Screening natural resources for mineralogenic and osteogenic bioactivities using in vitro and in vivo fish systems

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Bone disorders affect millions of people worldwide, and available treatments have only a limited efficacy and/or bring undesirable side effects. There is therefore the need for novel compounds with bone anabolic properties. Due to its technical advantages, fish have been successfully used in biomedical and pharmaceutical research to screen for osteogenic compounds. The aim of this work was to evaluate mineralogenic/osteogenic performance of semi-purified fractions and purified molecules from terrestrial plants (cardoon and eucalyptus) and cyanobacteria. VSa13 cell line established from gilthead seabream (Sparus aurata) vertebra and capable of in vitro mineralization was used to assess the mineralogenic potential of the extracts, while zebrafish operculum was used to develop and establish a reliable in vivo model to screen molecules for osteogenic activity. Extracts from cardoon, eucalyptus and some cyanobacteria exhibited some moderate mineralogenic effect while triterpenic acids purified from eucalyptus strongly increased mineral deposition. Pro-mineralogenic compounds were further analysed for their bone anabolic action on zebrafish operculum and lipophilic cardoon extract, ursolic acid, oleanolic acid and ethyl acetate fraction of cyanobacteria strain #13 were found to promote an osteogenic effect. While the osteogenicity of ursolic acid has already been reported in mouse, the action of oleanolic acid and cyanobacteria extract on bone formation is revealed here for the first time. The use of a double transgenic line expressing fluorescent proteins under the control of osterix/sp7 and osteocalcin/oc2 promoters to get insights into mechanisms underlying the osteogenic activity of natural compounds has been explored. In vitro and in vivo data generated within the scope of this work have not only demonstrated the potential of natural resources to provide molecules with mineralogenic/osteogenic activity that may be used in pharmaceuticals or nutraceuticals but also the suitability of fish systems to screen for these molecules.O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo constituído por células e por uma matriz extracelular, que possui como característica única a capacidade de promover a sua mineralização,, o que confere a este tecido uma extrema dureza, permitindo-lhe desempenhar importantes funções quer de suporte mecânico aos músculos, possibilitando o movimento, quer de proteção de órgãos internos, constituindo também uma reserva de iões de cálcio e de fosfato. As patologias mais importantes que afectam o esqueleto incluem doenças metabólicas, que afectam o crescimento através de alterações na formação e remoção óssea, fracturas, deformações várias,, infecções bacterianas e tumores. Entre as doenças metabólicas que afectam milhões de pessoas em todo o mundo e que resultam do desequilíbrio entre a atividade osteoblástica (formação óssea) e a atividade osteoclástica (reabsorção óssea) estão a osteoporose, a osteopetrose, o raquitismo e a doença óssea de Paget. No entanto os tratamentos usados são ineficazes e/ou estão associados a efeitos secundários indesejáveis existindo a necessidade de descobrir novos compostos com a capacidade de reverter os sintomas dessas patologias no osso. Os recursos naturais representam uma fonte valiosa de moléculas bioativas, em particular de compostos osteogénicos. A análise em grande escala de extratos ou moléculas com potenciais efeitos osteogénicos requer o uso de ferramentas in vitro e in vivo optimizadas Organismos aquáticos como o peixe-zebra (zebrafish) têm sido utilizados com sucesso nas investigações biomédica e farmacêutica devido às suas vantagens técnicas em relação a modelos animais mais clássicos, como o ratinho. Por exemplo o peixe-zebra possui um ciclo de vida mais curto, gera um elevado número de descendentes, tem o genoma sequenciado, os embriões são transparentes e desenvolvem-se externamente. Além disso, os peixe-zebra adultos também podem ser facilmente visualizados e manipulados experimentalmente e existem mutantes/transgénicos que permitem a análise da expressão de multiplos genes através de microscopia de fluorescência. O objectivo principal deste trabalho é avaliar a capacidade mineralogénica/osteogénica de fracções semi-purificadas e de moléculas purificadas de plantas terrestres, como o cardo ou o eucalipto, e de cianobactérias. A linha celular VSa13 obtida a partir de vértebras de dourada (Sparus aurata), que possui a capacidade de mineralização in vitro, foi usada para analisar o potencial mineralógenico dos extratos usados, e o opérculo do peixe-zebra foi usado para desenvolver e estabelecer um modelo in vivo adequado para analisar os efeitos de moléculas com atividade osteogénica (através do uso do calcitriol). Os nossos resultados demostraram a existência de um efeito mineralogénico moderado usando concentrações não tóxicas de extratos de cardo, de eucalipto e de algumas cianobactérias, enquanto que ácidos triterpénicos purificados a partir de amostras de eucalipto (como por exemplo o ácido betulónico, ursólico e oleanólico) aumentam até 6 vezes a deposição de mineral na matrix extracelular da linha celular VSa13. Os nossos resultados mostraram ainda que in vitro, a cinaropicrina, uma lactona sesquiterpénica abundante nos extratos de cardo, promovia um efeito anti-mineralogénico, o que foi mais tarde comprovado utilizando o nosso modelo in vivo. O efeito de compostos pro-mineralogénicos foi posteriormente analisado através do estudo do opérculo do peixe-zebra e os nossos resultados demonstraram que os extratos lipofílicos do cardo, como o ácido ursólico, o ácido oleanólico e a fracção de acetato de etílo da espécie #13 de cianobactérias, possuem efeitos osteogénicos. Apesar da capacidade osteogénica do ácido ursólico já ter sido analisada e comprovada por outros grupos usando um modelo animal de ratinho, a ação do ácido oleanólico, da cinaropicrina e de extratos de cianobactérias na formação óssea nunca tinha sido descrita. O uso de uma linha de duplos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente sob o controlo dos promotores do osterix/sp7 ou da osteocalcina/oc2 tem sido determinante para tentar perceber os mecanismos responsáveis por esta atividade osteogénica e sendo a mesma abordagem atualmente aplicada ao estudo do efeito dos ácidos triterpenicos. Os dados gerados a partir das ferramentas in vitro e in vivo utilizadas neste trabalho não só demonstraram o potencial de recursos naturais (terrestres ou marinhos) para a descoberta de moléculas com efeito mineralogénico/osteogénico potencialmente relevantes para as indústrias farmacêutica ou alimentar, como também evidenciaram a importância do uso de animais modelos como o peixe-zebra para a análise do efeito destas moléculas

How microplastics and adsorbed pollutants affect zebrafish development?

A presença de microplásticos no ecossistema aquático é, nos dias de hoje, uma realidade extremamente preocupante que acarreta sérios riscos para o meio ambiente e para a saúde pública. A capacidade dos microplásticos de adsorverem poluentes orgânicos, como é o caso do benzo[α]pireno (BaP), levanta preocupações adicionais, pois cria uma nova rota de entrada de compostos tóxicos na cadeia alimentar. No entanto, o conhecimento atual sobre o impacto dos microplásticos, inalterados e/ou contaminados, nos organismos aquáticos é ainda insuficiente e requer estudos adicionais. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretende assim fornecer novos dados sobre os efeitos biológicos dos microplásticos utilizando como modelo o peixe-zebra (Danio rerio). Pequenos teleósteos, como é o caso do peixe-zebra, oferecem vantagens significativas relativamente aos modelos animais clássicos e são atualmente utilizados como organismos de primeira linha para avaliar os riscos ambientais associados aos compostos tóxicos presentes nos meios aquáticos. Estudos toxicológicos requerem o uso de materiais inertes e condições controladas, todavia, nenhum dos sistemas atualmente comercializados é adequado para avaliar o efeito tóxico dos microplásticos. Estes sistemas contêm componentes feitos de polímeros plásticos que podem libertar partículas plásticas micrométricas, lixiviar os constituintes químicos ou adsorver os compostos químicos em estudo. O sistema de aquários autônomo ZEB316 foi desenvolvido no âmbito deste trabalho com o objetivo de suprimir esta necessidade e de facultar uma solução económica e fácil de implementar que permita a realização de estudos toxicológicos de última geração. Este sistema é construído com materiais inertes e resistentes à corrosão e proporciona boas condições de alojamento através de um sistema eficiente de recirculação e filtragem da água. A avaliação dos parâmetros da água e do desempenho do crescimento dos peixes mostrou que o sistema ZEB316 oferece condições de alojamento comparáveis à dos sistemas comercialmente disponíveis. A maioria dos resultados obtidos no âmbito desta dissertação provêm da análise de imagens de microscopia de campo claro e/ou fluorescência. Embora o uso de imagens de microscopia seja comum na maioria dos laboratórios e permita obter uma quantidade considerável de informação, a análise destas imagens é geralmente um processo moroso, em parte devido à falta de ferramentas automáticas/semiautomáticas dedicadas que permitam a sua análise. Nesse sentido, desenvolvemos diversas macros para o software ImageJ, com o objetivo de reduzir o erro associado à análise pelo usuário, aumentando assim a reprodutibilidade dos dados e a padronização das metodologias experimentais. Uma vez que o foco deste trabalho está centrado no estudo da osteotoxicidade, é de salientar o desenvolvimento de um conjunto de macros específicas para esse fim e denominadas ZFBONE. Este conjunto de ferramentas permite aos usuários avaliar, a partir de imagens 2D, parâmetros morfométricos de várias estruturas ósseas (por exemplo, opérculo, raios e escamas da barbatana caudal), mas também a extensão e a intensidade das colorações específicas do osso. Além disso, outras macros foram desenvolvidas para outros fins, por exemplo, para analisar os vários parâmetros morfométricos relativos aos embriões de peixe ou para avaliar cortes histológicos. Uma vez desenvolvidos os meios e técnicas necessários para a execução dos ensaios toxicológicos, e subsequente análise dos resultados, procedeu-se à realização das várias experiências que visam compreender efeito biológico dos microplásticos e contaminates no peixe-zebra. Assim, larvas de peixe-zebra foram produzidas e mantidas no sistema previamente descrito, ZEB316, e expostas cronicamente, durante o seu desenvolvimento, a partículas de polietileno de 20- 27 μm, inalteradas (MP) ou contaminadas com benzo[α]pireno (MP-BaP). Estas partículas foram adicionadas à dieta dos peixes através de uma suplementação a 1% m/m. Apesar de não se ter registado qualquer alteração ao nível dos parâmetros morfológicos aos 30 dias pós-fertilização (dpf), a presença de MP e MP-BaP acabou por ter um efeito negativo no crescimento dos espécimes aos 90 e 360 dpf. A fecundidade relativa, a morfologia do ovo/embrião e a área do vitelo também sofreram um impacto negativo em peixes-zebra alimentados com MP-BaP. No que respeita ao estado geral do esqueleto, os peixes expostos a dietas experimentais contendo MP e MP-BaP sofreram um aumento significativo na incidência de deformações esqueléticas aos 30 dpf quando comparados com peixes alimentados com a dieta controlo, bem como um desenvolvimento anómalo da barbatana caudal e escamas, e uma diminuição da qualidade do osso aos 90 dpf. Um comprometimento da formação óssea intergeracional foi também observado na prole de espécimes expostos a MP ou MP-BaP, que se refletiu numa redução do osso opercular dos descendentes aos 6 dpf. Além de um claro efeito no desenvolvimento ósseo, a análise histológica do intestino revelou ainda um número reduzido de células caliciformes em peixes alimentados com dieta MP-BaP, um claro sinal de inflamação intestinal. Finalmente, a exposição das larvas a MP-BaP levou a um aumento da expressão de genes associados à via de resposta do BaP, ao mesmo tempo que impactou negativamente na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo. Os resultados obtidos indicaram um maior comprometimento do desenvolvimento ósseo no peixe-zebra quando sujeito a uma dieta contendo microplásticos contaminados com BaP (MP-BaP), por comparação com a dieta contendo microplásticos não contaminados (MP). Outros autores demostraram também que a presença de BaP afeta a formação das vértebras e o desenvolvimento generalizado do esqueleto, no entanto os mecanismos envolvidos nestes fenómenos permanecem pouco estudados. Desta forma, realizámos ensaios adicionais in vivo com o objetivo de avaliar os efeitos osteotóxicos do BaP durante o desenvolvimento e regeneração óssea em peixe-zebra. A exposição aguda de larvas de peixe-zebra entre os 3 e os 6 dpf ao BaP levou a uma redução do tamanho do osso opercular e uma diminuição quantitativa de células positivas para osteocalcina, indicando um efeito composto na maturação dos osteoblastos. Por sua vez, quando se trata de uma exposição crônica das larvas de peixe-zebra ao BaP, entre os 3 e os 30 dpf, verificou-se que o desenvolvimento do esqueleto axial é afetado, aumentando a incidência e gravidade das deformações esqueléticas. Em peixes jovens adultos, observou-se ainda que a exposição ao BaP afetou não só a mineralização dos raios da barbatana caudal e escamas recém-formados, como prejudicou também o seu padrão morfológico, fenómenos que têm por base uma remodelação óssea desequilibrada. Relativamente às análises de expressão genética de vários marcadores verificou-se que o BaP induziu a ativação das vias xenobióticas e metabólicas e impactou negativamente na formação e organização da matriz extracelular. Curiosamente, a exposição ao BaP regulou positivamente os marcadores de inflamação nas larvas e aumentou o recrutamento de neutrófilos. Uma interação direta entre neutrófilos e a matriz extracelular óssea, ou células responsáveis pela formação do osso, foi observada in vivo, o que sugere um papel dos neutrófilos nos mecanismos subjacentes à osteotoxicidade do BaP. Globalmente, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que a exposição crónica a microplásticos inalterados e/ou contaminados não prejudica apenas o crescimento dos peixes, mas também o seu desempenho a nível reprodutivo, saúde geral do seu esqueleto, e compromete a descendência por meio de efeitos intergeracionais. Além disso, este trabalho fornece novos dados sobre os principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na osteotoxicidade do BaP e aborda o possível papel dos neutrófilos na redução da resposta óssea inflamatória.The presence of microplastics in the aquatic ecosystem represents a major issue for the environment and human health. The capacity of organic pollutants such as benzo[α]pyrene (BaP) to adsorb onto microplastic particles raises additional concerns, as it creates a new route for toxic compounds to enter the food web. Current knowledge on the impact of pristine and/or contaminated microplastics on aquatic organisms remains insufficient, and this work aims at providing new insights by evaluating their biological effects in zebrafish (Danio rerio). The ZEB316, a standalone housing system built with inert materials, and a comprehensive set of ImageJ semi-automatic tools were first developed and optimized to perform state-of-the-art toxicological studies and obtain meaningful data from morphometric analysis of brightfield/ fluorescence images. Zebrafish larvae were exposed throughout their development to polyethylene microplastics, pristine or spiked with BaP, supplemented in the fish diet. While exposure up to 30 days post-fertilization only increased the incidence of skeletal deformities, long-term exposure to pristine/contaminated microplastics not only jeopardized fish growth, reproduction performance, and skeletal health, but it also caused an intergenerational effect. To further study the mechanisms underlying BaP osteotoxicity, several bone-related in vivo assays were used to evaluate the effects of waterborne exposure to BaP during bone development and regeneration. BaP inhibited osteoblast maturation and ECM mineralization and stimulated osteoclast activity, thus affecting bone remodeling. Transgenic and transcriptomic approaches suggested that besides the activation of xenobiotic and metabolic pathways, which may negatively impact extracellular matrix formation and organization, BaP activates inflammatory mechanisms that recruit neutrophils, which affect both osteoblast and osteoclast activity, possibly through a direct interaction of the neutrophils with the bone matrix. This work provides novel data on the effects of microplastics exposure during zebrafish development, in particular its osteotoxic effects, and gives new insights into the cellular and molecular players involved in BaP osteotoxicity.Marco Tarasco was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) through the PhD grant SFRH/BD/128634/2017 and COVID/BD/151848/2021 and by NEUBIAS-COST STSM program as part of action CA15124. This work was funded by FCT through projects UID/Multi/04326/2019, UID/00350/2020, UIDB/04326/2020, UID/MAR/00350/2013 and from the operational programs MAR2020 and COMPETE 2020 through projects OSTEOMAR MAR-02.01.01-FEAMP-0057 and EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121

Delayed Rejection Variational Monte Carlo

A new acceleration algorithm to address the problem of multiple time scales in variational Monte Carlo simulations is presented. Core electrons usually require smaller time steps than valence electrons. After a first attempted move has been rejected, the delayed rejection algorithm attempts a second move with a smaller time step, so moves of both valence and core electrons can be accepted. Results on Be and Ne atoms as test cases are presented. Correlation time and both average accepted displacement and acceptance ratio as a function of the distance from the nucleus evidence the efficiency of the proposed algorithm in dealing with the multiple time scales problem.

An investigation of nodal structures and the construction of trial wave functions

The factors influencing the quality of the nodal surfaces, namely, the atomic basis set, the single-particle orbitals, and the configurations included in the wave-function expansion, are examined for a few atomic and molecular systems. The following empirical rules are found: the atomic basis set must be fairly large, complete active space and natural orbitals are usually better than Hartree-Fock orbitals, multiconfiguration expansions perform better than single-determinant wave functions, but only few configurations are effective and their choice is suggested by symmetry considerations, while too long determinantal expansions spoil the nodal surfaces. These rules allow us to reduce the nodal error and to compute the best fixed node-diffusion Monte Carlo energies for a series of dimers of first-row atoms

Delayed Rejection Variational Monte Carlo

A new acceleration algorithm to address the problem of multiple time scales in variational Monte Carlo simulations is presented. After a first attempted move has been rejected, the delayed rejection algorithm attempts a second move with a smaller time step, so that even moves of the core electrons can be accepted. Results on Be and Ne atoms as test cases are presented. Correlation time and both average accepted displacement and acceptance ratio as a function of the distance from the nucleus evidence the efficiency of the proposed algorithm in dealing with the multiple time scales problem.Comment: To be published on the Journal of Chemical Physic

Natural enemies emerged from Thaumetopoea pityocampa (Denis & Sciffermüller) (Lepidoptera Notodontidae) pupae in Southern Italy.

Observation made over a 4-year period in pinewoods of Apulia Region (South Italy) on Thaumetopoea pityocampa (Denis Sciffermüller) (Lepidoptera: Notodontidae) prepupae and pupae, indicated the following natural enemies complex: Hexamermis sp. (Nematoda: Mermithidae), Phryxe caudata (Diptera: Tachinidae), Villa brunnea and Hemipenthes velutina (Diptera: Bombyliidae), Conomorium pityocampae (Hymenoptera: Pteromalidae), Coelichneumon rudis and Cryptus sp. (Hymenoptera: Ichneumonidae), Beauveria bassiana and Isaria farinosa (formerly Paecylomices farinosus) (Ascomycota: Hypocreales). The moths and the parasitoid species emerged sequentially and, although these natural enemies show irregular distribution, they together controlled up to 60% of T. pityocampa pupae. Ecological implications of such parasitism are being discussed

Success factors for the positioning and product design concerning the destination marketing of French oversea islands in competition with regional premium destinations based on the example of La Réunion.

Eine Destination bietet eine Vielzahl von touristischen Einrichtungen wie Beher-bergungen, Restaurants oder Freizeitangebote. In dieser Arbeit wird der Fokus auf das Destinationsmarketing französischer Überseegebiete gelegt, bzw. am Beispiel La Réunion spezifiziert. Ziel dieser Arbeit ist es, mit der Optimierung der Produktpolitik von La Réunion, einen Grundstein für den Marketing-Mix von französischen Überseegebieten zu legen