An improved protocol for small RNA library construction using High Definition adapters

Next generation sequencing of small RNA (sRNA) libraries is widely used for studying sRNAs in various biological systems. However, cDNA libraries of sRNAs are biased for molecules that are ligated to adapters more or less efficiently than other molecules. One approach to reduce this ligation bias is to use a pool of adapters instead of a single adapter sequence, which allows many sRNAs to be ligated efficiently. We previously developed High Definition (HD) adapters for the Illumina sequencing platform, which contain degenerate nucleotides at the ligating ends of the adapters. However, the current commercial kits produced a large amount of 5’ adapter – 3’ adapter ligation product without the cDNA insert when HD adapters were used to replace the kit adapters. Here, we report a protocol to generate sRNA libraries using HD adapters with dramatically reduced adapter-adapter product. This protocol was developed from the procedure invented by Vaidyanathan et al. The libraries can be completed within two days and can be used for various biological and clinical samples. As examples for using this protocol, we constructed sRNA libraries using total RNA extracted from cultured mammalian cells and plant leaf tissue. The PCR products contained a very small amount of adapter-adapter product. Bioinformatic analysis of the sequencing data revealed sRNAs with diverse sequences and many different miRNA families

A hőmérséklet hatása a növényi RNS interferencia hatékonyságára = The effect of temperature on RNA interference in higher plants

A hőmérséklet hatása a növényi RNS interferencia hatékonyságára Programunk célja a növényi RNS interferencia (RNAi) rendszer hőmérsékletfüggésének vizsgálata volt. Igazoltuk, hogy a növényi RNAi rendszer egyes útvonalai erősen hőmérsékletfüggőek, így pl. a transzgén-, illetve vírus-indukálta RNAi válaszok alacsony hőmérsékleten alig működnek, míg normál hőmérsékleten ezek a rendszerek igen aktívak. Kimutattuk, hogy a transzgénekről, illetve vírusokról származó, az RNAi rendszer által generált rövid RNS-ek (siRNS-ek) szintje a hőmérséklet emelésével gyorsan nő. Ismert, hogy a növény-vírus kapcsolatok jelentős részében a tünetek alacsony hőmérsékleten erősek, míg magas hőmérsékleten gyengék. Igazoltuk, hogy ennek oka az, hogy a vírus-indukálta RNAi rendszer -a növények leghatékonyabb antivirális rendszere- hidegben alig működik, így a tünetek felerősödnek, a víruskártétel jelentős. Ugyanakkor melegben a hatékony RNAi rendszer tünetcsökkenéshez, vírusellenállósághoz vezet. A transzgénikus növények jelentős részénél a transzgénikus fenotípus a transzgén-indukálta RNAi rendszeren alapszik. Bizonyítottuk, hogy alacsony hőmérsékleten a transzgén-indukálta RNAi rendszeren alapuló transzgénikus fenotípusok, pl antiszensz gátlás, vírusellenállóság, elveszhetnek. Kimutattuk azt is, hogy megfelelő transzgén konstrukciók (fordított ismétlődést tartalmazó konstrukciók) használatával ez a veszély csökkenthető, azaz a transzgénikus fenotípusok alacsony hőmérsékleten is stabilak maradnak. | The effect of temperature on RNA interference in higher plants The aim of our project was to study the effect of temperature on efficiency of RNA interference (RNAi) system of higher plants. We have shown that certain plant RNAi pathways, as transgene- or virus- induced RNAi pathways are inhibited at low temperature, while these patways work efficiently at normal temperature. Indeed, the levels of RNAi generated transgene or virus derived short RNAs (siRNAs) are dramatically reduced at low temperature. Previously, it has been reported that in cold, viral infections of plants lead to strong symptoms and that outbreaks of viral diseases are frequent. By contrast, at high temperature the symptoms are masked, plants recover quickly. We show that viral symptoms are strong in cold because virus induced plant RNAi (the most important antiviral sytem of plants) is inefficient, whereas at high temperature the efficient RNAi can protect plants. Transgenic phenotypes of many transgenic plants are depend on transgene induced RNAi. We have demonstrated that in cold, transgenic phenotypes -as antisense inactivation or virus resistance- that depend on trangene induced RNAi are dramatically weakened. Importantly, if inverted repeat containing constructs are used, trangenic phenotypes are stable even at low temperature

Poszt-transzkripcionális géncsendesítés és szupresszió molekuláris mechanizmusának feltárása növényekben = Unraveling the mechanism of Post-transcriptional gene silencing and suppression in plants

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik, és magába foglalja az állati RNS interferencia és a növényi poszt-ranszkripcionális géncsendesítés (PTGS) jelenségét. A növényekben a PTGS mint antivirális mechanizmus is működik. Kutatásaink folyamán feltártuk, hogy a vírus RNS erős másodlagos szerkezettel bíró részei aktiválják a PTGS alapú antivirális mechanizmust oly módon, hogy a DICER nevezetű RNAse III típusú enzim kis 21-26 nukleotid hosszú RNS molekulákká, ún. siRNS-ekké darabolják a másodlagos szerkezettel bíró vírus RNS szakaszokat. A vírus fertőzte növényekben felhalmozódó siRNS-ek beépülnek a PTGS másik effector komplexebe a RISC-be amely vírus specfikus siRNS-ek miatt specifikusan gátolja a vírus RNS kifejeződését. Igazoltuk, hogy ez a gátlás a vírus genom specifikus vágásával megy végbe. A vírusok az evolúció során silencing szupresszor fehérjék termelésével válaszoltak a növények antivirális reakciójára. Laboratóriumunkban a világon először sikerült feltárnunk egy ilyen silencing szupresszor fehérje (Cymbidium ringspot vírus kódolta p19 fehérje) kristályszerkezetét és molekuláris működését. Megállapítottuk, hogy a p19 szupresszor fehérje a siRNS-ek megkötésével gátolja az antivirális RISC felépülését, így a PTGS alapú antivirális választ. Igazoltuk továbbá, hogy ez a molekuláris mechanizmus altalánosan elterjedt a növényi vírus kódolta silencing szupresszor fehérjék működésében. | RNA silencing is conserved in a broad range of eukaryotes and includes the phenomena of RNA interference in animals and posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants. In higher plants, PTGS acts as an antiviral system, and we have explored that antiviral PTGS is induced by viral dsRNAs or structured single-stranded RNAs (ssRNAs) that are processed into small interfering RNAs (siRNAs) by RNase III-like enzymes such as DICER. These virus specific siRNAs than guide the sequences pecific degradation of target viral RNAs by the RNA-induced silencing complex (RISC). We also showed that antiviral RISC, which programmed by the virus specific siRNAs mediates the cleavage of a target viral RNA when there is perfect or nearly perfect base pairing between the target. To counteract an antiviral RNA silencing response, plant viruses evolved and express silencing suppressor proteins. At the first time we explored the structure and molecular bases of a silencing suppressor protein. We have shown that the 19 kDa protein (p19) of Cymbidium ringspot virus is a systemic silencing suppressor that prevents the assembly of antiviral RISC complexis by binding and sequestering of siRNAs, thus inhibiting the PTGS based antiviral response. Moreover we also confirmed that sequestering of siRNA is a common strategy of silencing suppressor proteins, encoded by plant viruses

Növényvírusok replikációjában, a tünet kialakulásában és a növény védekezési rendszerében szerepet játszó gazdagének azonosítása és vizsgálata = Identification and analyses of altered patterns of gene expression in compatible host elicited by plant virus infection

Az poszt-transzkripcionális gén csendesítés (PTGS) egy hatékony antivirális védekezési rendszer növényekben. Adataink azt mutatták, hogy amíg a vad típusú vírus (CymRSV) az egész növényt megfertőzi addig a p19 (a vírus PTGS szuppresszor fehérjéje) deficiens vírus felhalmozódása csak az erekre és azok környékére korlátozódik. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a p19 képes megakadályozni a PTGS mobil szignál által kiváltott aktiválódását a fertőzési front előtt, előidézve a növény általános fertőzöttségét. Továbbiakban, azonosítottuk a PTGS alapvető szerepét a DI RNS mediálta tünet csökkentésben. Adataink megmutatták a PTGS asszociált 21nt siRNS-sek szerepét a szisztemikus szignalizációs eseményekben. Azonosítottuk a DI RNS-ek 5' végi szakaszát mint a tünet módosításban szerepet játszó legfontosabb régiót. Létrehoztunk egy Arabidopsis protoplaszton alapuló szinkronizált infekciós rendszert és azonosítottunk egy endogén gént, amely teljes "shut off"-t mutat vírus fertőzött növényben. Módisított LNA oligonukleotidok felhasználásával létrehoztunk egy olyan érzékeny kis RNS detektálási rendszert, amely lehetővé teszi a vírus ertőzésben szerepet játszó miRNS-ek kimutatását mind northern blot analízissel mind in situ hibridizációval. | In plants post-transcriptional gene silencing (PTGS) is an ancient and effective defense mechanism against virus infection. We showed that in contrast to the uniform accumulation of CymRSV throughout systemically infected leaves, the presence of p19 (PTGS suppressor of the virus) deficient virus was confined to and around the vascular bundles. These results suggest that the role of p19 is to prevent the onset of mobile signal induced systemic PTGS ahead the virus infection front leading to generalized infection. We also showed that the activation of PTGS plays a pivotal role in DI RNA-mediated interference. Our data identified the pivotal role of 21 nt siRNAs in PTGS signaling. In addition we identified a 5' proximal sequence element of DI RNAs as the most important symptom determinant region. We established a Arabidopsis protoplast based synchronized infection system and identified an endogenous gene showing complete shut off in virus infected plants. Moreover, we enhanced the sensitivity of detecting mature microRNAs by LNA modified oligonucleotides probes, which may open the way of northern blot and in situ detection of miRNAs playing important in symptom development

Az RNS silencing szerepe, mechanizmusa a vírus gazda kölcsönhatásban = The role and the mechanism of RNA silencing in the plant virus interplay

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik. Kutatásaink során feltártuk a Cymbidium ringspot vírus genomról kéződő small interferáló (si) RNS eredetét nagy hatékonyságú 454 (Life Science) és Soplexa (illumina) szekvenaló rendszerek alkalmazásával. A vírus genomról származó kis RNS-eket rátérképeztük a vírus genomjára, amely alapján "forró pontokat" tudtunk azonosítani. Igazoltuk,hogy virus siRNS-ek túlnyomó töbsége a virus pozitív száláról származik, és 21-22 nukleotid (nt) hosszú. Megállapítottuk, hogy vírus siRNS-ekkel töltött RISC (RNA Induced Silencing Complex) komplexek szekvenciaspecifikusan hasítják a vírus genomot. Számos silencing szupresszor fehérje (p19, HC-Pro, és p122) részletes analízisével igazoltuk, hogy a növény antivirális válaszát, a vírus kódolta silencing szupresszorok hatékonyan gátolják. Bizonyítottuk, hogy a siRNS-ek specifikus kötése és inaktiválása a legelterjedtebb stratégia a silencing szupresszor fehérjék között. Feltártuk, hogy a silencing szuppresszor fehérjék egy jelentős csoportja gátolja növények endogén siRNS és miRNS biogenezisét. A silencing szupressor feherjék interakciója az endogen silencing útvonalakkal feltehetően a magyarázata a vírus okozta tünetek kialakulásának, hiszen a szupresszor fehérjék súlyosan zavarja növény egyedfejlődését. | RNA silencing is a gene inactivation mechanism, which is conserved in a broad range of eukaryotes. The central players in RNA-mediated gene silencing are the small 21-24 nucleotide long RNA molecules engaged in sequence-specific interactions to inhibit gene expression. RNA silencing fulfils fundamental regulatory roles, as well as antiviral functions. We profiled viral siRNAs using two different high-throughput sequencing platforms. Both deep sequencing techniques revealed a strong bias in viral siRNAs for the positive strand of the virus and identified regions on the viral genome that produced viral siRNA in much higher abundance than other regions. We also analysed the viral RNA targeting by virus induced gene silencing in tombusvirus infected plants, and we show evidence that antiviral response is based on viral RNA cleavage by RNA-induced silencing effector complex (RISC) programmed by virus-specific siRNAs.. To counteract RNA silencing, viruses express silencing suppressors that interfere with both siRNA- and microRNA-guided silencing pathways. We used comparative approaches to analyse the molecular mechanism of suppression by three well-studied silencing suppressors. We found that silencing suppressors p19, p21 and HC-Pro each inhibit the RISC assembly. We demonstrated that these suppressors are able to interact with the endogenous silencing pathways suggesting that these interactions have an important role in the development of virus-induced symptoms

Small RNA Profile in Moso Bamboo Root and Leaf Obtained by High Definition Adapters

Moso bamboo (Phyllostachy heterocycla cv. pubescens L.) is an economically important fast-growing tree. In order to gain better understanding of gene expression regulation in this important species we used next generation sequencing to profile small RNAs in leaf and roots of young seedlings. Since standard kits to produce cDNA of small RNAs are biased for certain small RNAs, we used High Definition adapters that reduce ligation bias. We identified and experimentally validated five new microRNAs and a few other small non-coding RNAs that were not microRNAs. The biological implication of microRNA expression levels and targets of microRNAs are discussed

Small RNA analysis in Sindbis virus infected human HEK293 cells

In contrast to the defence mechanism of RNA interference (RNAi) in plants and invertebrates, its role in the innate response to virus infection of mammals is a matter of debate. Since RNAi has a well-established role in controlling infection of the alphavirus Sindbis virus (SINV) in insects, we have used this virus to investigate the role of RNAi in SINV infection of human cells

Distinct Effects of p19 RNA Silencing Suppressor on Small RNA Mediated Pathways in Plants

RNA silencing is one of the main defense mechanisms employed by plants to fight viruses. In change, viruses have evolved silencing suppressor proteins to neutralize antiviral silencing. Since the endogenous and antiviral functions of RNA silencing pathway rely on common components, it was suggested that viral suppressors interfere with endogenous silencing pathway contributing to viral symptom development. In this work, we aimed to understand the effects of the tombusviral p19 suppressor on endogenous and antiviral silencing during genuine virus infection. We showed that ectopically expressed p19 sequesters endogenous small RNAs (sRNAs) in the absence, but not in the presence of virus infection. Our presented data question the generalized model in which the sequestration of endogenous sRNAs by the viral suppressor contributes to the viral symptom development. We further showed that p19 preferentially binds the perfectly paired ds-viral small interfering RNAs (vsiRNAs) but does not select based on their sequence or the type of the 5’ nucleotide. Finally, co-immunoprecipitation of sRNAs with AGO1 or AGO2 from virus-infected plants revealed that p19 specifically impairs vsiRNA loading into AGO1 but not AGO2. Our findings, coupled with the fact that p19-expressing wild type Cymbidium ringspot virus (CymRSV) overcomes the Nicotiana benthamiana silencing based defense killing the host, suggest that AGO1 is the main effector of antiviral silencing in this host-virus combination

Ambient temperature regulates the expression of a small set of sRNAs influencing plant development through NF‐YA2 and YUC2

Plants substantially alter their developmental program upon changes in the ambient temperature. The 21–24 nt small RNAs (sRNAs) are important gene expression regulators, which play a major role in development and adaptation. However, little is known about how the different sRNA classes respond to changes in the ambient temperature. We profiled the sRNA populations in four different tissues of Arabidopsis thaliana plants grown at 15, 21 and 27 °C. We found that only a small fraction (0.6%) of the sRNA loci are ambient temperature‐controlled. We identified thermoresponsive miRNAs and identified their target genes using degradome libraries. We verified that the target of the thermoregulated miR169, NF‐YA2, is also ambient temperature‐regulated. NF‐YA2, as the component of the conserved transcriptional regulator NF‐Y complex, binds the promoter of the flowering time regulator FT and the auxin biosynthesis gene YUC2. Other differentially expressed loci include thermoresponsive phased siRNA loci that target various auxin pathway genes and tRNA fragments. Furthermore, a temperature dependent 24‐nt heterochromatic siRNA locus in the promoter of YUC2 may contribute to the epigenetic regulation of auxin homeostasis. This holistic approach facilitated a better understanding of the role of different sRNA classes in ambient temperature adaptation of plants

Genome-Wide Identification of RNA Silencing-Related Genes and Their Expressional Analysis in Response to Heat Stress in Barley (Hordeum vulgare L.)

Barley (Hordeum vulgare L.) is an economically important crop cultivated in temperate climates all over the world. Adverse environmental factors negatively affect its survival and productivity. RNA silencing is a conserved pathway involved in the regulation of growth, development and stress responses. The key components of RNA silencing are the Dicer-like proteins (DCLs), Argonautes (AGOs) and RNA-dependent RNA polymerases (RDRs). Despite its economic importance, there is no available comprehensive report on barley RNA silencing machinery and its regulation. In this study, we in silico identified five DCL (HvDCL), eleven AGO (HvAGO) and seven RDR (HvRDR) genes in the barley genome. Genomic localization, phylogenetic analysis, domain organization and functional/catalytic motif identification were also performed. To understand the regulation of RNA silencing, we experimentally analysed the transcriptional changes in response to moderate, persistent or gradient heat stress treatments: transcriptional accumulation of siRNA- but not miRNA-based silencing factor was consistently detected. These results suggest that RNA silencing is dynamically regulated and may be involved in the coordination of development and environmental adaptation in barley. In summary, our work provides information about barley RNA silencing components and will be a ground for the selection of candidate factors and in-depth functional/mechanistic analyses