Cinétique de la réaction d'hydrolyse du hyaluronane catalysée par la hyaluronidase testiculaire bovine (Transposition à une hyaluronidase extraite de tumeurs cancéreuses humaines)

Le hyaluronane (HA) est un polysaccharide anionique linéaire constitué de motifs disaccharidiques (N-acétyl-D-glucosamine-b(1,3)-acide-D-glucuronique) liés en b(1,4). In vivo, son catabolisme est assuré par une famille d'enzymes, les hyaluronidases (HAase). Les HAase de type testiculaire hydrolysent les liens b(1,4). La réaction d'hydrolyse du HA catalysée par la HAase testiculaire et les paramètres qui la régulent n'ont été que peu étudiés. Par ailleurs, cette réaction semble impliquée dans le développement tumoral.Le présent manuscrit constitue une étude approfondie du mode de fonctionnement du système HA/HAase testiculaire bovine, en fonction des concentrations en enzyme et en substrat, de la force ionique et du pH. La principale méthode utilisée pour suivre les cinétiques d'hydrolyse (méthode de Reissig), permet de doser les extrémités réductrices N-acétylglucosamine (GlcNAc) formées lors de l'hydrolyse. Le signal mesuré par cette méthode n'étant pas uniquement dû aux extrémités GlcNAc formées, nous avons proposé une amélioration qui consiste à extraire mathématiquement un signal de turbidité non-spécifique, du signal dû aux extrémités GlcNAc. La modélisation des cinétiques par la somme de deux exponentielles nous a permis de proposer un mode d'action de l'enzyme. D'autres méthodes (chromatographie d'exclusion stérique, viscosimétrie, zymographie) ont été utilisées afin de caractériser le système HA/HAase. Parmi elles, la viscosimétrie a permis de mettre en évidence l'effet de la viscosité sur la réaction. En effet, l'étude de l'influence des concentrations en HA et en HAase, du pH et de la force ionique sur la vitesse d'hydrolyse indique que la réaction est essentiellement contrôlée par des phénomènes de diffusion des molécules, liés à la viscosité des solutions apportée par le HA, induisant une non-linéarité du système. La dernière partie du manuscrit est une transposition de ces résultats, à l'étude d'une HAase extraite de tumeurs humaines.ROUEN-BU Sciences (764512102) / SudocSudocFranceF

Growth factor regulation of hyaluronan synthesis and degradation in human dermal fibroblasts: importance of hyaluronan for the mitogenic response of PDGF-BB

The glycosaminoglycan hyaluronan is important in many tissuerepair processes. We have investigated the synthesis of hyaluronan in a panel of cell lines of fibroblastic and epithelial origin in response to PDGF (platelet-derived growth factor)-BB and other growth factors. Human dermal fibroblasts exhibited the highest hyaluronan-synthesizing activity in response to PDGF-BB. Analysis of HAS (hyaluronan synthase) and HYAL (hyaluronidase) mRNA expression showed that PDGF-BB treatment induced a 3-fold increase in the already high level of HAS2 mRNA, and increases in HAS1 and HYAL1 mRNA, whereas the levels of HAS3 and HYAL2 mRNA were not affected. Furthermore, PDGF-BB also increased the amount and activity of HAS2 protein, but not of HYAL1 and HYAL2 proteins. Using inhibitors for MEK1/2 [MAPK (mitogen-activated protein kinase)/ERK (extracellular-signal-regulated kinase) kinase 1/2] (U0126) and for PI3K (phosphoinositide 3-kinase) (LY294002), as well as the SN50 inhibitor, which prevents translocation of the active NF-κB (nuclear factor κB) to the nucleus, we observed a complete inhibition of both HAS2 transcriptional activity and hyaluronan synthesis, whereas inhibitors of other signalling pathways were without any significant effect. TGF-β1 (transforming growth factor-β1) did not increase the activity of hyaluronan synthesis in dermal fibroblasts, but increased the activity of HYALs. Importantly, inhibition of hyaluronan binding to its receptor CD44 by the monoclonal antibody Hermes-1, inhibited PDGF-BB-stimulated [3H]thymidine incorporation of dermal fibroblasts. We conclude that the ERK MAPK and PI3K signalling pathways are necessary for the regulation of hyaluronan synthesis by PDGF-BB, and that prevention of its binding to CD44 inhibits PDGF-BB-induced cell growth

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