Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer)

Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht F420-abhängige Oxidoreduktasen in methanogenen Archaea gefunden, die alle Si-Seiten-spezifisch bezüglich des Hydrid-Transfers sind. Von den acht Enzymen zeigen zwei Sequenzverwandtschaft zur Enzymfamilie der bakteriellen Luciferase (LuxA). Es handelt sich hierbei um F420-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer), die untereinander bis zu 26% sequenzverwandt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Kristallstrukturen der Alkohol-Dehydrogenase Adf und der Reduktase Mer mit gebundenem Coenzym F420 ermittelt. Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (Adf) aus Methanoculleus thermophilicus wurde mit einem gebundenen F420-Aceton Addukt bei einer Auflösung von 1,8 Å gelöst. Das Enzym liegt als Homodimer vor. Die Monomere besitzen eine (α/β)8-Faltung, bekannt als TIM-Barrel, und weisen eine nicht-Prolin-cis-Peptidbindung auf. Die Tertiärstruktur weicht von der Grundstruktur des TIM-Barrels durch zusätzliche Domänen mit Sekundärstrukturelementen ab, die als Insertions-Regionen bezeichnet werden. Insertions-Regionen bilden die Kontaktstelle für die Dimerisierung und sind an der Substratbindung beteiligt. Coenzym F420 bindet in einer Bindetasche, welche 15 Å tief von der Oberfläche bis in das Zentrum des Enzyms hineinreicht. Schwache Wechselwirkungen von F420 zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Proteinhauptkette tragen wesentlich zu seiner Bindung bei. Die in Proteinen selten zu beobachtende nicht-Prolin-cis-Peptidbindung dient der Fixierung des Deazaflavin-Rings an seiner Re-Seite. Diese energetisch instabile cis-Bindung wird durch benachbarte, intramolekulare Wechselwirkungen stabilisiert. Der als Isoalloxazin-Ring bezeichnete Deazaflavin-Ring liegt in einer `gebogenenŽ Konformation vor und weicht um 27° von einer planaren Konformation ab. Der Aceton-Teil des gebundenen F420-Aceton Addukts bindet kovalent am C5 auf der Si-Seite des Deazaflavin-Rings. Mit dieser Hilfe war es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum des Enzyms zu modellieren. Reste, welche an der Bindung von 2-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert. Die Kristallstruktur von F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) aus Methanosarcina barkeri wurde mit gebundenem Coenzym F420 bei einer Auflösung von 2,6 Å ermittelt. Das Enzym liegt als Homotetramer vor. Mer-Monomere haben eine (α/β)8-Tertiärstruktur mit zusätzlichen Insertionsregionen. Innerhalb des aktiven Zentrums bindet F420 hauptsächlich über schwache Wechselwirkungen zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Protein Hauptkette. Ausnahmen sind an der Bindung beteiligte Seitenketten von His36 und Lys161. Die nicht-Prolin-cis-Peptidbindung, an identischer Position zu Adf, fixiert den Deazaflavin-Ring. Der Isoalloxazin-Ring weist in Reduktase Mer die aus Alkohol-Dehydrogenase Adf bekannte gebogene Konformation auf. Ein unbekanntes Molekül bindet kovalent am C5 des Coenzyms. Anhand von Mer-Strukturvergleichen konnte eine F420-bedingte Konformationsänderung in einer flexiblen Domäne einer Insertions-Region beobachtet werden. Zwischen zwei Insertionsregionen des TIM-Barrels bindet Polyethylenglykol, welches als Präzipitant im Kristallisationsansatz vorlag. Die unspezifische Bindung von Polyethylenglykol an einer potentiellen Substratbindestelle in Mer wird im abschließenden Teil dieser Arbeit diskutiert. Aufgrund der Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase und der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase in Abwesenheit und in Gegenwart von F420 wird ein Katalysemechanismus für diese beiden Enzyme vorgeschlagen und F420 in das aktive Zentrum der strukturverwandten bakteriellen Luciferase modelliert. Abschließend wird die in der LuxA-Familie konservierte F420-bzw. FMN-Bindestelle mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und 8-HDF-Photolyase verglichen, die weder untereinander noch mit der Luciferase-Familie Sequenzverwandtschaften zeigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit sind in zwei Orginalarbeiten beschrieben, die den Ergebnisteil der Dissertation bilden

Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer)

Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht F420-abhängige Oxidoreduktasen in methanogenen Archaea gefunden, die alle Si-Seiten-spezifisch bezüglich des Hydrid-Transfers sind. Von den acht Enzymen zeigen zwei Sequenzverwandtschaft zur Enzymfamilie der bakteriellen Luciferase (LuxA). Es handelt sich hierbei um F420-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer), die untereinander bis zu 26% sequenzverwandt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Kristallstrukturen der Alkohol-Dehydrogenase Adf und der Reduktase Mer mit gebundenem Coenzym F420 ermittelt. Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (Adf) aus Methanoculleus thermophilicus wurde mit einem gebundenen F420-Aceton Addukt bei einer Auflösung von 1,8 Å gelöst. Das Enzym liegt als Homodimer vor. Die Monomere besitzen eine (α/β)8-Faltung, bekannt als TIM-Barrel, und weisen eine nicht-Prolin-cis-Peptidbindung auf. Die Tertiärstruktur weicht von der Grundstruktur des TIM-Barrels durch zusätzliche Domänen mit Sekundärstrukturelementen ab, die als Insertions-Regionen bezeichnet werden. Insertions-Regionen bilden die Kontaktstelle für die Dimerisierung und sind an der Substratbindung beteiligt. Coenzym F420 bindet in einer Bindetasche, welche 15 Å tief von der Oberfläche bis in das Zentrum des Enzyms hineinreicht. Schwache Wechselwirkungen von F420 zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Proteinhauptkette tragen wesentlich zu seiner Bindung bei. Die in Proteinen selten zu beobachtende nicht-Prolin-cis-Peptidbindung dient der Fixierung des Deazaflavin-Rings an seiner Re-Seite. Diese energetisch instabile cis-Bindung wird durch benachbarte, intramolekulare Wechselwirkungen stabilisiert. Der als Isoalloxazin-Ring bezeichnete Deazaflavin-Ring liegt in einer `gebogenenŽ Konformation vor und weicht um 27° von einer planaren Konformation ab. Der Aceton-Teil des gebundenen F420-Aceton Addukts bindet kovalent am C5 auf der Si-Seite des Deazaflavin-Rings. Mit dieser Hilfe war es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum des Enzyms zu modellieren. Reste, welche an der Bindung von 2-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert. Die Kristallstruktur von F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) aus Methanosarcina barkeri wurde mit gebundenem Coenzym F420 bei einer Auflösung von 2,6 Å ermittelt. Das Enzym liegt als Homotetramer vor. Mer-Monomere haben eine (α/β)8-Tertiärstruktur mit zusätzlichen Insertionsregionen. Innerhalb des aktiven Zentrums bindet F420 hauptsächlich über schwache Wechselwirkungen zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Protein Hauptkette. Ausnahmen sind an der Bindung beteiligte Seitenketten von His36 und Lys161. Die nicht-Prolin-cis-Peptidbindung, an identischer Position zu Adf, fixiert den Deazaflavin-Ring. Der Isoalloxazin-Ring weist in Reduktase Mer die aus Alkohol-Dehydrogenase Adf bekannte gebogene Konformation auf. Ein unbekanntes Molekül bindet kovalent am C5 des Coenzyms. Anhand von Mer-Strukturvergleichen konnte eine F420-bedingte Konformationsänderung in einer flexiblen Domäne einer Insertions-Region beobachtet werden. Zwischen zwei Insertionsregionen des TIM-Barrels bindet Polyethylenglykol, welches als Präzipitant im Kristallisationsansatz vorlag. Die unspezifische Bindung von Polyethylenglykol an einer potentiellen Substratbindestelle in Mer wird im abschließenden Teil dieser Arbeit diskutiert. Aufgrund der Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase und der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase in Abwesenheit und in Gegenwart von F420 wird ein Katalysemechanismus für diese beiden Enzyme vorgeschlagen und F420 in das aktive Zentrum der strukturverwandten bakteriellen Luciferase modelliert. Abschließend wird die in der LuxA-Familie konservierte F420-bzw. FMN-Bindestelle mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und 8-HDF-Photolyase verglichen, die weder untereinander noch mit der Luciferase-Familie Sequenzverwandtschaften zeigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit sind in zwei Orginalarbeiten beschrieben, die den Ergebnisteil der Dissertation bilden

Crystal structure of methylenetetrahydromethanopterin reductase (Mer) in complex with coenzyme F420: Architecture of the F420/FMN binding site of enzymes within the nonprolyl cis-peptide containing bacterial luciferase family

Methylenetetratetrahydromethanopterin reductase (Mer) is involved in CO2 reduction to methane in methanogenic archaea and catalyses the reversible reduction of methylenetetrahydromethanopterin (methylene-H4MPT) to methyl-H4MPT with coenzyme F420H2, which is a reduced 5′-deazaflavin. Mer was recently established as a TIM barrel structure containing a nonprolyl cis-peptide bond but the binding site of the substrates remained elusive. We report here on the crystal structure of Mer in complex with F420 at 2.6 Å resolution. The isoalloxazine ring is present in a pronounced butterfly conformation, being induced from the Re-face of F420 by a bulge that contains the non-prolyl cis-peptide bond. The bindingmode of F420 is very similar to that in F420-dependent alcohol dehydrogenase Adf despite the low sequence identity of 21%. Moreover, binding of F420 to the apoenzyme was only associated with minor conformational changes of the polypeptide chain. These findings allowed us to build an improved model of FMN into its binding site in bacterial luciferase, which belongs to the same structural family as Mer and Adf and also contains a nonprolyl cis-peptide bond in an equivalent position

Sequence haplotypes revealed by sequence-tagged site fine mapping of the Ror1 gene in the centromeric region of barley chromosome 1H

We describe the development of polymerase chain reaction-based, sequence-tagged site (STS) markers for fine mapping of the barley (Hordeum vulgare) Ror1 gene required for broad-spectrum resistance to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. hordei). After locating Ror1 to the centromeric region of barley chromosome 1H using a combined amplified fragment length polymorphism/restriction fragment-length polymorphism (RFLP) approach, sequences of RFLP probes from this chromosome region of barley and corresponding genome regions from the related grass species oat (Avena spp.), wheat, and Triticum monococcum were used to develop STS markers. Primers based on the RFLP probe sequences were used to polymerase chain reaction-amplify and directly sequence homologous DNA stretches from each of four parents that were used for mapping. Over 28,000 bp from 22 markers were compared. In addition to one insertion/deletion of at least 2.0 kb, 79 small unique sequence polymorphisms were observed, including 65 single nucleotide substitutions, two dinucleotide substitutions, 11 insertion/deletions, and one 5-bp/10-bp exchange. The frequency of polymorphism between any two barley lines ranged from 0.9 to 3.0 kb, and was greatest for comparisons involving an Ethiopian landrace. Haplotype structure was observed in the marker sequences over distances of several hundred basepairs. Polymorphisms in 16 STSs were used to generate genetic markers, scored by restriction enzyme digestion or by direct sequencing. Over 2,300 segregants from three populations were used in Ror1 linkage analysis, mapping Ror1 to a 0.2- to 0.5-cM marker interval. We discuss the implications of sequence haplotypes and STS markers for the generation of high-density maps in cereals.Nicholas C. Collins, Thomas Lahaye, Christoph Peterhänsel, Andreas Freialdenhoven, Margaret Corbitt, and Paul Schulze-Lefer