Functional and evolutionary analysis of DXL1, a non-essential gene encoding a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase like protein in Arabidopsis thaliana

The synthesis of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP), catalyzed by the enzyme DXP synthase (DXS), represents a key regulatory step of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis. In plants DXS is encoded by small multigene families that can be classified into, at least, three specialized subfamilies. Arabidopsis thaliana contains three genes encoding proteins with similarity to DXS, including the well-known DXS1/CLA1 gene, which clusters within subfamily I. The remaining proteins, initially named DXS2 and DXS3, have not yet been characterized. Here we report the expression and functional analysis of A. thaliana DXS2. Unexpectedly, the expression of DXS2 failed to rescue Escherichia coli and A. thaliana mutants defective in DXS activity. Coherently, we found that DXS activity was negligible in vitro, being renamed as DXL1 following recent nomenclature recommendation. DXL1 is targeted to plastids as DXS1, but shows a distinct expression pattern. The phenotypic analysis of a DXL1 defective mutant revealed that the function of the encoded protein is not essential for growth and development. Evolutionary analyses indicated that DXL1 emerged from DXS1 through a recent duplication apparently specific of the Brassicaceae lineage. Divergent selective constraints would have affected a significant fraction of sites after diversification of the paralogues. Furthermore, amino acids subjected to divergent selection and likely critical for functional divergence through the acquisition of a novel, although not yet known, biochemical function, were identified. Our results provide with the first evidences of functional specialization at both the regulatory and biochemical level within the plant DXS family

Caracterització bioinformàtica de la contribució de l' "splicing" alternatiu a la variabilitat del proteoma

[cat] Els darrers anys, l'splicing alternatiu ha pres un gran protagonisme pel seu rol en la generació de variabilitat proteica i la seva relació amb diverses malalties. A nivell d'àcids nucleics, l'splicing alternatiu es pot donar per diverses vies, resultant en canvis a nivell proteic entre les isoformes, que provoquen variacions estructurals i funcionals. La bioinformàtica ha participat en l'estudi de l'splicing alternatiu a tots aquests nivells. Així, ha estat utilitzada com una eina de suport en projectes de seqüenciació genòmica i de microarrays. Per altra banda, també s'ha utilitzat per estudiar la complexitat del proteoma i l'impacte estructural i funcional de l'splicing alternatiu. La present tesi es basa en l'estudi dels efectes estructurals i funcionals causats en les proteïnes per l'splicing alternatiu. Així, hem analitzat el rol de l'splicing alternatiu com a font de variabilitat proteica, n'hem estudiat la conservació interespecífica dels efectes, ens hem centrat en una família funcional de proteïnes per analitzar-ne les variants d'splicing i hem cercat un protocol per a la identificació d'esdeveniments d'splicing alternatiu equivalents. En primer lloc, hem analitzat la relació entre l'splicing alternatiu i la duplicació gènica -ambdós estan implicats en la diversificació del proteoma. Darrerament, s'ha trobat una anticorrelació entre la presència de variants d'splicing i duplicats i s'han descobert exemples de possible intercanviabilitat funcional entre els dos fenòmens. Per això, ens hem decidit a comparar les dues fonts de variabilitat proteica, des dels punts de vista genòmic i proteòmic. Paradoxalment, hem vist que la presència d'splicing alternatiu i duplicació gènica estan inversament relacionades, però descartant la hipòtesi d'intercanviabilitat funcional perquè els gens amb splicing alternatiu i amb duplicats tenen distribucions funcionals similars i els efectes proteics que provoquen els dos fenòmens són molt diferents. Per això, nosaltres proposem fixar-nos en l'escenari evolutiu i l'equilibri de la dosi gènica com a paràmetres essencials per explicar l'anticorrelació. Posteriorment, hem analitzat la conservació evolutiva dels efectes de l'splicing alternatiu sobre la modulació funcional. Així, hem caracteritzat els efectes del fenòmen sobre les proteïnes en quatre espècies diferents i hem comparat esdeveniments equivalents o homòlegs. Els nostres resultats mostren que hi ha una gran conservació evolutiva pel que fa a la manera que l'splicing alternatiu modula la funció proteica. Per tant, sembla que les diferències de complexitat entre els organismes no estan causades per un ús diferencial dels mecanismes de l'splicing alternatiu a l'hora de modificar la funció de les proteïnes, sinó que haurem de parar esment a altres possibilitats. Per acabar l'estudi dels efectes de l'splicing alternatiu sobre la variabilitat, ens hem centrat en els factors de transcripció, en què l'splicing alternatiu genera isoformes amb diferent funcionalitat. En el nostre treball, ens hem interessat pel mecanisme per generar diverses isoformes reguladores de la transcripció i la seva conservació. Així, veiem que l'splicing alternatiu modifica uns dominis més sovint que uns altres, però ho fa d'una manera poc precisa, afectant fragments de dominis i regions properes. A més, la conservació estructural i funcional dels efectes de l'splicing alternatiu és molt alta. Finalment, hem decidit proposar un mètode per a la cerca d'esdeveniments homòlegs d'splicing alternatiu amb l'objectiu d'ajudar en els camps de la biomedicina i la farmacogenòmica. El mètode treballa a partir d'un esdeveniment d'splicing alternatiu i, a partir d'aquí, intenta trobar altres esdeveniments que siguin homòlegs o equivalents. Observant les figures de mèrit dels tests que hem realitzat, creiem que el mètode funciona amb una bona fiabilitat, fet que ens porta a pensar que pot ajudar en l'anotació funcional de les isoformes i en l'elecció de models animals adequats

The (In)dependence of Alternative Splicing and Gene Duplication.

Alternative splicing (AS) and gene duplication (GD) both are processes that diversify the protein repertoire. Recent examples have shown that sequence changes introduced by AS may be comparable to those introduced by GD. In addition, the two processes are inversely correlated at the genomic scale: large gene families are depleted in splice variants and vice versa. All together, these data strongly suggest that both phenomena result in interchangeability between their effects. Here, we tested the extent to which this applies with respect to various protein characteristics. The amounts of AS and GD per gene are anticorrelated even when accounting for different gene functions or degrees of sequence divergence. In contrast, the two processes appear to be independent in their influence on variation in mRNA expression. Further, we conducted a detailed comparison of the effect of sequence changes in both alternative splice variants and gene duplicates on protein structure, in particular the size, location, and types of sequence substitutions and insertions/deletions. We find that, in general, alternative splicing affects protein sequence and structure in a more drastic way than gene duplication and subsequent divergence. Our results reveal an interesting paradox between the anticorrelation of AS and GD at the genomic level, and their impact at the protein level, which shows little or no equivalence in terms of effects on protein sequence, structure, and function. We discuss possible explanations that relate to the order of appearance of AS and GD in a gene family, and to the selection pressure imposed by the environment

Functional and evolutionary analysis of DXL1, a non-essential gene encoding a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase like protein in Arabidopsis thaliana

The synthesis of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP), catalyzed by the enzyme DXP synthase (DXS), represents a key regulatory step of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis. In plants DXS is encoded by small multigene families that can be classified into, at least, three specialized subfamilies. Arabidopsis thaliana contains three genes encoding proteins with similarity to DXS, including the well-known DXS1/CLA1 gene, which clusters within subfamily I. The remaining proteins, initially named DXS2 and DXS3, have not yet been characterized. Here we report the expression and functional analysis of A. thaliana DXS2. Unexpectedly, the expression of DXS2 failed to rescue Escherichia coli and A. thaliana mutants defective in DXS activity. Coherently, we found that DXS activity was negligible in vitro, being renamed as DXL1 following recent nomenclature recommendation. DXL1 is targeted to plastids as DXS1, but shows a distinct expression pattern. The phenotypic analysis of a DXL1 defective mutant revealed that the function of the encoded protein is not essential for growth and development. Evolutionary analyses indicated that DXL1 emerged from DXS1 through a recent duplication apparently specific of the Brassicaceae lineage. Divergent selective constraints would have affected a significant fraction of sites after diversification of the paralogues. Furthermore, amino acids subjected to divergent selection and likely critical for functional divergence through the acquisition of a novel, although not yet known, biochemical function, were identified. Our results provide with the first evidences of functional specialization at both the regulatory and biochemical level within the plant DXS family