Síntesis de iminoazúcares sp2 y evaluación de su actividad como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de las enfermedades de Gaucher, Fabry y gangliosidosis GM1

Texto completo descargado de TeseoLas enfermedades de depósito lisosomal (Lysosomal Storage Disorders, LSDs), entre las que se encuentran la enfermedad de Gaucher (GD), la enfermedad de Fabry (FD) y la gangliosidosis GM1 (GM1) son un conjunto de enfermedades de carácter genético que afectan a un bajo porcentaje de la población mundial. Para la mayoría de ellas no se dispone aún de tratamiento eficaz. Se caracterizan por la disfunción de alguna de las enzimas encargadas de degradar glicoesfingolípidos en el interior del lisosoma. En muchos de los casos, la mutación genética en el origen de la enfermedad conlleva una modificación en la secuencia de aminoácidos de la proteína afectada que altera el plegamiento correcto de la misma. Las enzimas defectuosas son derivadas durante su biosíntesis hacia el proteosoma por el mecanismo de control de calidad del retículo endoplasmático y degradadas, no alcanzando por tanto su destino. Esto conduce a la acumulación del correspondiente sustrato en el lisosoma lo que, a su vez, da lugar a una variedad de patologías en general de carácter muy grave. Aunque en algunos casos la administración de la correspondiente enzima recombinante ha permitido mejorar enormemente la calidad de vida de los pacientes afectados, esta aproximación terapéutica no es hoy por hoy aplicable cuando existen implicaciones en el sistema nervioso central. El diseño de moléculas capaces de forzar el plegamiento correcto, rescatar la enzima mutante y promover su tráfico al lisosoma representa una alternativa para estos casos y ha dado lugar a la estrategia conocida como terapia de la chaperona farmacológica. Esta Tesis supone una contribución al desarrollo de chaperonas farmacológicas para GD, FD y GM1 basadas en glicomiméticos con estructura de iminoazúcares sp2. Compuestos de esta familia han demostrado comportarse como inhibidores potentes y selectivos de glicosidasas, incluyendo varias glicosidasas lisosomales humanas. A concentraciones subinhibitorias, son capaces de unirse a la enzima mutada en el retículo endoplásmico y acompañarla en su camino primero al aparato de Golgi para su maduración y luego al lisosoma, donde el exceso de sustrato los desplaza y el procesado tiene lugar. Datos de difracción de rayos X de los correspondientes complejos iminoazúcar sp2-enzima y estudios de relaciones estructura-actividad han permitido seleccionar buenos candidatos como chaperonas farmacológicas que han sido evaluados en fibroblastos de pacientes, en células COS que expresan mutaciones relacionadas con LSDs e incluso in vivo en ratones transgénicos. Un primer conjunto de los resultados obtenidos se refiere a la síntesis de dos nuevas familias de iminoazúcares sp2 derivados de 1-desoxinojirimicina (DNJ) y de su análogo de configuración L-ido (L-DIJ) capaces de actuar sobre las enzimas que operan en la biosíntesis y degradación de la glucosilceramida, el glicoesfingolípido que se acumula en el caso de la enfermedad de Gaucher. En colaboración con los Profesores J. M. F. G. Aerts (Univ. Amsterdam) y H S. Overkleeft (Univ. Leiden), se ha determinado el aumento de la actividad intralisosomal en fibroblastos de Gaucher tras el tratamiento con las chaperonas, haciendo uso de ¿sondas de actividad¿ etiquetadas con marcadores fluorescentes. En ambas series se han identificado compuestos con buenas perspectivas para su utilización en el tratamiento de las patologías de GD. La parte central de la Tesis se centra en el diseño de inhibidores específicos de la a-galactosidasa (a-Gal A) y de la b-galactosidasa (b-Gal) lisosomales susceptibles de desarrollo como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de la enfermedad de Fabry y de la gangliosidosis GM1, respectivamente. Hemos demostrado que la especifidad de acción de iminoazúcares sp2 derivados de la 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) puede dirigirse hacia una u otra enzima actuando sobre la estructura del esqueleto de iminoazúcar: derivados monocíclicos presentan una elevada selectividad hacia a-Gal A en tanto que derivados bicíclicos lo hacen hacia la b-Gal. Este cambio en la selectividad está gobernado por interacciones no glicónicas de carácter hidrófobo que, a su vez, requieren una orientación definida del sustituyente exocíclico sobre el grupo pseudoamida. En colaboración con los grupos de los Profesores Y. Suzuki (Univ. Otawara), K. Ohno y K. Higaki (Univ. Tottori, Japón), se ha evaluado el potencial como chaperonas farmacológicas de los nuevos derivados tanto in vitro en fibloblastos humanos y en células COS que expresan mutaciones de FD o GM1 como, en el caso de la GM1, in vivo en ratones genéticamente modificados. Los resultados demuestran la capacidad de las chaperonas desarrolladas de cruzar la barrera hematoencefálica y reducir el acúmulo de glicoesfingolípidos en el cerebro, revirtiendo de esta manera la enfermedad a nivel del tejido neuronal. Dado que una chaperona farmacológica eficaz debe de unirse fuertemente a la enzima diana en el retículo endoplasmático (pH 7.3) pero disociarse en el lisosoma (pH 5.2), hemos explorado la incorporación de un grupo ortoéster, sensible al pH, en el diseño de una nueva generación de iminoazúcares sp2 derivados de DNJ y DGJ. Este grupo conecta el núcleo de iminoazúcar con el sustituyente hidrofóbico, de manera que la hidrólisis a pH 5.5 o inferior conduce a una pérdida importante de afinidad. El concepto se ha aplicado a la preparación de chaperonas farmacológicas para GD y FD. Nuestro interés en nuevas aproximaciones para modular la potencia y selectividad de los iminoazúcares como inhibidores de glicosidasas, con miras a sus aplicaciones en diferentes patologías, nos ha llevado a explorar el efecto de una presentación multivalente en sus propiedades de inhibición. En colaboración con los grupos de los Profesores P. Compain y J.-F. Nierengarten (Univ. de Estrasburgo), se han preparado multiconjugados de DNJ o DMJ basados plataformas de fullereno-C60 o b-ciclodextrina (bCD). Se han observado modificaciones significativas en el perfil de afinidad hacia diferentes enzimas que son función de la valencia y de la arquitectura tridimensional del sistema. El resultado más llamativo es el aumento de hasta cuatro órdenes de magnitud en la potencia de inhibición de la a-manosidasa (a-Manasa) de judía Jack, una enzima estructuralmente relacionada con las a-Manasas lisosomal y de Golgi humanas, para un conjugado tetradecavalente de DNJ-bCD. Estos estudios han conducido a formular la existencia de un efecto inhibidor multivalente. En la Tesis también se aborda el desarrollo de nuevas metodologías de síntesis de iminoazúcares de la familia de las pirrolidinas y análogos de 2-acetamido-1,2-didesoxiazúcares. Estos trabajos se han realizado en colaboración con los grupos de los Profesores G. W. J. Fleet (Univ. Oxford) y A. Riera (Univ. Barcelona) y han permitido acceder a derivados de la serie L en el primer caso y a la primera síntesis de la 2-acetamido-1,2-didesoxialonojirimicina (DAJNAc), un inhibidor potente de la b-glucosaminidasa (b-GlcNAcasa) de placenta humana, en el segundo.Premio Extraordinario de Doctorado U

Stereoselective synthesis of 2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin (DNJNAc) and ureido-DNJNAc derivatives as new hexosaminidase inhibitors

2-Acetamido-1,2-dideoxyiminosugars are selective and potent inhibitors of hexosaminidases and therefore show high therapeutic potential for the treatment of various diseases, including several lysosomal storage disorders. A stereoselective synthesis of 2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin (DNJNAc), the iminosugar analog of N-acetylglucosamine, with a high overall yield is here described. This novel procedure further allowed accessing ureido-DNJNAc conjugates through derivatization of the endocyclic amine on a key pivotal intermediate. Remarkably, some of the ureido-DNJNAc representatives behaved as potent and selective inhibitors of β-hexosaminidases, including the human enzyme, being the first examples of neutral sp2-iminosugar-type inhibitors reported for these enzymes. Moreover, the amphiphilic character of the new ureido-DNJNAc is expected to confer better drug-like properties.Ministerio de Economía y Competitividad CTQ2011-23620, SAF2013-44021R y CTQ2010-15848Generalitat de Catalunya 2014SGR 234Junta de Andalucía FQM-146

A Bicyclic 1-Deoxygalactonojirimycin Derivative as a Novel Pharmacological Chaperone for GM1 Gangliosidosis

Lysosomal β-galactosidase (β-Gal) deficiency causes a group of disorders that include neuronopathic GM1 gangliosidosis and non-neuronopathic Morquio B disease. We have previously proposed the use of small molecule ligands of β-Gal as pharmacological chaperones (PCs) for the treatment of GM1 gangliosidosis brain pathology. Although it is still under development, PC therapy has yielded promising preclinical results in several lysosomal diseases. In this study, we evaluated the effect of bicyclic 1-deoxygalactonojirimycin (DGJ) derivative of the sp2-iminosugar type, namely 5N,6S-(N′-butyliminomethylidene)-6-thio-1- deoxygalactonojirimycin (6S-NBI-DGJ), as a novel PC for human mutant β-Gal. In vitro, 6S-NBI-DGJ had the ability to inhibit the activity of human β-Gal in a competitive manner and was able to protect this enzyme from heat-induced degradation. Computational analysis supported that the rigid glycone bicyclic core of 6S-NBI-DGJ binds to the active site of the enzyme, with the aglycone N′-butyl substituent, in a precise E-orientation, located at a hydrophobic region nearby. Chaperone potential profiling indicated significant increases of enzyme activity in 24 of 88 β-Gal mutants, including four common mutations. Finally, oral administration of 6S-NBI-DGJ ameliorated the brain pathology of GM1 gangliosidosis model mice. These results suggest that 6S-NBI-DGJ is a novel PC that may be effective on a broad range of β-Gal mutants.Ministerio de Ciencia e Innovación de España. SAF2010-15670 y CTQ2010-15848Junta de Andalucía. P08-FQM-0371

Probing the Inhibitor versus Chaperone Properties of sp2-Iminosugars towards Human β-Glucocerebrosidase: A Picomolar Chaperone for Gaucher Disease

A series of sp2-iminosugar glycomimetics differing in the reducing or nonreducing character, the configurational pattern (d-gluco or l-ido), the architecture of the glycone skeleton, and the nature of the nonglycone substituent has been synthesized and assayed for their inhibition properties towards commercial glycosidases. On the basis of their affinity and selectivity towards GH1 β-glucosidases, reducing and nonreducing bicyclic derivatives having a hydroxylation profile of structural complementarity with d-glucose and incorporating an N′-octyl-isourea or -isothiourea segment were selected for further evaluation of their inhibitory/chaperoning potential against human glucocerebrosidase (GCase). The 1-deoxynojirimycin (DNJ)-related nonreducing conjugates behaved as stronger GCase inhibitors than the reducing counterparts and exhibited potent chaperoning capabilities in Gaucher fibroblasts hosting the neuronopathic G188S/G183W mutation, the isothiourea derivative being indeed one of the most efficient chaperone candidates reported up to date (70% activity enhancement at 20 pM). At their optimal concentration, the four selected compounds promoted mutant GCase activity enhancements over 3-fold; yet, the inhibitor/chaperoning balance became unfavorable at much lower concentration for nonreducing as compared to reducing derivatives.España Ministerio de Economía y Competitividad (contract numbers CTQ2015-64425-C2-1-R and SAF2016-76083-R)Junta de Andalucía contract number FQM2012-146

Probing the Inhibitor versus Chaperone Properties of sp2-Iminosugars towards Human -Glucocerebrosidase: A Picomolar Chaperone for Gaucher Disease

A series of sp2-iminosugar glycomimetics differing in the reducing or nonreducing character, the configurational pattern (d-gluco or l-ido), the architecture of the glycone skeleton, and the nature of the nonglycone substituent has been synthesized and assayed for their inhibition properties towards commercial glycosidases. On the basis of their affinity and selectivity towards GH1 β-glucosidases, reducing and nonreducing bicyclic derivatives having a hydroxylation profile of structural complementarity with d-glucose and incorporating an N′-octyl-isourea or -isothiourea segment were selected for further evaluation of their inhibitory/chaperoning potential against human glucocerebrosidase (GCase). The 1-deoxynojirimycin (DNJ)-related nonreducing conjugates behaved as stronger GCase inhibitors than the reducing counterparts and exhibited potent chaperoning capabilities in Gaucher fibroblasts hosting the neuronopathic G188S/G183W mutation, the isothiourea derivative being indeed one of the most efficient chaperone candidates reported up to date (70% activity enhancement at 20 pM). At their optimal concentration, the four selected compounds promoted mutant GCase activity enhancements over 3-fold; yet, the inhibitor/chaperoning balance became unfavorable at much lower concentration for nonreducing as compared to reducing derivatives.Ministerio de Economía y Competitividad CTQ2015-64425-C2-1-R , SAF2016-76083-RJunta de Andalucía FQM2012-1467Japan Society for the Promotion of Science JSPS KAKENHI 17K1005

Stereoselective synthesis of 2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin (DNJNAc) and ureido-DNJNAc derivatives as new hexosaminidase inhibitors

2-Acetamido-1,2-dideoxyiminosugars are selective and potent inhibitors of hexosaminidases and therefore show high therapeutic potential for the treatment of various diseases, including several lysosomal storage disorders. A stereoselective synthesis of 2-acetamido-1,2-dideoxynojirimycin (DNJNAc), the iminosugar analog of N-acetylglucosamine, with a high overall yield is here described. This novel procedure further allowed accessing ureido-DNJNAc conjugates through derivatization of the endocyclic amine on a key pivotal intermediate. Remarkably, some of the ureido-DNJNAc representatives behaved as potent and selective inhibitors of β-hexosaminidases, including the human enzyme, being the first examples of neutral sp2-iminosugar-type inhibitors reported for these enzymes. Moreover, the amphiphilic character of the new ureido-DNJNAc is expected to confer better drug-like properties

PDA-Based Glyconanomicelles for Hepatocellular Carcinoma Cells Active Targeting Via Mannose and Asialoglycoprotein Receptors

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most common neoplasia and the fourth most common cause of cancer-related mortality worldwide. Sorafenib is the first-line molecular therapy for patients in an advanced stage of HCC. However, the recommended clinical dose of Sorafenib is associated with several complications, which derive from its lack of cell specificity and its very low water solubility. To circumvent these drawbacks, in the present study we developed two sugar-coated polydiacetylene-based nanomicelles-Sorafenib carriers targeting mannose and asialoglycoprotein receptors (MR and ASGPR, respectively). The strategies allowed the inducement of apoptosis and reduction of cell proliferation at a nanomolar, instead of micromolar, range in liver cancer cells. The study showed that, contrary to literature data, Sorafenib included into the pMicMan (Man = mannose) vector (targeting MR) is more efficient than pMicGal (Gal = galactose) (targeting ASGPR). Indeed, pMicMan increased the endosomal incorporation with an increased intracellular Sorafenib concentration that induced apoptosis and reduced cell proliferation at a low concentration range (10-20 nM).Financial support was provided by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (CTQ2016-78580-C2-1-R to N.K.) and the Institute of Health Carlos III (ISCIII) (PI13/00021, PI16/00090, and PI19/01266 to J.M.) both cofinanced by the European Regional Development Fund (ERDF) from FEDER and the European Social Fund (ESF), as well by the Andalusian Ministry of Economy, Science and Innovation (P07-FQM-2774 to N.K., CV20-04221 to N.K. P20_00882 to N.K. and CTS-6264 to J.M.), the PAIDI Program from the Andalusian Government (FQM-313 to N.K., CV20-04221 to N.K., P20_00882 to N.K., P20_00882 to N.K., and CTS-0664 to J.M.), the Andalusian Ministry of Health (PI-00025-2013, and PI-0198-2016 to J.M.), and the CSIC (CSIC–COV19-047). We thank the Biomedical Research Network Center for Liver and Digestive Diseases founded by the ISCIII and cofinanced by FEDER “A way to achieve Europe” and ERDF for their financial support. The COST action CA-18132 “Functional Glyconanomaterials for the Development of Diagnostic and Targeted Therapeutic Probe” is also acknowledged. E.R.B., C.C.A., and P. de la C.-O. were supported by FPU predoctoral fellowship (FPU15/04267, FPU17/00190, and FPU17/00026) from Spanish Ministry of Education, Culture and Sports. E.N.-V. was supported by the predoctoral i-PFIS IIS-enterprise contract in science and technologies in health (IFI18/00014) from ISCiii.Peer reviewe