The stress-responsive Hsp90 chaperone is required for the production of the genotoxin colibactin and the siderophore yersiniabactin by Escherichia coli

The genotoxin colibactin synthesized by Escherichia coli is a secondary metabolite belonging to the chemical family of hybrid polyketide/non-ribosomal peptide compounds. It is produced by a complex biosynthetic assembly line encoded by the pks pathogenicity island. The presence of this large cluster of genes in the E. coli genome is invariably associated with the High-Pathogenicity Island, encoding the siderophore yersiniabactin that belongs to the same chemical family as colibactin. The E. coli heat shock protein HtpG (Hsp90Ec) is the bacterial homolog of the eukaryotic molecular chaperone Hsp90 involved in the protection of cellular proteins against a variety of environmental stresses. In contrast to the eukaryotic Hsp90, the functions and client proteins of Hsp90Ec are poorly known. Here, we demonstrated that production of colibactin and yersiniabactin is abolished in the absence of Hsp90Ec We further characterized an interplay between the Hsp90Ec molecular chaperone and the ClpQ protease involved in colibactin and yersiniabactin synthesis. Finally, we demonstrated that Hsp90Ec is required for the full in vivo virulence of extraintestinal pathogenic E. coli This is the first report highlighting the role of heat shock protein Hps90Ec in the production of two secondary metabolites involved in E. coli virulence

Cyclic Poly(α-peptoid)s by Lithium bis(trimethylsilyl)amide (LiHMDS)-Mediated Ring-Expansion Polymerization: Simple Access to Bioactive Backbones

Cyclic polymers display unique physicochemical and biological properties. However, their development is often limited by their challenging preparation. In this work, we present a simple route to cyclic poly(α-peptoids) from N-alkylated-N-carboxyanhydrides (NNCA) using LiHMDS promoted ring-expansion polymerization (REP) in DMF. This new method allows the unprecedented use of lysine-like monomers in REP to design bioactive macrocycles bearing pharmaceutical potential against Clostridioides difficile, a bacterium responsible for nosocomial infections

New 8-nitroquinolinone derivative displaying submicromolar in vitro activities against both Trypanosoma brucei and cruzi

International audienceAn antikinetoplastid pharmacomodulation study was conducted at position 6 of the 8-nitroquinolin-2(1H)-one pharmacophore. Fifteen new derivatives were synthesized and evaluated in vitro against L. infantum, T. brucei brucei, and T. cruzi, in parallel with a cytotoxicity assay on the human HepG2 cell line. A potent and selective 6-bromo-substituted antitrypanosomal derivative 12 was revealed, presenting EC50 values of 12 and 500 nM on T. b. brucei trypomastigotes and T. cruzi amastigotes respectively, in comparison with four reference drugs (30 nM ≤ EC50 ≤ 13 μM). Moreover, compound 12 was not genotoxic in the comet assay and showed high in vitro microsomal stability (half life >40 min) as well as favorable pharmacokinetic behavior in the mouse after oral administration. Finally, molecule 12 (E° = −0.37 V/NHE) was shown to be bioactivated by type 1 nitroreductases, in both Leishmania and Trypanosoma, and appears to be a good candidate to search for novel antitrypanosomal lead compounds

La pénibilité au travail. Une question au cœur du management des ressources humaines

On November 9th ,2010, the law recognized and defined for the first-time strain in the workplace. Since then, substantial progress has been made in the field. Over the past ten years, the law has already been amended four times. These changes generated new duties for the companies. Duties, which are often fulfilled by the Human Resources Department (HRD). Indeed, it is the Human Resources Department which is, thanks to its skills, in the best position to manage the problem of strain in the workplace. But how can the HRD do it? What are, in concrete terms, the tasks which have to be carried out in order to fulfil the legal requirements? Through the example of TESSI, an international company which employs approximatively 13,000 employees, this paper would try to provide an answer to these questions. It will also deal with the stakes and the limits of these legal requirements.La loi du 9 novembre 2010 est la première à véritablement reconnaitre et définir la pénibilité du travail. Depuis, de nombreuses avancées ont été faites dans le domaine. En dix ans, la législation a déjà été modifiée quatre fois, renforçant toujours davantage les obligations des entreprises. Des obligations, qui, bien souvent, sont remplies par le service des Ressources Humaines. C’est en effet lui, qui, de par ses compétences, est le plus à même de gérer le dossier de la pénibilité. Mais comment peut-il faire ? Quelles sont, concrètement, les missions à effectuer dans le domaine de la pénibilité pour remplir les obligations légales ? Ce mémoire, au travers de l’exemple de TESSI, Groupe international de 13 000 salariés, tentera d’apporter une réponse à ces questions, tout en soulevant les enjeux et les limites de ces obligations légales

Polymeric analogues of antimicrobial peptides with therapeutic potential against clostridium difficile

Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille à Gram positif, anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. L'infection à C. difficile (ICD) est la principale conséquence de la colonisation du tube digestif par une souche toxinogène de C. difficile. Aujourd'hui, C. difficile fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années, les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et le risque de récidives à très largement augmenté. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé. Ainsi, des projets de recherche sur de nouvelles molécules présentant des mécanismes d'action innovants doivent être développés afin de lutter contre C. difficile. Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille Gram positif anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. Aujourd'hui, l'infection à C. difficile (ICD) fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années : les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et récidivent souvent. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé humaine. Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des biomolécules constituées d'acides aminés notamment produites par certains micro-organismes et ciblant virus, bactéries, fungi et parasites. L'efficacité des PAM s'explique par leur capacité à déstabiliser les membranes, une propriété physicochimique liée à leur caractère amphiphile. A ce jour, le développement industriel des PAM reste assez limité à cause de leur cout de production élevé et de leur sensibilité aux peptidases, empêchant leur administration par voie orale. Des analogues polymériques comme mimes simplifiés des PAM ont été proposés pour tenter de lever ces contraintes et les polymères d'acides aminés sont certainement de très bons supports pour se rapprocher des PAM. Cette thèse présente la préparation de nouveaux copolymères amphiphiles obtenus par polymérisation par ouverture de cycle (ROP) de monomères de type N-carboxyanhydrides-N-méthylés (NNCA). Ces monomères NNCA ont été obtenus à partir d'acides aminés issus de la biomasse possédant une chaine latérale "hydrophobe" (L-Alanine ; D-Alanine ; L-Leucine et L-Phénylalanine) ou "cationique" à pH physiologique (L-Lysine) en deux temps : 1) la synthèse d'intermédiaires N-Boc-N-méthylés en 2 étapes puis 2) cyclisation en NNCA par la méthode de Leuchs. Cette méthodologie a permis de préparer 4 monomères NNCA "hydrophobes" et 1 monomère "cationique". Ensuite, nous avons analysé les cinétiques de polymérisation de certains NNCA en préparant des homopolymères puis nous avons mis en œuvre des réactions de copolymérisation en mélangeant les NNCA "hydrophobes" et "cationiques". En parallèle, nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices (CMI) vis-à-vis de C. difficile d'une bibliothèque de copolypeptoïdes, en étudiant l'influence de paramètres structuraux tels que l'hydrophobicité, la nature de la chaine latérale, la nature de l'amorceur et le degré de polymérisation et avons pu identifier plusieurs polymères aussi actifs que deux molécules de référence et peu cytotoxiques vis-à-vis de la lignée épithéliale Caco-2.Clostridioides difficile (C. difficile) is a spore-forming, strict anaerobic Gram-positive bacillus that often develops in the gut of patients whose intestinal microbiota is destabilized by broad-spectrum antibiotherapy. Currently, C. difficile infection (CDI) is one of the leading causes of healthcare-associated infections, also known as nosocomial infections. Anti-C. difficile antibiotic therapy is mainly based on three molecules that offer contrasting results and in recent years, CDI has become more frequent, more severe and more often recurrent. In 2020, the WHO classified C. difficile as a microorganism posing an urgent threat and a significant risk to human health. Antimicrobial peptides (AMP) are biomolecules constituted of amino acids produced by microorganisms that target viruses, bacteria, fungi and parasites. The effectiveness of AMP is due to their ability to destabilize membranes, a physicochemical property linked to their amphiphilic character. To date, the industrial development of AMP is limited by their high production cost and their sensitivity to peptidases, which prevents their oral administration. Polymeric analogues as simplified mimetics of AMP have been proposed to tackle these constraints and amino acid polymers are certainly very suitable supports to approach AMP. In this thesis, we present the preparation of new amphiphilic copolymers obtained by ring-opening polymerization (ROP) of N-methylated-N-carboxyanhydrides (NNCA) monomers. These NNCA monomers were obtained from bio-sourced amino acids with a "hydrophobic" (L-Alanine; D-Alanine; L-Leucine and L-Phenylalanine) side chain or "cationic" side chain at physiological pH (L-Lysine) in two steps: 1) synthesis of N-Boc-N-methylated intermediates in 2 steps and 2) cyclization into NNCA by the Leuchs method. This methodology allowed to prepare 4 "hydrophobic" NNCA monomers and 1 "cationic" monomer. Then, we analyzed the polymerization kinetics of some NNCA by preparing homopolymers and then we implemented copolymerization reactions by mixing the "hydrophobic" and "cationic" NNCA. In the same time, we determined the minimum inhibitory concentrations (MIC) towards C. difficile of a library of copolypeptoids, by studying the influence of structural parameters such as hydrophobicity, the nature of the side chain, the nature of the initiator and the degree of polymerization, and were able to identify polymers that were as active as two reference molecules and not significantly cytotoxic towards the epithelial line Caco-2

Analogues polymériques de peptides antimicrobiens à potentiel thérapeutique anti-Clostridioides difficile

Clostridioides difficile (C. difficile) is a spore-forming, strict anaerobic Gram-positive bacillus that often develops in the gut of patients whose intestinal microbiota is destabilized by broad-spectrum antibiotherapy. Currently, C. difficile infection (CDI) is one of the leading causes of healthcare-associated infections, also known as nosocomial infections. Anti-C. difficile antibiotic therapy is mainly based on three molecules that offer contrasting results and in recent years, CDI has become more frequent, more severe and more often recurrent. In 2020, the WHO classified C. difficile as a microorganism posing an urgent threat and a significant risk to human health. Antimicrobial peptides (AMP) are biomolecules constituted of amino acids produced by microorganisms that target viruses, bacteria, fungi and parasites. The effectiveness of AMP is due to their ability to destabilize membranes, a physicochemical property linked to their amphiphilic character. To date, the industrial development of AMP is limited by their high production cost and their sensitivity to peptidases, which prevents their oral administration. Polymeric analogues as simplified mimetics of AMP have been proposed to tackle these constraints and amino acid polymers are certainly very suitable supports to approach AMP. In this thesis, we present the preparation of new amphiphilic copolymers obtained by ring-opening polymerization (ROP) of N-methylated-N-carboxyanhydrides (NNCA) monomers. These NNCA monomers were obtained from bio-sourced amino acids with a "hydrophobic" (L-Alanine; D-Alanine; L-Leucine and L-Phenylalanine) side chain or "cationic" side chain at physiological pH (L-Lysine) in two steps: 1) synthesis of N-Boc-N-methylated intermediates in 2 steps and 2) cyclization into NNCA by the Leuchs method. This methodology allowed to prepare 4 "hydrophobic" NNCA monomers and 1 "cationic" monomer. Then, we analyzed the polymerization kinetics of some NNCA by preparing homopolymers and then we implemented copolymerization reactions by mixing the "hydrophobic" and "cationic" NNCA. In the same time, we determined the minimum inhibitory concentrations (MIC) towards C. difficile of a library of copolypeptoids, by studying the influence of structural parameters such as hydrophobicity, the nature of the side chain, the nature of the initiator and the degree of polymerization, and were able to identify polymers that were as active as two reference molecules and not significantly cytotoxic towards the epithelial line Caco-2.Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille à Gram positif, anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. L'infection à C. difficile (ICD) est la principale conséquence de la colonisation du tube digestif par une souche toxinogène de C. difficile. Aujourd'hui, C. difficile fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années, les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et le risque de récidives à très largement augmenté. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé. Ainsi, des projets de recherche sur de nouvelles molécules présentant des mécanismes d'action innovants doivent être développés afin de lutter contre C. difficile. Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille Gram positif anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. Aujourd'hui, l'infection à C. difficile (ICD) fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années : les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et récidivent souvent. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé humaine. Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des biomolécules constituées d'acides aminés notamment produites par certains micro-organismes et ciblant virus, bactéries, fungi et parasites. L'efficacité des PAM s'explique par leur capacité à déstabiliser les membranes, une propriété physicochimique liée à leur caractère amphiphile. A ce jour, le développement industriel des PAM reste assez limité à cause de leur cout de production élevé et de leur sensibilité aux peptidases, empêchant leur administration par voie orale. Des analogues polymériques comme mimes simplifiés des PAM ont été proposés pour tenter de lever ces contraintes et les polymères d'acides aminés sont certainement de très bons supports pour se rapprocher des PAM. Cette thèse présente la préparation de nouveaux copolymères amphiphiles obtenus par polymérisation par ouverture de cycle (ROP) de monomères de type N-carboxyanhydrides-N-méthylés (NNCA). Ces monomères NNCA ont été obtenus à partir d'acides aminés issus de la biomasse possédant une chaine latérale "hydrophobe" (L-Alanine ; D-Alanine ; L-Leucine et L-Phénylalanine) ou "cationique" à pH physiologique (L-Lysine) en deux temps : 1) la synthèse d'intermédiaires N-Boc-N-méthylés en 2 étapes puis 2) cyclisation en NNCA par la méthode de Leuchs. Cette méthodologie a permis de préparer 4 monomères NNCA "hydrophobes" et 1 monomère "cationique". Ensuite, nous avons analysé les cinétiques de polymérisation de certains NNCA en préparant des homopolymères puis nous avons mis en œuvre des réactions de copolymérisation en mélangeant les NNCA "hydrophobes" et "cationiques". En parallèle, nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices (CMI) vis-à-vis de C. difficile d'une bibliothèque de copolypeptoïdes, en étudiant l'influence de paramètres structuraux tels que l'hydrophobicité, la nature de la chaine latérale, la nature de l'amorceur et le degré de polymérisation et avons pu identifier plusieurs polymères aussi actifs que deux molécules de référence et peu cytotoxiques vis-à-vis de la lignée épithéliale Caco-2

Analogues polymériques de peptides antimicrobiens à potentiel thérapeutique anti-Clostridioides difficile

Clostridioides difficile (C. difficile) is a spore-forming, strict anaerobic Gram-positive bacillus that often develops in the gut of patients whose intestinal microbiota is destabilized by broad-spectrum antibiotherapy. Currently, C. difficile infection (CDI) is one of the leading causes of healthcare-associated infections, also known as nosocomial infections. Anti-C. difficile antibiotic therapy is mainly based on three molecules that offer contrasting results and in recent years, CDI has become more frequent, more severe and more often recurrent. In 2020, the WHO classified C. difficile as a microorganism posing an urgent threat and a significant risk to human health. Antimicrobial peptides (AMP) are biomolecules constituted of amino acids produced by microorganisms that target viruses, bacteria, fungi and parasites. The effectiveness of AMP is due to their ability to destabilize membranes, a physicochemical property linked to their amphiphilic character. To date, the industrial development of AMP is limited by their high production cost and their sensitivity to peptidases, which prevents their oral administration. Polymeric analogues as simplified mimetics of AMP have been proposed to tackle these constraints and amino acid polymers are certainly very suitable supports to approach AMP. In this thesis, we present the preparation of new amphiphilic copolymers obtained by ring-opening polymerization (ROP) of N-methylated-N-carboxyanhydrides (NNCA) monomers. These NNCA monomers were obtained from bio-sourced amino acids with a "hydrophobic" (L-Alanine; D-Alanine; L-Leucine and L-Phenylalanine) side chain or "cationic" side chain at physiological pH (L-Lysine) in two steps: 1) synthesis of N-Boc-N-methylated intermediates in 2 steps and 2) cyclization into NNCA by the Leuchs method. This methodology allowed to prepare 4 "hydrophobic" NNCA monomers and 1 "cationic" monomer. Then, we analyzed the polymerization kinetics of some NNCA by preparing homopolymers and then we implemented copolymerization reactions by mixing the "hydrophobic" and "cationic" NNCA. In the same time, we determined the minimum inhibitory concentrations (MIC) towards C. difficile of a library of copolypeptoids, by studying the influence of structural parameters such as hydrophobicity, the nature of the side chain, the nature of the initiator and the degree of polymerization, and were able to identify polymers that were as active as two reference molecules and not significantly cytotoxic towards the epithelial line Caco-2.Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille à Gram positif, anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. L'infection à C. difficile (ICD) est la principale conséquence de la colonisation du tube digestif par une souche toxinogène de C. difficile. Aujourd'hui, C. difficile fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années, les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et le risque de récidives à très largement augmenté. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé. Ainsi, des projets de recherche sur de nouvelles molécules présentant des mécanismes d'action innovants doivent être développés afin de lutter contre C. difficile. Clostridioides difficile (C. difficile) est un bacille Gram positif anaérobie strict et sporulé qui se développe souvent dans la flore intestinale de patients dont le microbiote est déstabilisé par une antibiothérapie à spectre large. Aujourd'hui, l'infection à C. difficile (ICD) fait partie des principales causes d'infections associées aux soins, aussi appelées infections nosocomiales. L'antibiothérapie anti-C. difficile repose principalement sur trois molécules qui offrent des résultats contrastés et depuis quelques années : les ICD deviennent plus fréquentes, plus sévères et récidivent souvent. En 2020, l'OMS a classé C. difficile parmi les micro-organismes présentant une menace urgente et un risque important pour la santé humaine. Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des biomolécules constituées d'acides aminés notamment produites par certains micro-organismes et ciblant virus, bactéries, fungi et parasites. L'efficacité des PAM s'explique par leur capacité à déstabiliser les membranes, une propriété physicochimique liée à leur caractère amphiphile. A ce jour, le développement industriel des PAM reste assez limité à cause de leur cout de production élevé et de leur sensibilité aux peptidases, empêchant leur administration par voie orale. Des analogues polymériques comme mimes simplifiés des PAM ont été proposés pour tenter de lever ces contraintes et les polymères d'acides aminés sont certainement de très bons supports pour se rapprocher des PAM. Cette thèse présente la préparation de nouveaux copolymères amphiphiles obtenus par polymérisation par ouverture de cycle (ROP) de monomères de type N-carboxyanhydrides-N-méthylés (NNCA). Ces monomères NNCA ont été obtenus à partir d'acides aminés issus de la biomasse possédant une chaine latérale "hydrophobe" (L-Alanine ; D-Alanine ; L-Leucine et L-Phénylalanine) ou "cationique" à pH physiologique (L-Lysine) en deux temps : 1) la synthèse d'intermédiaires N-Boc-N-méthylés en 2 étapes puis 2) cyclisation en NNCA par la méthode de Leuchs. Cette méthodologie a permis de préparer 4 monomères NNCA "hydrophobes" et 1 monomère "cationique". Ensuite, nous avons analysé les cinétiques de polymérisation de certains NNCA en préparant des homopolymères puis nous avons mis en œuvre des réactions de copolymérisation en mélangeant les NNCA "hydrophobes" et "cationiques". En parallèle, nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices (CMI) vis-à-vis de C. difficile d'une bibliothèque de copolypeptoïdes, en étudiant l'influence de paramètres structuraux tels que l'hydrophobicité, la nature de la chaine latérale, la nature de l'amorceur et le degré de polymérisation et avons pu identifier plusieurs polymères aussi actifs que deux molécules de référence et peu cytotoxiques vis-à-vis de la lignée épithéliale Caco-2

Regulation by iron and role of colibactin in the intestinal colonization of Escherichia coli

Le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement des fonctions digestive, métabolique, immunitaire et neurologique de son hôte. Escherichia coli est un hôte commun de la microflore commensale intestinale de l'Homme et des animaux à sang chaud, et s'établit dans le tractus digestif dès les premières heures ou jours qui suivent la naissance. L'espèce E. coli, bactérie anaérobe facultative prévalente, peut être divisée en sept groupes phylogénétiques principaux. Le groupe phylogénétique B2 comprend le plus grand nombre de souches responsables d'infections extra-intestinales (méningites néonatales, infections urinaires, septicémies, ...) ou chroniques (cancers, maladie de Crohn, ...). Des études épidémiologiques récentes montrent que le portage de ces souches est en augmentation dans les pays industrialisés, au détriment du groupe ancestral A. L'objectif de mon projet de thèse était de déterminer les facteurs à l'origine de cette évolution. Une analyse génétique montre que les souches du groupe phylogénétique B2 ont développé une très grande capacité à acquérir le fer, notamment via les sidérophores. Les souches appartenant au groupe B2 sont aussi les seules capables de synthétiser une génotoxine, la colibactine. Celle-ci induit des cassures de l'ADN double brin dans les cellules eucaryotes, pouvant être à l'origine de cancers colorectaux ou d'un défaut de développement de la barrière intestinale. Les sidérophores et la colibactine appartiennent à la même famille de molécules, i.e. des hybrides polycétide-peptide non ribosomaux. Leur biosynthèse fait intervenir des enzymes multifonctionnelles qui doivent être activées par fixation covalente d'un groupement 4'-phosphopantethéïnyl (P-pant). Cette modification post-traductionnelle est catalysée par la 4'-phosphopantethéïnyl transférase (PPTase). La PPTase ClbA est impliquée dans la synthèse de colibactine. La PPTase impliquée dans celle des sidérophores est EntD. Récemment, notre équipe a montré que ClbA pouvait participer à la synthèse des sidérophores, et remplacer EntD. Ceci montrait pour la première fois une connexion entre les multiples voies nécessitant des PPTases et conduisant à la biosynthèse de métabolites secondaires fonctionnellement distincts dans un micro-organisme donné. Dans la mesure où l'expression de entD et la synthèse des sidérophores sont régulées par la disponibilité en fer, nous avons fait l'hypothèse que l'expression de clbA et synthèse de la colibactine étaient également régulées par la quantité de fer.The intestinal microbiota, i.e. the microorganisms present in the intestinal tract, plays a major role in diverse host functions: digestive, metabolic, immune and neurologic. Escherichia coli is a normal inhabitant of the commensal intestinal microflora of the human and mammals, and colonizes the gut within few days after birth. E. coli can be classified into 7 major phylogenetic groups. The B2 group contains the highest number of strains responsible for chronic (cancers, Crohn's disease, ...) or extra-intestinal infections (neonatal meningitis, septicemia, urinary tract infections, ...). Epidemiologic studies demonstrated that the prevalence of the B2 strains increases in industrialized countries, to the detriment of the ancestral A group. The objective of this study was to determine the factors involved in this evolution. Genetic analysis showed that strains from the phylogenetic B2 group have high capacities to take up iron through numerous siderophores. Moreover, only B2 strains are able to produce the genotoxin colibactin, which induces double strand brakes DNA in eukaryotic cells, leading to colorectal cancers or to altered development of the intestinal barrier. Siderophores and colibactin belong to the same family of molecules, i.e. hybrid polyketide-non ribosomal peptide. Their biosynthesis involves multifunctional enzymes that need to be activated by the covalent binding of a 4'-phosphopantetheinyl moiety. This post-translational modification is catalyzed by 4'-phosphopantetheinyl transferase (PPTase). The PPTase involved in colibactin and in siderophore biosynthesis are ClbA and EntD respectively Our team has recently demonstrated that ClbA can sustain siderophores biosynthesis, and replaces EntD, highlighting a connexion between multiple pathways and leading to the biosynthesis of distinct secondary metabolites in a given micro-organism. Because entD expression and siderophores synthesis are regulated by iron availability, we hypothesized that ClbA and colibactin are also regulated by iron availability. In this study, we show that transcription of clbA and colibactin production decreased in presence of high iron availability, and this regulation occurred through two pathways: dependent and independent on the two major regulators of iron homeostasis, FUR (Ferric Uptake Regulator) and RyhB. This regulation could allow a fine tuning production of siderophores and colibactin, and give an advantage in the establishment of intestinal tract colonization. The potential role of the colibactin in the establishment of intestinal tract colonization by E. coli constitutes the second part of my work

Régulation par le fer et rôle de la colibactine dans la colonisation du tube digestif par Escherichia coli

The intestinal microbiota, i.e. the microorganisms present in the intestinal tract, plays a major role in diverse host functions: digestive, metabolic, immune and neurologic. Escherichia coli is a normal inhabitant of the commensal intestinal microflora of the human and mammals, and colonizes the gut within few days after birth. E. coli can be classified into 7 major phylogenetic groups. The B2 group contains the highest number of strains responsible for chronic (cancers, Crohn's disease, ...) or extra-intestinal infections (neonatal meningitis, septicemia, urinary tract infections, ...). Epidemiologic studies demonstrated that the prevalence of the B2 strains increases in industrialized countries, to the detriment of the ancestral A group. The objective of this study was to determine the factors involved in this evolution. Genetic analysis showed that strains from the phylogenetic B2 group have high capacities to take up iron through numerous siderophores. Moreover, only B2 strains are able to produce the genotoxin colibactin, which induces double strand brakes DNA in eukaryotic cells, leading to colorectal cancers or to altered development of the intestinal barrier. Siderophores and colibactin belong to the same family of molecules, i.e. hybrid polyketide-non ribosomal peptide. Their biosynthesis involves multifunctional enzymes that need to be activated by the covalent binding of a 4'-phosphopantetheinyl moiety. This post-translational modification is catalyzed by 4'-phosphopantetheinyl transferase (PPTase). The PPTase involved in colibactin and in siderophore biosynthesis are ClbA and EntD respectively Our team has recently demonstrated that ClbA can sustain siderophores biosynthesis, and replaces EntD, highlighting a connexion between multiple pathways and leading to the biosynthesis of distinct secondary metabolites in a given micro-organism. Because entD expression and siderophores synthesis are regulated by iron availability, we hypothesized that ClbA and colibactin are also regulated by iron availability. In this study, we show that transcription of clbA and colibactin production decreased in presence of high iron availability, and this regulation occurred through two pathways: dependent and independent on the two major regulators of iron homeostasis, FUR (Ferric Uptake Regulator) and RyhB. This regulation could allow a fine tuning production of siderophores and colibactin, and give an advantage in the establishment of intestinal tract colonization. The potential role of the colibactin in the establishment of intestinal tract colonization by E. coli constitutes the second part of my work.Le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement des fonctions digestive, métabolique, immunitaire et neurologique de son hôte. Escherichia coli est un hôte commun de la microflore commensale intestinale de l'Homme et des animaux à sang chaud, et s'établit dans le tractus digestif dès les premières heures ou jours qui suivent la naissance. L'espèce E. coli, bactérie anaérobe facultative prévalente, peut être divisée en sept groupes phylogénétiques principaux. Le groupe phylogénétique B2 comprend le plus grand nombre de souches responsables d'infections extra-intestinales (méningites néonatales, infections urinaires, septicémies, ...) ou chroniques (cancers, maladie de Crohn, ...). Des études épidémiologiques récentes montrent que le portage de ces souches est en augmentation dans les pays industrialisés, au détriment du groupe ancestral A. L'objectif de mon projet de thèse était de déterminer les facteurs à l'origine de cette évolution. Une analyse génétique montre que les souches du groupe phylogénétique B2 ont développé une très grande capacité à acquérir le fer, notamment via les sidérophores. Les souches appartenant au groupe B2 sont aussi les seules capables de synthétiser une génotoxine, la colibactine. Celle-ci induit des cassures de l'ADN double brin dans les cellules eucaryotes, pouvant être à l'origine de cancers colorectaux ou d'un défaut de développement de la barrière intestinale. Les sidérophores et la colibactine appartiennent à la même famille de molécules, i.e. des hybrides polycétide-peptide non ribosomaux. Leur biosynthèse fait intervenir des enzymes multifonctionnelles qui doivent être activées par fixation covalente d'un groupement 4'-phosphopantethéïnyl (P-pant). Cette modification post-traductionnelle est catalysée par la 4'-phosphopantethéïnyl transférase (PPTase). La PPTase ClbA est impliquée dans la synthèse de colibactine. La PPTase impliquée dans celle des sidérophores est EntD. Récemment, notre équipe a montré que ClbA pouvait participer à la synthèse des sidérophores, et remplacer EntD. Ceci montrait pour la première fois une connexion entre les multiples voies nécessitant des PPTases et conduisant à la biosynthèse de métabolites secondaires fonctionnellement distincts dans un micro-organisme donné. Dans la mesure où l'expression de entD et la synthèse des sidérophores sont régulées par la disponibilité en fer, nous avons fait l'hypothèse que l'expression de clbA et synthèse de la colibactine étaient également régulées par la quantité de fer

Quantification of Colibactin-associated Genotoxicity in HeLa Cells by In Cell Western (ICW) Using γ-H2AX as a Marker

International audienceThe genotoxin colibactin is produced by several species of Enterobacteriaceae. This genotoxin induces DNA damage, cell cycle arrest, senescence and death in eukaryotic cells (Nougayrède et al., 2006; Taieb et al., 2016). Here we describe a method to quantify the genotoxicity of bacteria producing colibactin following a short infection of cultured mammalian cells with colibactin producing E. coli