Artificial ditopic receptor molecules for recognition of RGD-loops

Im Rahmen dieser Doktorarbeit ist die Synthese der Monophosphatpinzette 26 erstmals gelungen. Diese zeigt in Wasser nur eine geringe Dimerisierung von Kass = 80 M-1 auf. Dadurch ist sie auch für die Verwendung als Rezeptor für Arginin und Lysin geeignet. Die Bindung an N/C-terminal geschützten Arginin- und Lysinderivaten ist mit Ausnahme für C-terminal geschützte Arginine bzw. Lysine, deren N-Terminus frei liegt, ca. acht bis zehnmal schwächer als die Bindung der gleichen Substrate durch die Bisphosphatpinzette 21. Diese überraschend schwächere Bindung ist hierbei vermutlich auf einen Entropieeffekt zurückzuführen, d.h. das Substrat muss erst die richtige Orientierung einnehmen, um zur Ausbildung des attraktiven Ionenpaares mit der Phosphatgruppe des Rezeptors zu kommen. Im Hauptprojekt dieser Arbeit ist es gelungen, erstmals über einen Linker verbundende ditopische RGD-Rezeptormoleküle, bestehend aus der molekularen Pinzette und dem Guanidiniocarbonylpyrrol, darzustellen. Die für die Verknüpfung geeignetsten Linker wurden zuvor in intensiven Modellingstudien ermittelt. Dabei wurden bevorzugt Rezeptormoleküle mit Linkern ausgewählt, die das Cyclopeptid cRGDfV in der bioaktiven Konformation binden. Nach intensiven synthetischen Studien stellte sich dabei der Versuch, die Pinzette über eine Esterbindung mit dem Rest des Moleküls zu verknüpfen, als ungeeignet heraus, da diese Esterbindung eine hohe saure Hydrolyseempfindlichkeit aufweist und damit auch für spätere biologische Anwendungen nicht verwendbar wäre. Deshalb wurde der Wechsel zu einer hydrolyseunempfindlicheren Etherbindung vollzogen. Nach weiteren Studien gelang es zwei Syntheserouten zu entwickeln, die die Pinzette über eine Etherbindung mit dem Rest des Moleküls verbindet. Eine solche Etherbindung ist wesentlich stabiler als die zuvor verwendete Esterbindung, wie auch die synthetischen Studien zeigten. Die entwickelten Syntheserouten stellen nun erstmals einen generellen Zugang dar, die es ermöglichen, die molekulare Pinzette mit zwei unterschiedlichen Gruppen über eine Etherbindung zu funktionalisieren. Dabei kann entweder erst kurz vor Schluss oder direkt nach der Linkeranknüpfung eine Phosphatgruppe in das Pinzettensystem eingeführt werden. Wichtig hierbei ist, dass die Phosphatgruppe zunächst als Methylester eingeführt wird, dadurch kann der Linker beliebig funktionalisiert werden und eine Reinigung des Moleküls ist zu jedem Zeitpunkt noch möglich. Denkbar wäre auch noch ein möglicher dritter Syntheseweg, dieser kann ausgehend von einer Zwischenstufe der Synthese der Monophosphatpinzette 26 begonnen werden, so hätte man hier im ersten Schritt bereits eine geschützte Phosphatgruppe im Molekül vorliegen und kann anschließend die zweite OH-Gruppe der Pinzette beliebig funktionalisieren. Aufgrund dieser zwei, potentiell drei verschiedenen etablierten Syntheserouten ist man nun flexibel genug um auch für andere Erkennungseinheiten direkt von Beginn an diejenige Route auszuwählen, die am schnellsten und mit dem geringsten Aufwand zum gewünschten Zielmolekül führt. Die beiden in dieser Arbeit hergestellten RGD-Rezeptormoleküle, sollten, aufgrund ihres ditopischen Charakters, nun in der Lage sein, die RGD-Sequenz stärker binden zu können als die einzelnen Bindungsmotive. Dabei zeigten sowohl das Rezeptormolekül 102 mit dem flexiblen Linker, als auch das Rezeptormolekül 103 mit dem rigideren Linker, erfreulicherweise keinerlei Anzeichen von Selbstassoziation auf. Bei weiteren Untersuchungen konnte bei beiden Rezeptormolekülen eine stark verminderte Fluoreszenzintensität gegenüber der Bisphosphatpinzette 21 nachgewiesen werden. Dies ist möglicherweise auf einen neuen fast vollständigen Energietransfer innerhalb des Rezeptorsystems zurückzuführen. Dabei wird die Energie von der Pinzette auf das Pyrrol übertragen und nur ein kleiner Teil wird als Fluoreszenz freigesetzt, der Großteil der Anregungsenergie geht direkt strahlungslos in den Grundzustand über. Die in den Bindungsstudien ermittelten Bindungskonstanten der ditopischen RGD-Rezeptoren 102 und 103 wiesen für die linearen RGD-Peptide höhere Werte als die Monophosphatpinzette 26 auf. Im Vergleich mit der Bisphosphatpinzette 21 zeigte sich in reinem Puffer für das freie RGD eine etwas stärkere Bindung und für das GRGDTP eine etwas schwächere Bindung, die allerdings bei Zugabe von 50% DMSO deutlich erhöht wurde und doppelt so hoch lag wie die Bindung mit 21. Letztendlich liegt zumindest eine in etwa gleich starke oder sogar eine etwas höhere RGD-Bindung mit den ditopischen Rezeptormolekülen gegenüber 21 vor. Dass die erreichten Bindungskonstanten jedoch nicht so hoch ausfielen wie man erwartet hatte, liegt an der mangelnden Zugänglichkeit der Kavität gegenüber dem Arginin. Dies konnte mit Hilfe von 1H-NMR-Studien nachgewiesen werden. Die 1H-NMR-Studien zeigten, dass die für einen Einschluss der Seitenkette des Arginins in die Kavität typischen starken Shifts, von über 1 ppm für die gamma-CH2-Gruppe, nicht auftraten. Es konnte aber gezeigt werden, dass tatsächlich eine positive Kooperativität der beiden Bindungsmotive zustande kommt. Die 1H-NMR Studien zeigten in 1:1 Komplexen, zwischen Wirt und Gast, Verschiebungen von 0.13 ppm der gamma-CH2-Gruppe im Arginin und bis zu 0.35 ppm der CH-2 Gruppe der Seitenkette im Aspartat, welches auf eine Beteiligung an der Bindung schließen lässt. Außerdem zeigten Fluoreszenzstudien, dass sowohl die Pinzette, als auch das Guanidiniocarbonylpyrrol einen Anteil an der Bindung der Substrate aufweist. Kraftfeldrechnungen geben einen Hinweis auf einen alternativen Bindungsmodus, bei der das Rezeptormolekül 102 das Substrat cRGDfV von „außen“ bindet, hierbei wechselwirkt die Phosphatgruppe mit dem Arginin und das Guanidiniocarbonylpyrrol mit der Carboxylatgruppe des Aspartats. Außerdem ist das Glycin nahe genug um unspezifische Wechselwirkungen mit dem Rezeptormolekül einzugehen. Dieses berechnete Modell stimmt gut mit den Ergebnissen der 1H-NMR und Fluoreszenzuntersuchungen dieser Arbeit überein. Berücksichtigt man, dass ausschließlich Wasserstoffbrückenbindungen bzw. elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Substrat stattfinden und ein Einschluss in die Kavität nicht stattfindet, sind die erreichten Dissoziationskonstanten, die in reiner wässriger gepufferter Lösung bzw. mit Anteilen an DMSO im mittleren mikromolaren Bereich (Kd = 20-70 µM) für beide RGD-Rezeptormoleküle liegen, relativ zufriedenstellend. Um in die gehofften niedrigen mikromolaren oder hohen nanomolaren Bereiche vordringen zu können, wäre allerdings ein Einschluss des Arginins in die Kavität von Nöten gewesen. Hoffnung jedoch gibt, dass der Zugang zur Kavität nicht gänzlich versperrt ist, wie ebenfalls durch 1H-NMR-Studien belegt werden konnte; so wird Ac-Lys-OMe in die Kavität der Pinzette eingeschlossen. Dies zeigt, dass räumlich anspruchsvollere Kationen, wie das Guanidinium-Kation, nicht mehr in die Kavität eindringen können; schlankere Kationen wie das Ammonium-Ion des Lysins, die weniger stark hydratisiert sind, allerdings, sind noch in der Lage dazu. Es sind also Optimierungen im Rezeptordesign von Nöten, die den Zugang zur Kavität erleichtern, um wieder einen Einschluss des Guanidinium-Kations zu ermöglichen. Die in dieser Arbeit erprobten Methoden zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit der Pinzette durch Einführung einer Diphosphonatgruppe haben sich als nicht praktikabel herausgestellt. So konnte zwar die Modellverbindung Phenol in guten Ausbeuten in das entsprechende Diphosphonat überführt werden, dies ließ sich jedoch nur eingeschränkt auf die Pinzette übertragen. So gelang eine Bifunktionalisierung der beiden OH-Gruppen des Pinzettengrundgerüstes 18 überhaupt nicht und eine einfache Funktionalisierung der OH-Gruppe der Pinzette 22 nur mit Ausbeuten von 16%. Die geringen Ausbeuten sind möglicherweise auf sterische Beschränkungen des Pinzettensystems zu erklären, die einen Umsatz weitgehend verhindern. Auch zeigte sich, dass die Diphosphonatgruppe relativ basenlabil ist und dürfte so, um bei der Verbesserung der Wasserlöslichkeit der ditopischen RGD-Rezeptoren zu helfen, erst in den letzten Schritten eingeführt werden, welches eine Überarbeitung des Synthesekonzepts erfordern würde. Eine höhere Wasserlöslichkeit muss also auf einem anderen Wege herbeigeführt werden

Molecular tweezers for lysine and arginine – powerful inhibitors of pathologic protein aggregation

Molecular tweezers represent the first class of artificial receptor molecules that made the way from a supramolecular host to a drug candidate with promising results in animal tests. Due to their unique structure, only lysine and arginine are well complexed with exquisite selectivity by a threading mechanism, which unites electrostatic, hydrophobic and dispersive attraction. However, tweezer design must avoid self-dimerization, self-inclusion and external guest binding. Moderate affinities of the molecular tweezers towards sterically well accessible basic amino acids with fast on and off rates protect normal proteins from a potential interference with their biological function. However, the early stages of abnormal Aβ, α-synuclein, and TTR assembly are redirected upon tweezer binding towards the generation of amorphous non-toxic material that can be degraded by the intracellular and extracellular clearance mechanisms. Thus, specific host–guest chemistry between aggregation-prone proteins and lysine/arginine binders rescues cell viability and restores animal health in models of AD, PD, and TTR amyloidosis