Activation of cAMP signaling transiently inhibits apoptosis in vascular smooth muscle cells in a site upstream of caspase-3

Intracellular signaling pathways that are involved in protection of vascular smooth muscle cells (VSMC) from apoptosis remain poorly understood. This study examines the effect of activators of cAMP/cGMP signaling on apoptosis in non-transfected VSMC and in VSMC transfected with c-myc (VSMC-MYC) or with its functional analogue, E1A-adenoviral protein (VSMC-E1A). Serum-deprived VSMC-E1A exhibited the highest apoptosis measured as the content of chromatin and low molecular weight DNA fragments, phosphatidylserine content in the outer surface of plasma membrane and caspase-3 activity (ten-, five-, four- and tenfold increase after 6 h of serum withdrawal, respectively). In VSMC-E1A, the addition of an activator of adenylate cyclase, forskolin, abolished chromatin cleavage, DNA laddering, caspase-3 activation and the appearance of morphologically-defined apoptotic cells triggered by 6 h of serum deprivation. In non-transfected VSMC and in VSMC-MYC, 6 h serum deprivation led to approximately six- and threefold activation of chromatin cleavage, respectively, that was also blocked by forskolin. In VSMC-E1A, inhibition of apoptosis was observed with other activators of cAMP signaling (cholera toxin, isoproterenol, adenosine, 8-Br-cAMP), whereas 6 h incubation with modulators of cGMP signaling (8-Br-cGMP, nitroprusside, atrial natriuretic peptide, L-NAME) did not affect the development of apoptotic machinery. The antiapoptotic effect of forskolin was abolished in 24 h of serum deprivation that was accompanied by normalization of intracellular cAMP content and protein kinase A (PKA) activity. Protection of VSMC-E1A from apoptosis by forskolin was blunted by PKA inhibitors (H-89 and KT5720), whereas transfection of cells with PKA catalytic subunit attenuated apoptosis triggered by serum withdrawal. The protection of VSMC-E1A by forskolin from apoptosis was insensitive to modulators of cytoskeleton assembly (cytochalasin B, colchicine). Neither acute (30 min) nor chronic (24 h) exposure of VSMC to forskolin modified basal and serum-induced phosphorylation of the MAP kinase ERK1/2. Thus, our results show that activation of cAMP signaling delays the development of apoptosis in serum-deprived VSMC at a site upstream of caspase-3 via activation of PKA and independently of cAMP-induced reorganization of the cytoskeleton network and the ERK1/2-terminated MAPK signaling cascade

Isolation des protéines non-histones de type HMG et leur modification par la poly (ADP-ribose) polymérase dans les noyaux de pancreas de rat

Les protéines HMG (High Mobility Group) sont des nucléoprotéines appartenant à la classe des protéines non-histones qui se trouvent associées préférentiellement à la partie activement transcrite de la chromatine. La poly (ADP-ribosylation) des protéines nucléaires, notamment les histones, serait impliquée dans certains mécanismes régulateurs de la' chromatine. Dans ce travail, nous avons analysé la poly (ADP-ribosylation) des protéines HMG, celles-ci étant reconnues pour être impliquées dans la transcription. Dans une première étape, nous avons mis au point des techniques d'extraction, de purification et de séparation des protéines HMG dans le pancréas de rat. En second lieu, nous avons caractérisé la poly (ADP­ ribosylation) des protéines HMG par des techniques d'électrophorèse sur gel polyacrylamide dans des conditions qui assurent la stabilité des protéines poly (ADP-ribosylées). Ainsi, les protéines HMG pancréatiques sont extraites à l'aide d'acide perchlorique 5% et sont séparées par des précipitations sélectives à l'acétone en milieu acide. Elles sont ensuite identifiées en comparant leur mobilité relative avec celles des protéines HMG du thymus de veau. Il y a 4 protéines HMG qui se .nomment lll1G 1, 2, 14 et 17. Nous avons observé que toutes les protéines HMG sont poly (ADP-ribosylées). De plus, le polymère lié aux protéines HMG est plus long que celui lié à l'histone H1 mais l'élongation in vitro du polymère lié aux protéines HMG et à l'histone Hl semble être de même niveau. Nous avons développé une technique de séparation sur gel polyacrylamide des protéines poly (ADP-ribosylées) en présence de lithium dodécyl sulfate (LDS) qui assure la stabilité du poly (ADP-ribose) lié aux protéines; cette technique est· réalisée dans des conditions acides et à basse température. Nous avons démontré que les protéines HMG 14 et 17 qui se trouvent dans l'euchromatine, sont proportionnellement plus poly (ADP-ribosylées) que l'histone Hl. Ceci implique une distribution préférentielle de l’activité de la poly (ADP-ribose) polymérase sur la partie activement transcrite de la chromatine et suggère que la poly (ADP-ribosylation) pourrait être impliquée dans la transcription

Récepteurs multiples aux neurokinines dans le cerveau : distribution et caractérisation pharmacologique

L'utilisation des radioligands comme la [125I]-Bolton-Hunter-substance P ([125I]-BH-SP), la (2-[125I]-iodohistidyl1)-neurokinine A ([125I]-NKA) et l’[125I]- Bolton-Hunter-élédoisine ([125I]-BH-ELE) nous a permis de démontrer l'existence de trois profils de distribution autoradiographique des récepteurs aux neurokinines (NKs) dans le cerveau et la moelle épinière de rat suggérant ainsi l'existence de trois types de récepteurs aux NKs (NK-1, NK-2 et NK-3) dans les tissus cérébraux. Cette hypothèse concernant l'existence de trois types de récepteurs aux NKs est renforcée par l'apparition différentielle de ces récepteurs durant le développement ontogénique du cerveau de rat. Ces résultats suggèrent aussi que les récepteurs aux NKs soient des entités moléculaires différentes. Ces divers récepteurs aux NKs ont aussi été retrouvés dans le cerveau de cobaye et de l'homme indiquant leur préservation pendant le processus de l'évolution. Utilisant des radioligands sélectifs comme le [Sar9,Met(O2)11]-SP, le ?-préprotachykinine-(72-92)-NH2 et le senktide pour les récepteurs NK-1, NK-2 et NK-3 respectivement, nous avons obtenu des profils de liaison et de distribution généralement semblables à ceux obtenus avec des ligands moins sélectifs. Cependant, les radioligands sélectifs présentent de nets avantages surtout pour distinguer les diverses classes de récepteurs aux NKs présentes dans une région du cerveau où la coexistence de divers types de ces récepteurs est observée. Les trois NKs endogènes semblent capable d'agir sur la formation d'inositol triphosphate (IP3). Nos résultats indiquent néanmoins des niveaux de stimulation différents de l'hydrolyse du phosphatidyl inositol par ces trois NKs suggérant ainsi un couplage possible quelque peu différent pour chaque classe de récepteurs aux NKs. Finalement, nos résultats de photomarquage des récepteurs NK-1 révèlent un poids moléculaire de 46,000 daltons, ce qui est très près de celui du récepteur NK-1 récemment cloné (YOKOTA et coll., 1989; HERSHEY et KRAUSE, 1990). Globalement, nos résultats suggèrent donc fortement l'existence de trois classes de récepteurs aux NKs dans le cerveau. Ceci étant plus particulièrement supporté par des données de liaison sur préparations membranaires, d'autoradiographie, d'ontogenèse et de phylogenèse

Récepteurs multiples aux neurokinines dans le cerveau : distribution et caractérisation pharmacologique

L'utilisation des radioligands comme la [125I]-Bolton-Hunter-substance P ([125I]-BH-SP), la (2-[125I]-iodohistidyl1)-neurokinine A ([125I]-NKA) et l’[125I]- Bolton-Hunter-élédoisine ([125I]-BH-ELE) nous a permis de démontrer l'existence de trois profils de distribution autoradiographique des récepteurs aux neurokinines (NKs) dans le cerveau et la moelle épinière de rat suggérant ainsi l'existence de trois types de récepteurs aux NKs (NK-1, NK-2 et NK-3) dans les tissus cérébraux. Cette hypothèse concernant l'existence de trois types de récepteurs aux NKs est renforcée par l'apparition différentielle de ces récepteurs durant le développement ontogénique du cerveau de rat. Ces résultats suggèrent aussi que les récepteurs aux NKs soient des entités moléculaires différentes. Ces divers récepteurs aux NKs ont aussi été retrouvés dans le cerveau de cobaye et de l'homme indiquant leur préservation pendant le processus de l'évolution. Utilisant des radioligands sélectifs comme le [Sar9,Met(O2)11]-SP, le ?-préprotachykinine-(72-92)-NH2 et le senktide pour les récepteurs NK-1, NK-2 et NK-3 respectivement, nous avons obtenu des profils de liaison et de distribution généralement semblables à ceux obtenus avec des ligands moins sélectifs. Cependant, les radioligands sélectifs présentent de nets avantages surtout pour distinguer les diverses classes de récepteurs aux NKs présentes dans une région du cerveau où la coexistence de divers types de ces récepteurs est observée. Les trois NKs endogènes semblent capable d'agir sur la formation d'inositol triphosphate (IP3). Nos résultats indiquent néanmoins des niveaux de stimulation différents de l'hydrolyse du phosphatidyl inositol par ces trois NKs suggérant ainsi un couplage possible quelque peu différent pour chaque classe de récepteurs aux NKs. Finalement, nos résultats de photomarquage des récepteurs NK-1 révèlent un poids moléculaire de 46,000 daltons, ce qui est très près de celui du récepteur NK-1 récemment cloné (YOKOTA et coll., 1989; HERSHEY et KRAUSE, 1990). Globalement, nos résultats suggèrent donc fortement l'existence de trois classes de récepteurs aux NKs dans le cerveau. Ceci étant plus particulièrement supporté par des données de liaison sur préparations membranaires, d'autoradiographie, d'ontogenèse et de phylogenèse

Isolation des protéines non-histones de type HMG et leur modification par la poly (ADP-ribose) polymérase dans les noyaux de pancreas de rat

Les protéines HMG (High Mobility Group) sont des nucléoprotéines appartenant à la classe des protéines non-histones qui se trouvent associées préférentiellement à la partie activement transcrite de la chromatine. La poly (ADP-ribosylation) des protéines nucléaires, notamment les histones, serait impliquée dans certains mécanismes régulateurs de la' chromatine. Dans ce travail, nous avons analysé la poly (ADP-ribosylation) des protéines HMG, celles-ci étant reconnues pour être impliquées dans la transcription. Dans une première étape, nous avons mis au point des techniques d'extraction, de purification et de séparation des protéines HMG dans le pancréas de rat. En second lieu, nous avons caractérisé la poly (ADP­ ribosylation) des protéines HMG par des techniques d'électrophorèse sur gel polyacrylamide dans des conditions qui assurent la stabilité des protéines poly (ADP-ribosylées). Ainsi, les protéines HMG pancréatiques sont extraites à l'aide d'acide perchlorique 5% et sont séparées par des précipitations sélectives à l'acétone en milieu acide. Elles sont ensuite identifiées en comparant leur mobilité relative avec celles des protéines HMG du thymus de veau. Il y a 4 protéines HMG qui se .nomment lll1G 1, 2, 14 et 17. Nous avons observé que toutes les protéines HMG sont poly (ADP-ribosylées). De plus, le polymère lié aux protéines HMG est plus long que celui lié à l'histone H1 mais l'élongation in vitro du polymère lié aux protéines HMG et à l'histone Hl semble être de même niveau. Nous avons développé une technique de séparation sur gel polyacrylamide des protéines poly (ADP-ribosylées) en présence de lithium dodécyl sulfate (LDS) qui assure la stabilité du poly (ADP-ribose) lié aux protéines; cette technique est· réalisée dans des conditions acides et à basse température. Nous avons démontré que les protéines HMG 14 et 17 qui se trouvent dans l'euchromatine, sont proportionnellement plus poly (ADP-ribosylées) que l'histone Hl. Ceci implique une distribution préférentielle de l’activité de la poly (ADP-ribose) polymérase sur la partie activement transcrite de la chromatine et suggère que la poly (ADP-ribosylation) pourrait être impliquée dans la transcription

Activation of cAMP signaling transiently inhibits apoptosis in vascular smooth muscle cells in a site upstream of caspase-3

Intracellular signaling pathways that are involved in protection of vascular smooth muscle cells (VSMC) from apoptosis remain poorly understood. This study examines the effect of activators of cAMP/cGMP signaling on apoptosis in non-transfected VSMC and in VSMC transfected with c-myc (VSMC-MYC) or with its functional analogue, E1A-adenoviral protein (VSMC-E1A). Serum-deprived VSMC-E1A exhibited the highest apoptosis measured as the content of chromatin and low molecular weight DNA fragments, phosphatidylserine content in the outer surface of plasma membrane and caspase-3 activity (ten-, five-, four- and tenfold increase after 6 h of serum withdrawal, respectively). In VSMC-E1A, the addition of an activator of adenylate cyclase, forskolin, abolished chromatin cleavage, DNA laddering, caspase-3 activation and the appearance of morphologically-defined apoptotic cells triggered by 6 h of serum deprivation. In non-transfected VSMC and in VSMC-MYC, 6 h serum deprivation led to approximately six- and threefold activation of chromatin cleavage, respectively, that was also blocked by forskolin. In VSMC-E1A, inhibition of apoptosis was observed with other activators of cAMP signaling (cholera toxin, isoproterenol, adenosine, 8-Br-cAMP), whereas 6 h incubation with modulators of cGMP signaling (8-Br-cGMP, nitroprusside, atrial natriuretic peptide, L-NAME) did not affect the development of apoptotic machinery. The antiapoptotic effect of forskolin was abolished in 24 h of serum deprivation that was accompanied by normalization of intracellular cAMP content and protein kinase A (PKA) activity. Protection of VSMC-E1A from apoptosis by forskolin was blunted by PKA inhibitors (H-89 and KT5720), whereas transfection of cells with PKA catalytic subunit attenuated apoptosis triggered by serum withdrawal. The protection of VSMC-E1A by forskolin from apoptosis was insensitive to modulators of cytoskeleton assembly (cytochalasin B, colchicine). Neither acute (30 min) nor chronic (24 h) exposure of VSMC to forskolin modified basal and serum-induced phosphorylation of the MAP kinase ERK1/2. Thus, our results show that activation of cAMP signaling delays the development of apoptosis in serum-deprived VSMC at a site upstream of caspase-3 via activation of PKA and independently of cAMP-induced reorganization of the cytoskeleton network and the ERK1/2-terminated MAPK signaling cascade