In-capillary immuno-preconcentration with circulating bio-functionalized magnetic beads for capillary electrophoresis

International audienceThis study reports on the conception of magneto-Capillary Electrophoresis (magneto-CE), an approach integrating immuno-capture on circulating bio-functionalized magnetic beads into a unique capillary for preconcentration and electrokinetic separation. This hybrid mode is an evolution of in-capillary magnetic bead-based operation from static cluster format to dynamic configuration where beads are allowed to controllably circulate inside a CE capillary for interaction improvement. To implement the magneto-CE operation, a purpose-made instrument was constructed, allowing visual observation of the movement of the magnetic beads. We applied a new methodological strategy for determination of the amyloid β peptide (Aβ 1–42), which is as an established biomarker for molecular diagnosis of Alzheimer's disease (AD). The methodology is based on magneto-immuno-capture of fluorescently labeled Aβ 1–42 followed by a chemical elution with a basic solution prior to CE separation with laser induced fluorescent (LIF) detection. The superiority of this dynamic configuration of magneto-CE was demonstrated for this target analyte, with sample pretreatment and separation being performed in-capillary without any delay in between and without any waste of pretreated sample, which otherwise would not be the case with offline/batch-wise operation

A new record of ascidiella scabra (Müller, 1776) (ascidiacea, phlebobranchia) in the southwestern atlantic

Non-indigenous ascidians are transported across oceans in vessel-hull fouling communities, and regional traffic plays a role in their secondary spread. We found the ascidian Ascidiella scabra (Müller, 1776) in the hull-fouling community of an oceanographic vessel confined to waters of the southwestern Atlantic and Southern Oceans. The previously known distribution of this species was restricted to its native area (Mediterranean Sea and northeastern Atlantic); its presence in the southwestern Atlantic may have been masked in the past by the occurrence of its congener Ascidiella aspersa (Müller, 1776).Fil: Gimenez, Diego Roman. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Diversidad y Ecología Animal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto de Diversidad y Ecología Animal; ArgentinaFil: Taverna, Anabela Jesús. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Diversidad y Ecología Animal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto de Diversidad y Ecología Animal; ArgentinaFil: Meloni, Marco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; ArgentinaFil: Correa, Nancy Myriam. Ministerio de Defensa. Armada Argentina. Servicio de Hidrografía Naval; Argentina. Ministerio de Defensa. Armada Argentina. Instituto Universitario Naval de la Ara. Escuela de Ciencias del Mar; Argentina. Universidad de la Defensa Nacional.; ArgentinaFil: Sylvester, Francisco. Universidad Nacional de Salta. Facultad de Ciencias Naturales. Instituto para el Estudio de la Biodiversidad de Invertebrados; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Salta; ArgentinaFil: Tatian, Marcos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Diversidad y Ecología Animal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto de Diversidad y Ecología Animal; Argentin

In-capillary immuno-preconcentration with circulating bio-functionalized magnetic beads for capillary electrophoresis

This study reports on the conception of magneto-Capillary Electrophoresis (magneto-CE), an approach integrating immuno-capture on circulating bio-functionalized magnetic beads into a unique capillary for preconcentration and electrokinetic separation. This hybrid mode is an evolution of in-capillary magnetic bead-based operation from static cluster format to dynamic configuration where beads are allowed to controllably circulate inside a CE capillary for interaction improvement. To implement the magneto-CE operation, a purpose-made instrument was constructed, allowing visual observation of the movement of the magnetic beads. We applied a new methodological strategy for determination of the amyloid beta peptide (A beta 1-42), which is as an established biomarker for molecular diagnosis of Alzheimer's disease (AD). The methodology is based on magneto-immuno-capture of fluorescently labeled A beta 1-42 followed by a chemical elution with a basic solution prior to CE separation with laser induced fluorescent (LIF) detection. The superiority of this dynamic configuration of magneto-CE was demonstrated for this target analyte, with sample pretreatment and separation being performed in-capillary without any delay in between and without any waste of pretreated sample, which otherwise would not be the case with offline/batch-wise operation. (C) 2019 Elsevier B.V. All rights reserved

Designed glycopeptidomimetics disrupt protein−protein interactions mediating amyloid β‑peptide aggregation and restore neuroblastoma cell viability

How anti-Alzheimer’s drug candidates that reduce amyloid 1−42 peptide fibrillization interact with the most neurotoxic species is far from being understood. We report herein the capacity of sugar-based peptidomimetics to inhibit both Aβ1−42 early oligomerization and fibrillization. A wide range of bio- and physicochemical techniques, such as a new capillary electrophoresis method, nuclear magnetic resonance, and surface plasmon resonance, were used to identify how these new molecules can delay the aggregation of Aβ1−42. We demonstrate that these molecules interact with soluble oligomers in order to maintain the presence of nontoxic monomers and to prevent fibrillization. These compounds totally suppress the toxicity of Aβ1−42 toward SH-SY5Y neuroblastoma cells, even at substoichiometric concentrations. Furthermore, demonstration that the best molecule combines hydrophobic moieties, hydrogen bond donors and acceptors, ammonium groups, and a hydrophilic β-sheet breaker element provides valuable insight for the future structure-based design of inhibitors of Aβ1−42 aggregation

Electrokinetic characterization of extracellular vesicles with capillary electrophoresis : A new tool for their identification and quantification

This work reports on the development of the first capillary electrophoresis methodology for the elucidation of extracellular vesicles' (EVs) electrokinetic distributions. The approach is based on capillary electrophoresis coupled with laser-induced fluorescent (LIF) detection for the identification and quantification of EVs after their isolation. Sensitive detection of these nanometric entities was possible thanks to an 'inorganic-species-free' background electrolyte. This electrolyte was made up of weakly charged molecules at very high concentrations to stabilize EVs, and an intra-membrane labelling approach was used to prevent EV morphology modification. The limit of detection for EVs achieved using the developed CE-LIF method reached 8 x 10(9) EV/mL, whereas the calibration curve was acquired from 1.22 x 10(10) to 1.20 x 10(11) EV/mL. The CE-LIF approach was applied to provide the electrokinetic distributions of various EVs of animal and human origins, and visualize different EV subpopulations from our recently developed high-yield EV isolation method. (C) 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.Peer reviewe

Monolithe polymérique ou à base de silice pour la préconcentration couplée à l'électrophorèse capillaire pour l'analyse de biomolécules

L électrophorèse capillaire (EC) est une technique analytique séparative moderne qui offre les avantages d une haute résolution, de temps d analyse courts et d une consommation minimale des échantillons et réactifs. Toutefois, il est difficile d'analyser ces échantillons directement par EC sans prétraitement. Par conséquent, la purification des échantillons et l'amélioration de la sensibilité de détection sont primordiales afin de permettre l utilisation de l EC pour analyser ces composés. Ainsi, le but de ce travail était de développer et de synthétiser in-situ des monolithes dans des capillaires pour la pré-concentration de protéines et d ADN en EC. Le couplage en ligne de l'extraction et la séparation d'ADN par EC a été développé en préparant un monolithe aminé à base de silice. Par ailleurs, la polymérisation d'un monolithe fonctionnalisé par des anticorps immobilisés a été mise au point pour une pré-concentration de protéines par immuno-affinité couplée à leur séparation par EC.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Développement d'une méthode de préconcentration de phosphopeptides sur phase monolithique en puce

La phosphorylation de protéines est un régulateur clé de voies de signalisation cellulaire. Elle est impliquée dans la plupart des événements cellulaires et contrôle les processus biologiques tels que la prolifération, la différenciation et l'expression des gènes. Une phosphorylation anormale de protéines peut être observée dans diverses maladies comme certains cancers ou maladies neurodégénératives. Ces protéines constituent donc des biomarqueurs potentiels pour le développement d outils de diagnostic. Cependant les phosphoprotéines peuvent être présentes à faibles concentrations dans les liquides biologiques et des techniques d enrichissement sélectif des protéines phosphorylées doivent être développées en amont des analyses. L'une des approches les plus courantes est basée sur la chromatographie d'affinité de type IMAC. Le but de ce travail de thèse était de développer un microsystème contenant un monolithe en tant que support solide d'extraction pour réaliser une préconcentration sélective de phosphopeptides par IMAC. La polymérisation par UV et la caractérisation (perméabilité, porosité et surface spécifique) d'un monolithe à base de phosphate de méthacrylate d'éthylène glycol dans des capillaires de silice ont été d'abord réalisées. Puis, nous avons tenté d'optimiser les différentes étapes de l IMAC (immobilisation du métal, chargement de l échantillon, lavage et élution). Une immobilisation efficace de zirconium sur le monolithe phosphaté a été démontrée par des mesures de FEO dans un capillaire et a été par la suite confirmée par la rétention d'un phosphopeptide modèle. Nous avons démontré que le monolithe phosphaté était également un support d échange de cations vis-à-vis de peptides fortement basiques. Les protocoles de chargement et d'élution ont également été étudiés, mais nécessitent encore d être améliorés. La transposition de l'enrichissement de phosphopeptides par IMAC sur un système miniaturisé a ensuite été envisagée. Nous avons choisi deux matériaux pour la puce : le PDMS, qui est un polymère attractif pour son faible coût, sa facilité de microfabrication, ses excellentes propriétés en termes de biocompatibilité ainsi que ses nombreuses possibilités d'intégration (enrichissement, séparation, détection) et le verre plus communément employé pour développer des microsystèmes analytiques et possédant une bonne transparence aux UV. Toutefois, le PDMS présente deux inconvénients majeurs: son absorption élevée et sa perméabilité importante à l'oxygène qui inhibe la polymérisation radicalaire. A l exception de quelques tentatives, ce matériau n'a jamais été employé avec succès comme support pour la polymérisation d un monolithe. Afin de pouvoir surmonter ces problèmes, nous avons étudié plusieurs stratégies de traitement de surface du PDMS tels que le traitement par plasma d oxygène ou encore le revêtement au borosilicate. Enfin, nous avons démontré que notre module d IMAC fonctionnait correctement dans un microsystème en verre. Ce module miniaturisé devrait à l avenir s intégrer dans un microsystème d analyse dédié au diagnostic de la maladie d'Alzheimer.Protein phosphorylation is a key regulator of cellular signaling pathways. It is involved in most cellular events and strictly controls biological processes such as proliferation, differentiation and gene expression. An abnormal phosphorylation can be observed in various diseases such as some cancers or neurodegenerative diseases. Therefore, these proteins are potential biomarkers for the development of diagnostic tools. However, phosphoproteins can be present at low abundance in biological samples and selective enrichment techniques have to be developed prior to the analysis process. One of the most common approaches is based on Immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The goal of this work was to develop a microsystem which contains a porous polymer monolith (PPM) as a solid phase extraction for a selective preconcentration of phosphopeptides by IMAC. UV-polymerization and characterization (permeability, porosity and specific area) of a monolith based on ethylene glycol methacrylate phosphate in silica capillaries was first performed. Then, we tried to optimize the different IMAC steps (metal immobilization, sample loading, washing and elution). An efficient immobilization of zirconium on the phosphated PPM was demonstrated by EOF measurements in capillary and confirmed by retention of a model phosphopetide. We demonstrated that the phosphated monolith was also a strong cation exchanger of highly basic peptides. Protocols of loading and elution were also studied but need to be further optimized. Transposition of phosphopeptides enrichment by IMAC on a miniaturized system was then considered. We selected two microchip materials: PDMS is an attractive polymer for its low cost, its ease of microfabrication, its excellent working properties (biocompatibility, UV transparent with low autofluorescence) and many integration possibilities (enrichment, separation and detection) and glass microchip more common and having a good UV transparency. However, PDMS presents two major disadvantages: high absorption property, and oxygen permeability which quench free radical polymerization. Except a few attempts, this material has not been employed successfully as mould for monolith polymerization. To overcome these problems, we investigated several strategies for PDMS surface treatments such as plasma treatment and borosilicate coating. Finally, we demonstrated that our IMAC module performed well on glass microchip. This miniaturized module should be integrated in the future into a microsystem dedicated to the diagnosis of Alzheimer disease.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Production des vaccins anti-infectieux (les procédés de purification)

CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Électrochromatographie capillaire (évaluation d'une nouvelle phase stationnaire mixte et application à l'analyse de peptides et à l'établissement de cartes peptidiques)

L'électrochromatographie capillaire (ECC) a été étudiée avec une phase stationnaire particulaire possédant un groupement ammonium quaternaire au sein d'une chaîne octadécyle. Après avoir mis au point un mode de fabrication des colonnes capillaires, j'ai étudié le flux électroosmotique (FEO), l'efficacité des pics et un nouveau paramètre, la porosité électrocinétique réelle. J'ai ainsi pu explorer le FEO perfusif, la mouillabilité de la phase stationnaire et déterminer les meilleures conditions d'analyse pour des composés variés. J'ai testé différentes estimations de la rétention chromatographique de peptides chargés en ECC et demontré les atouts de cette phase stationnaire pour l'établissement de carte peptidiques. Une comparaison CLHP/ECC a souligné la très grande différence de rétentions entre ces modes d'analyse et la profonde originalité de l'ECC, la prédominance des phénomènes électrophorétiques et un phénomène de partage à polarité de phases inversée et une faible rétention.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Les Techniques spécifiques du fractionnement des protéines plasmatiques en vue d'obtenir des médicaments dérivés du plasma

Le premier fractionnement des protéines plasmatiques est apparu pendant la seconde guerre mondiale afin de produire de l'albumine purifiée. De nos jours, ce fractionnement permet l'obtention de nombreuses protéines plasmatiques utilisées dans diverses aires thérapeutiques : immunologie, hémostase et soins intensifs. Le marché mondial de ces produits plasmatiques s'élève à plus de six milliards d'euros, ce qui représente 22 à 25 millions de litres de plasma fractionné chaque année par environ 70 fractionneurs (entreprise réalisant le fractionnement du plasma), privés ou publics. Les protéines extraites du plasma par fractionnement, à des fins thérapeutiques, sont appelés aussi "médicaments dérivés du sang". Ils se distinguent des autres médicaments "biologiques" de par leur origine, les techniques de fabrication qui impliquent des successions d'étapes de précipitation, filtration, chromatographie... dont certaines sont spécifiques à ce fractionnement plasmatique ; avec notamment la cryoprécipitation, la précipitation éthanolique et le fractionnement par l'acide caprylique. Enfin, un point marquant de ces médicaments dérivés du sang est l'importance apportée à la sécurisation virale. De plus, le tout s'inscrit dans un cadre réglementaire et de pharmacovigilance propre à ces médicaments.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF