Functional characterization and evaluation of the therapeutic potential of polo-like kinase 2 in cardiac fibroblasts and fibrosis

Atrial fibrillation (AF) is the most common and relevant arrhythmia in the clinical routine. AF is predicted to affect 6–12 million patients in the USA by 2050 and 18 million patients in Europe by 2060. Cardiac fibrosis and inflammation decisively determine the course of the disease and the clinical outcome of the patients. Despite the tremendous impact on human health, detailed understanding on the molecular mechanisms that contribute to fibrosis in AF is limited. This study provides further evidence for the current paradigm shift that atrial fibrillation is more of a systemic-inflammatory disease than a mere ion-channel dysfunction. The aim of this study was to investigate the role of polo-like kinase 2 (PLK2) and the pro-inflammatory cytokine osteopontin (OPN) with respect to fibroblast (dys)function and fibrosis formation in order to derive novel targets for targeted, fibroblast-specific pharmacotherapy. All patients who participated in this study gave their written informed consent in accordance to the declaration of Helsinki. The study was approved by the local bioethics committee (Ethikkommission an der Technischen Universität Dresden). Human fibroblasts were isolated by outgrowth culture from right atrial biopsies of patients suffering from sinus rhythm (SR) and AF. Murine fibroblasts were isolated by whole-heart Langendorff-perfusion. Quantitative PCR and western blot were used to detect PLK2 transcript expression and protein abundance, respectively. Functional assessment of cardiac function was done with transthoracic echocardiography and surface ECG recordings. Cell culture experiments were performed to evaluate the effects on functional fibroblast properties such as proliferation and differentiation after changing PLK2 activity by genetic knockout (KO) or pharmacological inhibition. A mass spectrometry based secretome analysis was performed by our collaborating laboratory of Prof. Manuel Mayr at King’s College London. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done to measure OPN in the peripheral blood of patients in SR and with permanent AF. Right atrial appendage tissue and fibroblasts from AF patients displayed significantly lower expression of PLK2 mRNA and protein due to increased DNA-methylation of the PLK2 promotor when compared to sinus rhythm (SR) control patient atria or fibroblasts. This methylation was induced in cardiac fibroblasts by chronic hypoxia (1% O2) exposure for 96 h. Pharmacological inhibition as well as global KO of PLK2 in cardiac fibroblasts resulted in elevated myofibroblast differentiation and reduced fibroblast proliferation. PLK2 KO mice displayed vast interstitial fibrosis areas as observed from histological cross sections stained either with Sirius red or with Masson’s trichrome staining. Transthoracic echocardiography revealed systolic and diastolic dysfunction in PLK2 KO mice and AF-typical ECG alterations such as prolonged PQ interval and QRS duration. Mass spectrometry proteomics revealed de novo expression of OPN in the PLK2-KO-fibroblast secretome. Furthermore, we found higher OPN plasma levels in AF patients correlated with electrophysiologically determined fibrosis compared to non-fibrosis control patients. Finally, we identified that the p42/44 MAPK signal transduction cascade is linking to reduced PLK2 expression and enhanced OPN release. Specifically, we found that KO of PLK2 increase p42 MAPK phosphorylation which is known to stimulate OPN transcription. Thus inhibition of p42/44 MAPK resulted in diminished OPN expression. In a dermal fibrosis model the administration of Mesalazine in vitro resulted in reduced p42 MAPK and SMAD2/3 phosphorylation and thereby reduced OPN and αSMA expression. To explore the general validity and relevance of the PLK2 signaling pathway for fibrosis, a dermal model of radiation-induced fibrosis was used. This approach a) confirmed the observations that were made in the heart and b) showed that the use of Mesalazine in vitro led to a reduced p42 MAPK and SMAD2 / 3 phosphorylation and thus to a significantly reduced OPN and αSMA expression. Fibroblasts from patients with permanent AF express less PLK2 than cells from SR control patients. The loss of physiological PLK2 activity coincides with marked changes in the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts. These changes favor fibrosis in the atrial tissues, which is further enhanced by the local and systemic increase of OPN. The present study identifies PLK2 as a novel regulator of cardiac fibroblast function and fibrosis. Restoration of the physiological methylation status of the PLK2 promoter or the inhibition of OPN with Mesalazine could be of particular clinical interest. The tangible clinical and pharmacological feasibility will be subject of future investigations.Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste und bedeutsamste Arrhythmie in der täglichen klinischen Praxis. VHF wird bis 2050 voraussichtlich 6 -12 Millionen Menschen in den USA und bis 2060 zirka 18 Millionen Menschen in Europa betreffen. Fibrose und Entzündungsprozesse bestimmen entscheidend den Krankheitsverlauf und das klinische Outcome der Patienten. Trotz dieser großen Relevanz sind detaillierte Informationen zu den beteiligten molekularen Pathomechanismen weitgehend unklar. Diese Studie liefert weitere Evidenz für den aktuellen Paradigmenwechsel, dass Vorhofflimmern eher eine systemisch-entzündliche Erkrankung als eine bloße Ionenkanaldysfunktion ist. Ziel dieser Arbeit war es die Rolle der polo-like Kinase 2 (PLK2) und des proinflammatorischen Zytokins Osteopontin (OPN) im Hinblick auf Fibroblasten(dys)funktion und Fibroseentstehung zu untersuchen, um neuartige Angriffspunkte für zielgerichtete, Fibroblasten-spezifische Pharmakotherapie abzuleiten. Alle Patienten wurden über die Teilnahme an der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die vorliegende Studie ist konform mit der Deklaration von Helsinki und enthaltene Tierversuche erhielten ein positives Votum der lokalen Tierschutzbehörde. Humane Vorhoffibroblasten wurden mit der „Outgrowth“-Methode aus Gewebeproben von Patienten im Sinusrhythmus (SR) und im permanenten Vorhofflimmern isoliert. Murine Herzfibroblasten wurden aus dem Überstand nach Langendorff-Perfusion durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen. Zur Detektion von PLK2 und anderen Markerproteinen wurden (quantitative) PCRs und Western Blots durchgeführt. Zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo, wurde transthorakale Echokardiografie mit Oberflächen-EKG-Ableitung genutzt. Nachfolgende Zellkulturexperimente beleuchteten die Auswirkungen pharmakologischer PLK2 Inhibition oder genetischen Knock-Outs auf Fibroblasten im Hinblick auf Proliferation, Differenzierung, Seneszenzentwicklung und Sekretion. Eine Massenspektrometrie-basierte Untersuchung des Sekretoms PLK2-defizienter Fibroblasten wurde im Labor unseres Kollaborationspartners Prof. Manuel Mayr am King’s College London durchgeführt. OPN im peripheren Blut von Vorhofflimmerpatienten wurde mittels eines ELISAs gemessen. Ob die betreffenden Patienten Fibrose der Vorhöfe aufwiesen oder nicht, wurde in klinisch-elektrophysiologischen Untersuchungen, dem sogenannten Mapping, bestimmt. Im Vergleich zu SR-Kontrollen, war die PLK2 mRNA- beziehungsweise Protein-Expression in isolierten Fibroblasten und auf Gewebeebene in VHF-Proben signifikant erniedrigt. Dies korrelierte mit PLK2-Promotermethylierung in der Hälfte der VHF-Proben. In SR-Kontrollen konnten wir keine Methylierung des PLK2 Promoters nachweisen. Die Herunterregulation der PLK2 mRNA-Expression bzw. die Induktion der Promotermethylierung konnten in humanen kardialen Fibroblasten durch Exposition gegenüber chronischer Hypoxie (1% O2) experimentell herbeigeführt werden. Pharmakologische Inhibition und der genetische Knockout (KO) von PLK2 gingen in vitro mit erniedrigter Proliferation aber gesteigerter Differenzierung in Myofibroblasten einher. PLK2-KO-Mäuse entwickelten im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Geschwistertieren ausgeprägte Areale interstitieller ventrikulärer Fibrose. Dies spiegelte sich in einer ausgeprägten systolischen und Diastolischen Funktionsstörung des Herzens bei 4 Monate-alten PLK2 KO Tieren wider. Die Sekretomanalyse deckte eine de novo Sekretion von OPN in PLK2-KO-Fibroblasten auf. Im Einklang mit diesem Ergebnis konnten wir höhere OPN-Plasmaspiegel auch bei VHF-Patienten messen, die mit dem Vorhandensein von elektrophysiologisch bestimmten Fibrosearealen korrelierte. Abschließend konnte der p42/44-MAPK-Signalweg als Bindeglied zwischen erniedrigter PLK2-Expression und erhöhter OPN-Freisetzung identifiziert werden. Verminderte PLK2 Expression beziehungsweise Aktivität gehen mit einer gesteigerten Proteinexpression und Phosphorylierung von p42/44 MAPK einher. P42/44 MAPK wiederum stimuliert dann die OPN-Transkription. Folgerichtig führte die Inhibition von p42/44 MAPK zu einer signifikant verminderten OPN-Expression. Um die Allgemeingültigkeit des PLK2-Signalweges für die Entstehung von Fibrose zu erforschen, wurde ein dermales Modell strahleninduzierter Fibrose benutzt. Darin bestätigten sich zum einen die Beobachtungen, die am Herzen gemacht wurden, und zum anderen führte der Einsatz von Mesalazin in vitro zu einer reduzierten p42 MAPK- und SMAD2 / 3-Phosphorylierung und damit zu einer deutlich verringerten OPN- und αSMA-Expression. Fibroblasten von Patienten im permanenten Vorhofflimmern exprimieren weniger PLK2 als Fibroblasten aus SR-Kontrollpatienten. Der Verlust der physiologischen PLK2-Aktivität geht mit ausgeprägten Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Fibroblasten im Herzen einher. Diese Veränderungen begünstigen eine profibrotische Situation auf Gewebeebene, welche durch die lokale als auch systemische Erhöhung des Plasmaosteopontins weiter begünstigt wird. Die vorliegende Studie identifiziert erstmalig PLK2 als neuen Regulator der Fibroblastenfunktion und Fibrose. Gleichzeitig stellen die Wiederherstellung des physiologischen Methylierungstatuses des PLK2 Promoters oder die Inhibition von OPN mittels Mesalazin vielversprechende therapeutische Optionen im Kampf gegen die Fibrosierung des Herzmuskels dar. Die konkrete pharmakotherapeutische Umsetzbarkeit muss in künftigen Forschungsvorhaben überprüft werden

Polo-like kinase 3 regulates CtIP during DNA double-strand break repair in G1

DNA double-strand breaks (DSBs) are repaired by nonhomologous end joining (NHEJ) or homologous recombination (HR). The C terminal binding protein–interacting protein (CtIP) is phosphorylated in G2 by cyclin-dependent kinases to initiate resection and promote HR. CtIP also exerts functions during NHEJ, although the mechanism phosphorylating CtIP in G1 is unknown. In this paper, we identify Plk3 (Polo-like kinase 3) as a novel DSB response factor that phosphorylates CtIP in G1 in a damage-inducible manner and impacts on various cellular processes in G1. First, Plk3 and CtIP enhance the formation of ionizing radiation-induced translocations; second, they promote large-scale genomic deletions from restriction enzyme-induced DSBs; third, they are required for resection and repair of complex DSBs; and finally, they regulate alternative NHEJ processes in Ku−/− mutants. We show that mutating CtIP at S327 or T847 to nonphosphorylatable alanine phenocopies Plk3 or CtIP loss. Plk3 binds to CtIP phosphorylated at S327 via its Polo box domains, which is necessary for robust damage-induced CtIP phosphorylation at S327 and subsequent CtIP phosphorylation at T847

Targeting cardiomyocyte ADAM10 ectodomain shedding promotes survival early after myocardial infarction

After myocardial infarction the innate immune response is pivotal in clearing of tissue debris as well as scar formation, but exaggerated cytokine and chemokine secretion with subsequent leukocyte infiltration also leads to further tissue damage. Here, we address the value of targeting a previously unknown a disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10)/CX3CL1 axis in the regulation of neutrophil recruitment early after MI. We show that myocardial ADAM10 is distinctly upregulated in myocardial biopsies from patients with ischemia-driven cardiomyopathy. Intriguingly, upon MI in mice, pharmacological ADAM10 inhibition as well as genetic cardiomycyte-specific ADAM10 deletion improves survival with markedly enhanced heart function and reduced scar size. Mechanistically, abolished ADAM10-mediated CX3CL1 ectodomain shedding leads to diminished IL-1β-dependent inflammation, reduced neutrophil bone marrow egress as well as myocardial tissue infiltration. Thus, our data shows a conceptual insight into how acute MI induces chemotactic signaling via ectodomain shedding in cardiomyocytes

Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer

Natural killer (NK) cells are attractive effectors for adoptive immunotherapy of cancer. Results from first-in-human studies using chimeric antigen receptor (CAR)-engineered primary NK cells and NK-92 cells are encouraging in terms of efficacy and safety. In order to further improve treatment strategies and to test the efficacy of CAR-NK cells in a personalized manner, preclinical screening assays using patient-derived tumor samples are needed. Zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae represent an attractive xenograft model to study growth and dissemination of patient-derived tumor cells because of their superb live cell imaging properties. Injection into the organism’s circulation allows investigation of metastasis, cancer cell-to-immune cell-interactions and studies of the tumor cell response to anti-cancer drugs. Here, we established a zebrafish larval xenograft model to test the efficacy of CAR-NK cells against metastatic breast cancer in vivo by injecting metastatic breast cancer cells followed by CAR-NK cell injection into the Duct of Cuvier (DoC). We validated the functionality of the system with two different CAR-NK cell lines specific for PD-L1 and ErbB2 (PD-L1.CAR NK-92 and ErbB2.CAR NK-92 cells) against the PD-L1-expressing MDA-MB-231 and ErbB2-expressing MDA-MB-453 breast cancer cell lines. Injected cancer cells were viable and populated peripheral regions of the larvae, including the caudal hematopoietic tissue (CHT), simulating homing of cancer cells to blood forming sites. CAR-NK cells injected 2.5 hours later migrated to the CHT and rapidly eliminated individual cancer cells throughout the organism. Unmodified NK-92 also demonstrated minor in vivo cytotoxicity. Confocal live-cell imaging demonstrated intravascular migration and real-time interaction of CAR-NK cells with MDA-MB-231 cells, explaining the rapid and effective in vivo cytotoxicity. Thus, our data suggest that zebrafish larvae can be used for rapid and cost-effective in vivo assessment of CAR-NK cell potency and to predict patient response to therapy

CNP Promotes Antiarrhythmic Effects via Phosphodiesterase 2

Background: Ventricular arrhythmia and sudden cardiac death are the most common lethal complications after myocardial infarction. Antiarrhythmic pharmacotherapy remains a clinical challenge and novel concepts are highly desired. Here, we focus on the cardioprotective CNP (C-type natriuretic peptide) as a novel antiarrhythmic principle. We hypothesize that antiarrhythmic effects of CNP are mediated by PDE2 (phosphodiesterase 2), which has the unique property to be stimulated by cGMP to primarily hydrolyze cAMP. Thus, CNP might promote beneficial effects of PDE2-mediated negative crosstalk between cAMP and cGMP signaling pathways. Methods: To determine antiarrhythmic effects of cGMP-mediated PDE2 stimulation by CNP, we analyzed arrhythmic events and intracellular trigger mechanisms in mice in vivo, at organ level and in isolated cardiomyocytes as well as in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Results: In ex vivo perfused mouse hearts, CNP abrogated arrhythmia after ischemia/reperfusion injury. Upon high-dose catecholamine injections in mice, PDE2 inhibition prevented the antiarrhythmic effect of CNP. In mouse ventricular cardiomyocytes, CNP blunted the catecholamine-mediated increase in arrhythmogenic events as well as in ICaL, INaL, and Ca2+spark frequency. Mechanistically, this was driven by reduced cellular cAMP levels and decreased phosphorylation of Ca2+handling proteins. Key experiments were confirmed in human iPSC-derived cardiomyocytes. Accordingly, the protective CNP effects were reversed by either specific pharmacological PDE2 inhibition or cardiomyocyte-specific PDE2 deletion. Conclusions: CNP shows strong PDE2-dependent antiarrhythmic effects. Consequently, the CNP-PDE2 axis represents a novel and attractive target for future antiarrhythmic strategies

Cognitive behavioural therapy with optional graded exercise therapy in patients with severe fatigue with myotonic dystrophy type 1:a multicentre, single-blind, randomised trial

Background: Myotonic dystrophy type 1 is the most common form of muscular dystrophy in adults and leads to severe fatigue, substantial physical functional impairment, and restricted social participation. In this study, we aimed to determine whether cognitive behavioural therapy optionally combined with graded exercise compared with standard care alone improved the health status of patients with myotonic dystrophy type 1. Methods: We did a multicentre, single-blind, randomised trial, at four neuromuscular referral centres with experience in treating patients with myotonic dystrophy type 1 located in Paris (France), Munich (Germany), Nijmegen (Netherlands), and Newcastle (UK). Eligible participants were patients aged 18 years and older with a confirmed genetic diagnosis of myotonic dystrophy type 1, who were severely fatigued (ie, a score of ≥35 on the checklist-individual strength, subscale fatigue). We randomly assigned participants (1:1) to either cognitive behavioural therapy plus standard care and optional graded exercise or standard care alone. Randomisation was done via a central web-based system, stratified by study site. Cognitive behavioural therapy focused on addressing reduced patient initiative, increasing physical activity, optimising social interaction, regulating sleep–wake patterns, coping with pain, and addressing beliefs about fatigue and myotonic dystrophy type 1. Cognitive behavioural therapy was delivered over a 10-month period in 10–14 sessions. A graded exercise module could be added to cognitive behavioural therapy in Nijmegen and Newcastle. The primary outcome was the 10-month change from baseline in scores on the DM1-Activ-c scale, a measure of capacity for activity and social participation (score range 0–100). Statistical analysis of the primary outcome included all participants for whom data were available, using mixed-effects linear regression models with baseline scores as a covariate. Safety data were presented as descriptives. This trial is registered with ClinicalTrials.gov, number NCT02118779. Findings: Between April 2, 2014, and May 29, 2015, we randomly assigned 255 patients to treatment: 128 to cognitive behavioural therapy plus standard care and 127 to standard care alone. 33 (26%) of 128 assigned to cognitive behavioural therapy also received the graded exercise module. Follow-up continued until Oct 17, 2016. The DM1-Activ-c score increased from a mean (SD) of 61·22 (17·35) points at baseline to 63·92 (17·41) at month 10 in the cognitive behavioural therapy group (adjusted mean difference 1·53, 95% CI −0·14 to 3·20), and decreased from 63·00 (17·35) to 60·79 (18·49) in the standard care group (−2·02, −4·02 to −0·01), with a mean difference between groups of 3·27 points (95% CI 0·93 to 5·62, p=0·007). 244 adverse events occurred in 65 (51%) patients in the cognitive behavioural therapy group and 155 in 63 (50%) patients in the standard care alone group, the most common of which were falls (155 events in 40 [31%] patients in the cognitive behavioural therapy group and 71 in 33 [26%] patients in the standard care alone group). 24 serious adverse events were recorded in 19 (15%) patients in the cognitive behavioural therapy group and 23 in 15 (12%) patients in the standard care alone group, the most common of which were gastrointestinal and cardiac. Interpretation: Cognitive behavioural therapy increased the capacity for activity and social participation in patients with myotonic dystrophy type 1 at 10 months. With no curative treatment and few symptomatic treatments, cognitive behavioural therapy could be considered for use in severely fatigued patients with myotonic dystrophy type 1. Funding: The European Union Seventh Framework Programme

Functional characterization and evaluation of the therapeutic potential of polo-like kinase 2 in cardiac fibroblasts and fibrosis

Atrial fibrillation (AF) is the most common and relevant arrhythmia in the clinical routine. AF is predicted to affect 6–12 million patients in the USA by 2050 and 18 million patients in Europe by 2060. Cardiac fibrosis and inflammation decisively determine the course of the disease and the clinical outcome of the patients. Despite the tremendous impact on human health, detailed understanding on the molecular mechanisms that contribute to fibrosis in AF is limited. This study provides further evidence for the current paradigm shift that atrial fibrillation is more of a systemic-inflammatory disease than a mere ion-channel dysfunction. The aim of this study was to investigate the role of polo-like kinase 2 (PLK2) and the pro-inflammatory cytokine osteopontin (OPN) with respect to fibroblast (dys)function and fibrosis formation in order to derive novel targets for targeted, fibroblast-specific pharmacotherapy. All patients who participated in this study gave their written informed consent in accordance to the declaration of Helsinki. The study was approved by the local bioethics committee (Ethikkommission an der Technischen Universität Dresden). Human fibroblasts were isolated by outgrowth culture from right atrial biopsies of patients suffering from sinus rhythm (SR) and AF. Murine fibroblasts were isolated by whole-heart Langendorff-perfusion. Quantitative PCR and western blot were used to detect PLK2 transcript expression and protein abundance, respectively. Functional assessment of cardiac function was done with transthoracic echocardiography and surface ECG recordings. Cell culture experiments were performed to evaluate the effects on functional fibroblast properties such as proliferation and differentiation after changing PLK2 activity by genetic knockout (KO) or pharmacological inhibition. A mass spectrometry based secretome analysis was performed by our collaborating laboratory of Prof. Manuel Mayr at King’s College London. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done to measure OPN in the peripheral blood of patients in SR and with permanent AF. Right atrial appendage tissue and fibroblasts from AF patients displayed significantly lower expression of PLK2 mRNA and protein due to increased DNA-methylation of the PLK2 promotor when compared to sinus rhythm (SR) control patient atria or fibroblasts. This methylation was induced in cardiac fibroblasts by chronic hypoxia (1% O2) exposure for 96 h. Pharmacological inhibition as well as global KO of PLK2 in cardiac fibroblasts resulted in elevated myofibroblast differentiation and reduced fibroblast proliferation. PLK2 KO mice displayed vast interstitial fibrosis areas as observed from histological cross sections stained either with Sirius red or with Masson’s trichrome staining. Transthoracic echocardiography revealed systolic and diastolic dysfunction in PLK2 KO mice and AF-typical ECG alterations such as prolonged PQ interval and QRS duration. Mass spectrometry proteomics revealed de novo expression of OPN in the PLK2-KO-fibroblast secretome. Furthermore, we found higher OPN plasma levels in AF patients correlated with electrophysiologically determined fibrosis compared to non-fibrosis control patients. Finally, we identified that the p42/44 MAPK signal transduction cascade is linking to reduced PLK2 expression and enhanced OPN release. Specifically, we found that KO of PLK2 increase p42 MAPK phosphorylation which is known to stimulate OPN transcription. Thus inhibition of p42/44 MAPK resulted in diminished OPN expression. In a dermal fibrosis model the administration of Mesalazine in vitro resulted in reduced p42 MAPK and SMAD2/3 phosphorylation and thereby reduced OPN and αSMA expression. To explore the general validity and relevance of the PLK2 signaling pathway for fibrosis, a dermal model of radiation-induced fibrosis was used. This approach a) confirmed the observations that were made in the heart and b) showed that the use of Mesalazine in vitro led to a reduced p42 MAPK and SMAD2 / 3 phosphorylation and thus to a significantly reduced OPN and αSMA expression. Fibroblasts from patients with permanent AF express less PLK2 than cells from SR control patients. The loss of physiological PLK2 activity coincides with marked changes in the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts. These changes favor fibrosis in the atrial tissues, which is further enhanced by the local and systemic increase of OPN. The present study identifies PLK2 as a novel regulator of cardiac fibroblast function and fibrosis. Restoration of the physiological methylation status of the PLK2 promoter or the inhibition of OPN with Mesalazine could be of particular clinical interest. The tangible clinical and pharmacological feasibility will be subject of future investigations.Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste und bedeutsamste Arrhythmie in der täglichen klinischen Praxis. VHF wird bis 2050 voraussichtlich 6 -12 Millionen Menschen in den USA und bis 2060 zirka 18 Millionen Menschen in Europa betreffen. Fibrose und Entzündungsprozesse bestimmen entscheidend den Krankheitsverlauf und das klinische Outcome der Patienten. Trotz dieser großen Relevanz sind detaillierte Informationen zu den beteiligten molekularen Pathomechanismen weitgehend unklar. Diese Studie liefert weitere Evidenz für den aktuellen Paradigmenwechsel, dass Vorhofflimmern eher eine systemisch-entzündliche Erkrankung als eine bloße Ionenkanaldysfunktion ist. Ziel dieser Arbeit war es die Rolle der polo-like Kinase 2 (PLK2) und des proinflammatorischen Zytokins Osteopontin (OPN) im Hinblick auf Fibroblasten(dys)funktion und Fibroseentstehung zu untersuchen, um neuartige Angriffspunkte für zielgerichtete, Fibroblasten-spezifische Pharmakotherapie abzuleiten. Alle Patienten wurden über die Teilnahme an der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die vorliegende Studie ist konform mit der Deklaration von Helsinki und enthaltene Tierversuche erhielten ein positives Votum der lokalen Tierschutzbehörde. Humane Vorhoffibroblasten wurden mit der „Outgrowth“-Methode aus Gewebeproben von Patienten im Sinusrhythmus (SR) und im permanenten Vorhofflimmern isoliert. Murine Herzfibroblasten wurden aus dem Überstand nach Langendorff-Perfusion durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen. Zur Detektion von PLK2 und anderen Markerproteinen wurden (quantitative) PCRs und Western Blots durchgeführt. Zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo, wurde transthorakale Echokardiografie mit Oberflächen-EKG-Ableitung genutzt. Nachfolgende Zellkulturexperimente beleuchteten die Auswirkungen pharmakologischer PLK2 Inhibition oder genetischen Knock-Outs auf Fibroblasten im Hinblick auf Proliferation, Differenzierung, Seneszenzentwicklung und Sekretion. Eine Massenspektrometrie-basierte Untersuchung des Sekretoms PLK2-defizienter Fibroblasten wurde im Labor unseres Kollaborationspartners Prof. Manuel Mayr am King’s College London durchgeführt. OPN im peripheren Blut von Vorhofflimmerpatienten wurde mittels eines ELISAs gemessen. Ob die betreffenden Patienten Fibrose der Vorhöfe aufwiesen oder nicht, wurde in klinisch-elektrophysiologischen Untersuchungen, dem sogenannten Mapping, bestimmt. Im Vergleich zu SR-Kontrollen, war die PLK2 mRNA- beziehungsweise Protein-Expression in isolierten Fibroblasten und auf Gewebeebene in VHF-Proben signifikant erniedrigt. Dies korrelierte mit PLK2-Promotermethylierung in der Hälfte der VHF-Proben. In SR-Kontrollen konnten wir keine Methylierung des PLK2 Promoters nachweisen. Die Herunterregulation der PLK2 mRNA-Expression bzw. die Induktion der Promotermethylierung konnten in humanen kardialen Fibroblasten durch Exposition gegenüber chronischer Hypoxie (1% O2) experimentell herbeigeführt werden. Pharmakologische Inhibition und der genetische Knockout (KO) von PLK2 gingen in vitro mit erniedrigter Proliferation aber gesteigerter Differenzierung in Myofibroblasten einher. PLK2-KO-Mäuse entwickelten im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Geschwistertieren ausgeprägte Areale interstitieller ventrikulärer Fibrose. Dies spiegelte sich in einer ausgeprägten systolischen und Diastolischen Funktionsstörung des Herzens bei 4 Monate-alten PLK2 KO Tieren wider. Die Sekretomanalyse deckte eine de novo Sekretion von OPN in PLK2-KO-Fibroblasten auf. Im Einklang mit diesem Ergebnis konnten wir höhere OPN-Plasmaspiegel auch bei VHF-Patienten messen, die mit dem Vorhandensein von elektrophysiologisch bestimmten Fibrosearealen korrelierte. Abschließend konnte der p42/44-MAPK-Signalweg als Bindeglied zwischen erniedrigter PLK2-Expression und erhöhter OPN-Freisetzung identifiziert werden. Verminderte PLK2 Expression beziehungsweise Aktivität gehen mit einer gesteigerten Proteinexpression und Phosphorylierung von p42/44 MAPK einher. P42/44 MAPK wiederum stimuliert dann die OPN-Transkription. Folgerichtig führte die Inhibition von p42/44 MAPK zu einer signifikant verminderten OPN-Expression. Um die Allgemeingültigkeit des PLK2-Signalweges für die Entstehung von Fibrose zu erforschen, wurde ein dermales Modell strahleninduzierter Fibrose benutzt. Darin bestätigten sich zum einen die Beobachtungen, die am Herzen gemacht wurden, und zum anderen führte der Einsatz von Mesalazin in vitro zu einer reduzierten p42 MAPK- und SMAD2 / 3-Phosphorylierung und damit zu einer deutlich verringerten OPN- und αSMA-Expression. Fibroblasten von Patienten im permanenten Vorhofflimmern exprimieren weniger PLK2 als Fibroblasten aus SR-Kontrollpatienten. Der Verlust der physiologischen PLK2-Aktivität geht mit ausgeprägten Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Fibroblasten im Herzen einher. Diese Veränderungen begünstigen eine profibrotische Situation auf Gewebeebene, welche durch die lokale als auch systemische Erhöhung des Plasmaosteopontins weiter begünstigt wird. Die vorliegende Studie identifiziert erstmalig PLK2 als neuen Regulator der Fibroblastenfunktion und Fibrose. Gleichzeitig stellen die Wiederherstellung des physiologischen Methylierungstatuses des PLK2 Promoters oder die Inhibition von OPN mittels Mesalazin vielversprechende therapeutische Optionen im Kampf gegen die Fibrosierung des Herzmuskels dar. Die konkrete pharmakotherapeutische Umsetzbarkeit muss in künftigen Forschungsvorhaben überprüft werden

Functional characterization and evaluation of the therapeutic potential of polo-like kinase 2 in cardiac fibroblasts and fibrosis

Atrial fibrillation (AF) is the most common and relevant arrhythmia in the clinical routine. AF is predicted to affect 6–12 million patients in the USA by 2050 and 18 million patients in Europe by 2060. Cardiac fibrosis and inflammation decisively determine the course of the disease and the clinical outcome of the patients. Despite the tremendous impact on human health, detailed understanding on the molecular mechanisms that contribute to fibrosis in AF is limited. This study provides further evidence for the current paradigm shift that atrial fibrillation is more of a systemic-inflammatory disease than a mere ion-channel dysfunction. The aim of this study was to investigate the role of polo-like kinase 2 (PLK2) and the pro-inflammatory cytokine osteopontin (OPN) with respect to fibroblast (dys)function and fibrosis formation in order to derive novel targets for targeted, fibroblast-specific pharmacotherapy. All patients who participated in this study gave their written informed consent in accordance to the declaration of Helsinki. The study was approved by the local bioethics committee (Ethikkommission an der Technischen Universität Dresden). Human fibroblasts were isolated by outgrowth culture from right atrial biopsies of patients suffering from sinus rhythm (SR) and AF. Murine fibroblasts were isolated by whole-heart Langendorff-perfusion. Quantitative PCR and western blot were used to detect PLK2 transcript expression and protein abundance, respectively. Functional assessment of cardiac function was done with transthoracic echocardiography and surface ECG recordings. Cell culture experiments were performed to evaluate the effects on functional fibroblast properties such as proliferation and differentiation after changing PLK2 activity by genetic knockout (KO) or pharmacological inhibition. A mass spectrometry based secretome analysis was performed by our collaborating laboratory of Prof. Manuel Mayr at King’s College London. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done to measure OPN in the peripheral blood of patients in SR and with permanent AF. Right atrial appendage tissue and fibroblasts from AF patients displayed significantly lower expression of PLK2 mRNA and protein due to increased DNA-methylation of the PLK2 promotor when compared to sinus rhythm (SR) control patient atria or fibroblasts. This methylation was induced in cardiac fibroblasts by chronic hypoxia (1% O2) exposure for 96 h. Pharmacological inhibition as well as global KO of PLK2 in cardiac fibroblasts resulted in elevated myofibroblast differentiation and reduced fibroblast proliferation. PLK2 KO mice displayed vast interstitial fibrosis areas as observed from histological cross sections stained either with Sirius red or with Masson’s trichrome staining. Transthoracic echocardiography revealed systolic and diastolic dysfunction in PLK2 KO mice and AF-typical ECG alterations such as prolonged PQ interval and QRS duration. Mass spectrometry proteomics revealed de novo expression of OPN in the PLK2-KO-fibroblast secretome. Furthermore, we found higher OPN plasma levels in AF patients correlated with electrophysiologically determined fibrosis compared to non-fibrosis control patients. Finally, we identified that the p42/44 MAPK signal transduction cascade is linking to reduced PLK2 expression and enhanced OPN release. Specifically, we found that KO of PLK2 increase p42 MAPK phosphorylation which is known to stimulate OPN transcription. Thus inhibition of p42/44 MAPK resulted in diminished OPN expression. In a dermal fibrosis model the administration of Mesalazine in vitro resulted in reduced p42 MAPK and SMAD2/3 phosphorylation and thereby reduced OPN and αSMA expression. To explore the general validity and relevance of the PLK2 signaling pathway for fibrosis, a dermal model of radiation-induced fibrosis was used. This approach a) confirmed the observations that were made in the heart and b) showed that the use of Mesalazine in vitro led to a reduced p42 MAPK and SMAD2 / 3 phosphorylation and thus to a significantly reduced OPN and αSMA expression. Fibroblasts from patients with permanent AF express less PLK2 than cells from SR control patients. The loss of physiological PLK2 activity coincides with marked changes in the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts. These changes favor fibrosis in the atrial tissues, which is further enhanced by the local and systemic increase of OPN. The present study identifies PLK2 as a novel regulator of cardiac fibroblast function and fibrosis. Restoration of the physiological methylation status of the PLK2 promoter or the inhibition of OPN with Mesalazine could be of particular clinical interest. The tangible clinical and pharmacological feasibility will be subject of future investigations.Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste und bedeutsamste Arrhythmie in der täglichen klinischen Praxis. VHF wird bis 2050 voraussichtlich 6 -12 Millionen Menschen in den USA und bis 2060 zirka 18 Millionen Menschen in Europa betreffen. Fibrose und Entzündungsprozesse bestimmen entscheidend den Krankheitsverlauf und das klinische Outcome der Patienten. Trotz dieser großen Relevanz sind detaillierte Informationen zu den beteiligten molekularen Pathomechanismen weitgehend unklar. Diese Studie liefert weitere Evidenz für den aktuellen Paradigmenwechsel, dass Vorhofflimmern eher eine systemisch-entzündliche Erkrankung als eine bloße Ionenkanaldysfunktion ist. Ziel dieser Arbeit war es die Rolle der polo-like Kinase 2 (PLK2) und des proinflammatorischen Zytokins Osteopontin (OPN) im Hinblick auf Fibroblasten(dys)funktion und Fibroseentstehung zu untersuchen, um neuartige Angriffspunkte für zielgerichtete, Fibroblasten-spezifische Pharmakotherapie abzuleiten. Alle Patienten wurden über die Teilnahme an der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die vorliegende Studie ist konform mit der Deklaration von Helsinki und enthaltene Tierversuche erhielten ein positives Votum der lokalen Tierschutzbehörde. Humane Vorhoffibroblasten wurden mit der „Outgrowth“-Methode aus Gewebeproben von Patienten im Sinusrhythmus (SR) und im permanenten Vorhofflimmern isoliert. Murine Herzfibroblasten wurden aus dem Überstand nach Langendorff-Perfusion durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen. Zur Detektion von PLK2 und anderen Markerproteinen wurden (quantitative) PCRs und Western Blots durchgeführt. Zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo, wurde transthorakale Echokardiografie mit Oberflächen-EKG-Ableitung genutzt. Nachfolgende Zellkulturexperimente beleuchteten die Auswirkungen pharmakologischer PLK2 Inhibition oder genetischen Knock-Outs auf Fibroblasten im Hinblick auf Proliferation, Differenzierung, Seneszenzentwicklung und Sekretion. Eine Massenspektrometrie-basierte Untersuchung des Sekretoms PLK2-defizienter Fibroblasten wurde im Labor unseres Kollaborationspartners Prof. Manuel Mayr am King’s College London durchgeführt. OPN im peripheren Blut von Vorhofflimmerpatienten wurde mittels eines ELISAs gemessen. Ob die betreffenden Patienten Fibrose der Vorhöfe aufwiesen oder nicht, wurde in klinisch-elektrophysiologischen Untersuchungen, dem sogenannten Mapping, bestimmt. Im Vergleich zu SR-Kontrollen, war die PLK2 mRNA- beziehungsweise Protein-Expression in isolierten Fibroblasten und auf Gewebeebene in VHF-Proben signifikant erniedrigt. Dies korrelierte mit PLK2-Promotermethylierung in der Hälfte der VHF-Proben. In SR-Kontrollen konnten wir keine Methylierung des PLK2 Promoters nachweisen. Die Herunterregulation der PLK2 mRNA-Expression bzw. die Induktion der Promotermethylierung konnten in humanen kardialen Fibroblasten durch Exposition gegenüber chronischer Hypoxie (1% O2) experimentell herbeigeführt werden. Pharmakologische Inhibition und der genetische Knockout (KO) von PLK2 gingen in vitro mit erniedrigter Proliferation aber gesteigerter Differenzierung in Myofibroblasten einher. PLK2-KO-Mäuse entwickelten im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Geschwistertieren ausgeprägte Areale interstitieller ventrikulärer Fibrose. Dies spiegelte sich in einer ausgeprägten systolischen und Diastolischen Funktionsstörung des Herzens bei 4 Monate-alten PLK2 KO Tieren wider. Die Sekretomanalyse deckte eine de novo Sekretion von OPN in PLK2-KO-Fibroblasten auf. Im Einklang mit diesem Ergebnis konnten wir höhere OPN-Plasmaspiegel auch bei VHF-Patienten messen, die mit dem Vorhandensein von elektrophysiologisch bestimmten Fibrosearealen korrelierte. Abschließend konnte der p42/44-MAPK-Signalweg als Bindeglied zwischen erniedrigter PLK2-Expression und erhöhter OPN-Freisetzung identifiziert werden. Verminderte PLK2 Expression beziehungsweise Aktivität gehen mit einer gesteigerten Proteinexpression und Phosphorylierung von p42/44 MAPK einher. P42/44 MAPK wiederum stimuliert dann die OPN-Transkription. Folgerichtig führte die Inhibition von p42/44 MAPK zu einer signifikant verminderten OPN-Expression. Um die Allgemeingültigkeit des PLK2-Signalweges für die Entstehung von Fibrose zu erforschen, wurde ein dermales Modell strahleninduzierter Fibrose benutzt. Darin bestätigten sich zum einen die Beobachtungen, die am Herzen gemacht wurden, und zum anderen führte der Einsatz von Mesalazin in vitro zu einer reduzierten p42 MAPK- und SMAD2 / 3-Phosphorylierung und damit zu einer deutlich verringerten OPN- und αSMA-Expression. Fibroblasten von Patienten im permanenten Vorhofflimmern exprimieren weniger PLK2 als Fibroblasten aus SR-Kontrollpatienten. Der Verlust der physiologischen PLK2-Aktivität geht mit ausgeprägten Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Fibroblasten im Herzen einher. Diese Veränderungen begünstigen eine profibrotische Situation auf Gewebeebene, welche durch die lokale als auch systemische Erhöhung des Plasmaosteopontins weiter begünstigt wird. Die vorliegende Studie identifiziert erstmalig PLK2 als neuen Regulator der Fibroblastenfunktion und Fibrose. Gleichzeitig stellen die Wiederherstellung des physiologischen Methylierungstatuses des PLK2 Promoters oder die Inhibition von OPN mittels Mesalazin vielversprechende therapeutische Optionen im Kampf gegen die Fibrosierung des Herzmuskels dar. Die konkrete pharmakotherapeutische Umsetzbarkeit muss in künftigen Forschungsvorhaben überprüft werden