownership is another factor that we believe to have played an important role, but has had to be omitted for the moment due to the lack of statistical data. Further research is also needed to deal with a possible endogeneity problem that working with socio-demographic variables entails.wine international market integration, regional land-use patterns, vineyard specialization, population pressure, agrological suitability

Passat, present i futur del món immobiliari

El plantejament de l’àmbit d’estudi serà doncs, fer un anàlisi de la situació política, econòmica, financera i immobiliària actual, per poder així, situar-nos en l’espai-temps. Complementant això amb l’estudi de l’últim any de la vivenda a Espanya i l’anàlisi del mercat barceloní, pretenem conèixer mitjançant un cas pràctic, el futur d’aquest món immobiliari

Explaining vineyard specialization in the province of Barcelona (Spain) in the mid-19th century

[cat] Presentem un model estadístic de l’especialització vitícola a la província de Barcelona cap el 1860 que combina la pressió boserupiana de l’augment de població, l’atracció de la demanda induïda per un creixement de tipus smithià (mesurada per les distancies horàries al port més proper), i l’adequació dels sòls disponibles per sembrar gra o plantar ceps (mesurada per l’estès hídric, el pendent i el risc de glaçades). L’assoliment global d’uns nivells de R2 ajustats que oscil·len entre 0,608 i 0,826 poden considerar-se força bons. Creiem que la desigualtat en la propietat de la terra també va jugar un paper molt important, però l’hem hagut d’ometre de moment per manca de dades estadístiques. També cal aprofundir en el tractament del problema de possible endogeneïtat derivat de l’ús de variables socio-demogràfiques.[eng] We present a statistical model of agrarian vineyard specialization in the province of Barcelona towards 1860, that combines the Boserupian push of population increase, the demand pull of a Smithian-type of growth (measured by the time-distances to the nearest seaport), and the agrological land’s suitability for sowing grain or growing vines (as measured by water stress, slopes and frost risk). The overall outcome of the adjusted R2 levels, which range from 0.608 to 0.826, can be considered very successful. The inequality in land ownership is another factor that we believe to have played an important role, but has had to be omitted for the moment due to the lack of statistical data. Further research is also needed to deal with a possible endogeneity problem that working with socio-demographic variables entails

Desenvolupament en plantes: recerca per alimentar el món

Antecedents : A la xerrada s’explica com la selecció d’al·lels en gens del desenvolupament que són rars a la natura ha estat clau per a l’agricultura. Es presenta un article que il·lustra els experiments que permeten establir els models del desenvolupament en plantes. L’article que s’explica demostra que WRKY2 controla la repolarització i divisió asimètrica de l’embrió activant l’expressió de WOX8. Aquests dos gens controlen també la definició del límit entre l’embrió i el suspensor.Rellevància: El paper de WRKY2 és clau en el correcte desenvolupament embrionari ja que controla l’expressió de gens WOX8 i 9, que són essencials per la primera divisió asimètrica del zigot. L’absència de WRKY2 impedeix la repolarització del zigot i la seva divisió asimètrica que donaria lloc l’embrió i el suspensor. D’altra banda, A més, els WRKY són únics de plantes i controlen  funcions molt diverses com la resitència a malalties, respostes a l’estrès abiòtic, senescència, desenvolupament de llavors i tricomes, embriogènesi, etc.

Organismes Transgènics: impacte en l'economia, la recerca i la societat

La població mundial actualment és de 6.700 milions de persones i creixerà fins als 9.200 milions d'habitants l'any 2050, segons preveuen les Nacions Unides. La lluita contra la pobresa i l'eradicació de la fam són els primers Objectius de Desenvolupament Sostenible,molt relacionats amb la capacitat de producció d'aliments. En aquest sentit, en aquest article s'aborda l'aportació que pot fer el desenvolupament científic en el camp de la biologia

Integrated Regulation of the Type III Secretion System and Other Virulence Determinants in Ralstonia solanacearum

In many plant and animal bacterial pathogens, the Type III secretion system (TTSS) that directly translocates effector proteins into the eukaryotic host cells is essential for the development of disease. In all species studied, the transcription of the TTSS and most of its effector substrates is tightly regulated by a succession of consecutively activated regulators. However, the whole genetic programme driven by these regulatory cascades is still unknown, especially in bacterial plant pathogens. Here, we have characterised the programme triggered by HrpG, a host-responsive regulator of the TTSS activation cascade in the plant pathogen Ralstonia solanacearum. We show through genome-wide expression analysis that, in addition to the TTSS, HrpG controls the expression of a previously undescribed TTSS-independent pathway that includes a number of other virulence determinants and genes likely involved in adaptation to life in the host. Functional studies revealed that this second pathway co-ordinates the bacterial production of plant cell wall-degrading enzymes, exopolysaccharide, and the phytohormones ethylene and auxin. We provide experimental evidence that these activities contribute to pathogenicity. We also show that the ethylene produced by R. solanacearum is able to modulate the expression of host genes and can therefore interfere with the signalling of plant defence responses. These results provide a new, integrated view of plant bacterial pathogenicity, where a common regulator activates synchronously upon infection the TTSS, other virulence determinants and a number of adaptive functions, which act co-operatively to cause disease

Sustainable natural bioresources in crop protection : antimicrobial hydroxycoumarins induce membrane depolarization-associated changes in the transcriptome of Ralstonia solanacearum

BACKGROUND: Ralstonia solanacearum is one of the most devastating pathogen affect crop production worldwide. Hydroxycoumarin (umbelliferone, esculetin, daphnetin) imply as sustainable natural bioresources on controlling of plant bacterial wilt. However, the antibacterial mechanism of hydroxycoumarins against plant pathogen still remains poorly understood. RESULTS: Here we characterized the effect of three hydroxycoumarins on the transcriptome of R. solanacearum. All three hydroxycoumarins were able to kill R. solanacearum, but their antibacterial activity impacted differently the bacterial transcriptome, indicating that their modes of action might be different. Treatment of R. solanacearum cultures with hydroxycoumarins resulted in a large number of the differentially expressed genes (DEGs), involved in basic cellular functions and metabolic process, such as downregulation of genes involved in fatty acid synthesis, lipopolysaccharides biosynthesis, RNA modification, ribosomal submits, oxidative phosphorylation and electrontransport, as well as upregulation of genes involved in transcriptional regulators, drug efflux, and oxidative stress responses. Future studies based on in vitro experiments are proposed to investigate lipopolysaccharides biosynthesis pathway leading to R. solanacearum cell death caused by hydroxycoumarins. Deletion of lpxB substantially inhibited the growth of R. solanacearum, and reduced virulence of pathogen on tobacco plants. CONCULSION: Our transcriptomic analyses show that hydroxycoumarins specific suppressed genes expression involved in fatty acid synthesis, RNA modification, ribosomal submits, oxidative phosphorylation and electrontransport. These findings provide evidence that hydroxycoumarins inhibit R. solanacearum growth through affect multi-target effect. Hydroxycoumarins could serve as sustainable natural bioresources against plant bacterial wilt through membrane destruction targeting the lipopolysaccharides biosynthesis pathway