Embriogênse somática em Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze, Pinus sylvestris (Linneaus) e Picea abies (Linneaus) Karsten: ontogênese, padrão de expressão proteica e do gene serk

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agráricas, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2009.O estudo dos mecanismos do desenvolvimento embrionário em plantas pode ser facilitado pelo estabelecimento de sistemas modelos associados a embriogênese in vitro. Avanços no conhecimento básico e aplicações biotecnológicas são decorrentes dos estudos destes sistemas biológicos. Com a finalidade de regular eficientemente a regeneração de plantas por meio da embriogênese somática é importante entender como os embriões somáticos são formados e como este desenvolvimento é influenciado por sinalização endógena ou exógena. O objetivo do presente trabalho foi estudar o padrão de organização morfológica e a histogênese durante o desenvolvimento inicial do embrião somático em Araucaria angustifolia, Pinus sylvestris e Picea abies assim como o perfil de proteínas e o padrão de expressão do gene SERK durante a embriogênese somática em A. angustifolia. O modelo de desenvolvimento de embriões somáticos de A. angustifolia se caracteriza pela formação de culturas embriogênicas a partir de embriões zigóticos imaturos que proliferam na forma de massas pró-embrionárias (MPEs). Embriões somáticos desenvolvem-se a partir das PEMs por meio da retirada de fitorreguladores e pela suplementação de ABA, PEG e Maltose. A transição das MPEs para embriões somáticos é um dos pontos críticos observados e diversas anormalidades morfológicas são observadas. A morte celular programada (MCP) ocorre nos primeiros estádios finais da embriogênese não nos estádios iniciais do desenvolvimento de embriões somáticos de A. angustifolia. Células embriogênicas e células do suspensor são eliminadas durante o inicio da embriogênese final por meio da MCP caracterizada pela autofagia As proteínas arabionogalactanas (AGPs) são marcadores espaciais e temporais da morte celular em embriões somáticos de A. angustifolia. O epítopo JIM 13 foi detectado principalmente em células do suspensor em processo de degradação. Foi utilizado, como modelo comparativo, o sistema de embriogênese somática em P. abies para estudar o efeito do ABA na morfologia e MCP durante os estádios iniciais de desenvolvimento de embriões somáticos em P. abies visando melhor entender as anormalidades morfológicas observadas em A. angustifolia. O tratamento com ABA durante os estádios iniciais da embriogênese induz morfologias anormais do embrião e um aumento da freqüência de células TUNEL positivas embrionárias e de suspensor. O Fluoridone promove a diferenciação dos estádios iniciais do desenvolvimento dos embriões somáticos em P. sylvestris. No entanto os estádios tardios de desenvolvimento dos embriões somáticos de P. sylvestris mantêm a capacidade autoreplicativa. Foi caracterizado o perfil de expressão de proteínas durante a fase pró-embrionária, embriogênese inicial e final do embrião somático de A. angustifolia por meio da análise em eletroforese bidimensional (2-DE). Foram identificadas proteínas que apresentaram expressão diferencial durante os distintos estádios. Proteína de reserva vicilina foi observada em embriões somáticos no inicio da embriogênese final de forma similar ao observado na embriogênese zigótica. A expressão do gene SERK foi avaliada durante a fase de pró- embrionária e embriogenese inicial e sua expressão foi detectada, por meio de hibridação in situ, em células do ápice embrionário em meio de cultura suplementado com ABA, PEG e maltose. Os resultados aqui obtidos ampliam a base cientifica para aprofundar a compreensão dos fatores associados a biologia do desenvolvimento embrionário em coníferas e a embriogênese somática em A. angustifolia. O estabelecimento de um protocolo completo de embriogenese somática em A angustifolia se configura em uma ferramenta para o estabelecimento de programas de conservação e melhoramento de germoplasma desta conífera nativa

Padrões de acúmulo de proteínas e carboidratos durante a embriogênese somática de Acca sellowiana

The aim of this work was to quantify the protein, starch and total sugars levels during histodifferentiation and development of somatic embryos of Acca sellowiana Berg. For histological observations, the samples were dehydrated in a battery of ethanol, embedded in historesin and stained with toluidine blue (morphology), coomassie blue (protein bodies) and periodic acid-Schiff (starch). Proteins were extracted using a buffer solution, precipitated using ethanol and quantified using the Bradford reagent. Total sugars were extracted using a methanol-chloroform-water (12:5:3) solution and quantified by a reaction with anthrone at 0.2%. Starch was extracted using a 30% perchloric acid solution and quantified by a reaction with anthrone at 0.2%. During the somatic embryogenesis' in vitro morphogenesis and differentiation processes, the total protein levels decreased and the soluble sugars levels increased during the first 30 days in culture and remained stable until the 120th day. On the other hand, total protein levels increased according to the progression in the developmental stages of the somatic embryos. The levels of total sugars and starch increased in the heart and cotyledonary stages, and decreased in the torpedo and pre-cotyledonary stages. These compounds play a central role in the development of somatic embryos of Acca sellowiana. © 2009 Embrapa Informação Tecnológica.O objetivo deste trabalho foi quantificar os teores de proteína, amido e açúcares totais durante a histodiferenciação e desenvolvimento dos embriões somáticos em Acca sellowiana Berg. Para as observações histológicas, as amostras foram desidratadas em uma bateria de etanol, emblocadas em historesina e coradas com azul de toluidina (morfologia), azul de coomassie (corpos proteicos) e reativo ácido periódico de Schiff (amido). As proteínas foram extraídas usando uma solução tampão, precipitadas usando etanol e quantificadas por meio do reativo de Bradford. Os açúcares totais foram extraídos usando uma solução metanol-clorofórmioágua (12:5:3) e quantificados pela reação com antrona a 0,2%. O amido foi extraído usando uma solução de ácido perclórico a 30% e quantificado pela reação com antrona a 0,2%. Durante a diferenciação e morfogênese in vitro da embriogênese somática, os teores de proteínas totais decresceram e os açúcares solúveis aumentaram durante os 30 primeiros dias em cultura e permaneceram constantes até os 120 dias. Por outro lado, os teores das proteínas totais apresentaram incremento de acordo com a progressão nos estádios de desenvolvimento dos embriões somáticos. Os teores de açúcares totais e de amido aumentaram nos estádios cordiforme e cotiledonar e diminuíram nos estádios torpedo e pré-cotiledonar. Esses compostos exercem papel central no desenvolvimento de embriões somáticos de Acca sellowiana.Fil: Cangahuala-Inocente, Gabriela Claudia. Universidade Federal de Santa Catarina; BrasilFil: Steiner, Neusa. Universidade Federal de Santa Catarina; BrasilFil: Maldonado, Sara Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada; ArgentinaFil: Guerra, Miguel Pedro. Universidade Federal de Santa Catarina; Brasi

Caracterização de espécies vegetais nativas com potencial ornamental de ocorrência na região de Curitibanos, SC

Resumo – O estudo teve por objetivo identificar espécies vegetais com potencial ornamental, de ocorrência natural na região de Curitibanos, SC, através da avaliação de características morfológicas e fenológicas. O método de avaliação fenológica foi o qualitativo direto, avaliando-se o início e o término das fenofases. Para a caracterização morfológica foram avaliadas as plantas e seu ambiente de ocorrência. Após a coleta de informações, cada espécie foi submetida à análise através do Índice Composto de Potencial Ornamental de Espécies Tropicais, para obtenção da potencialidade ornamental. Foram identificadas 10 espécies, sendo elas: Aspilia montevidensis, Baccharis uncinella, Calibrachoa sellowiana, Eryngium horridum, Parodia ottonis, Passiflora caerulea, Senecio bonariensis, Trichocline catharinensis, Tritrhinax acanthocoma e Vriesea reitzii. Todas apresentaram floração por um período mínimo de dois meses. O máximo potencial ornamental foi atingido por 9 das 10 plantas identificadas. Como resultado obteve-se uma lista de espécies com potencial ornamental que poderão ser empregadas em ornamentação e paisagismo de diferentes ambientes, com indicativo de uso.Abstract – This study aimed to identify native plant species with ornamental potential of occurrence in Curitibanos/SC. Two methods were used in this research. The method of phenological assessment was based on qualitative aspects since the beginning until the end of the phenological phases. Characterization of the plants and its environment was performed as the second method . After these characterization, each species was subjected to a more detailed analysis through the “Composite Index of Ornamental Potential of Tropical Plants”, to obtain the ornamental potentiality. Ten species were identified: Aspilia montevidensis, Baccharis uncinella, Calibrachoa sellowiana, Eryngium horridum, Parodia ottonis, Passiflora caerulea, Senecio bonariensis, Trichocline catharinensis, Tritrhinax acanthocoma and Vriesea reitzii. All of them showed flowering for at least two months, and 9 of the 10 plants presented maximum ornamental potential. As result a list of potential species that can be used in ornamental and landscaping projects was generated, with usage indicative

Padrões de acúmulo de proteínas e carboidratos durante a embriogênese somática de Acca sellowiana

The aim of this work was to quantify the protein, starch and total sugars levels during histodifferentiation and development of somatic embryos of Acca sellowiana Berg. For histological observations, the samples were dehydrated in a battery of ethanol, embedded in historesin and stained with toluidine blue (morphology), coomassie blue (protein bodies) and periodic acid–Schiff (starch). Proteins were extracted using a buffer solution, precipitated using ethanol and quantified using the Bradford reagent. Total sugars were extracted using a methanol-chloroform-water (12:5:3) solution and quantified by a reaction with anthrone at 0.2%. Starch was extracted using a 30% perchloric acid solution and quantified by a reaction with anthrone at 0.2%. During the somatic embryogenesis’ in vitro morphogenesis and differentiation processes, the total protein levels decreased and the soluble sugars levels increased during the first 30 days in culture and remained stable until the 120th day. On the other hand, total protein levels increased according to the progression in the developmental stages of the somatic embryos. The levels of total sugars and starch increased in the heart and cotyledonary stages, and decreased in the torpedo and pre-cotyledonary stages. These compounds play a central role in the development of somatic embryos of Acca sellowiana.O objetivo deste trabalho foi quantificar os teores de proteína, amido e açúcares totais durante a histodiferenciação e desenvolvimento dos embriões somáticos em Acca sellowiana Berg. Para as observações histológicas, as amostras foram desidratadas em uma bateria de etanol, emblocadas em historesina e coradas com azul de toluidina (morfologia), azul de coomassie (corpos proteicos) e reativo ácido periódico de Schiff (amido). As proteínas foram extraídas usando uma solução tampão, precipitadas usando etanol e quantificadas por meio do reativo de Bradford. Os açúcares totais foram extraídos usando uma solução metanol-clorofórmio-água (12:5:3) e quantificados pela reação com antrona a 0,2%. O amido foi extraído usando uma solução de ácido perclórico a 30% e quantificado pela reação com antrona a 0,2%. Durante a diferenciação e morfogênese in vitro da embriogênese somática, os teores de proteínas totais decresceram e os açúcares solúveis aumentaram durante os 30 primeiros dias em cultura e permaneceram constantes até os 120 dias. Por outro lado, os teores das proteínas totais apresentaram incremento de acordo com a progressão nos estádios de desenvolvimento dos embriões somáticos. Os teores de açúcares totais e de amido aumentaram nos estádios cordiforme e cotiledonar e diminuíram nos estádios torpedo e pré‑cotiledonar. Esses compostos exercem papel central no desenvolvimento de embriões somáticos de Acca sellowiana

Study of the occurrence of agrochemicals in the waters of the Marombas River- Santa Catarina - Brazil

The region of the sub-basin of the Marombas River is based on economic agroforestry activities. These activities use agrochemicals that can contaminate surface and groundwater and cause diseases in humans and animals. The present study aimed to detect the presence of agrochemicals in the waters of the Marombas River at 4 different points. The water samples were collected every two months over a 1-year period. The concentrations of carbamates, herbicides, fungicides and organophosphates were analyzed. The chromatographic analysis revealed the presence of the fungicide Azoxystrobin (0.65 μg L-1) in the water sample collected at a point in the river with a strong influence of agricultural activities. The concentration of other agrochemicals was below the detection limit of the assay methods used at all points, and in all types of sampling. The Marombas River is subject to contamination by agrochemicals, which represents a potential risk to the human population and to the aquatic biota

Ontogenia de megaestróbilos de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze (Araucariaceae)

Em vista da escassez de dados sobre o desenvolvimento individual da fase embrionária à fase adulta, este estudo teve como objetivos descrever a ontogenia de megaestróbilos de A. angustifolia, conhecer o rendimento dos megaestróbilos, assim como o número e a localização de plantas masculinas, femininas e juvenis, em uma população nativa localizada em Curitibanos (SC). Forwam realizadas 17 coletas (março 2011 a julho 2012). As plantas foram geolocalizadas. Coletaram-se mensalmente três megaestróbilos maduros, em desenvolvimento e, quando possível, imaturos, de árvores previamente marcadas. Os megaestróbilos foram fotografados, medidos, pesados e tiveram suas brácteas, sementes e sementes chochas separadas e quantificadas. Na população estudada, verificaram-se 176 plantas, das quais 56 eram masculinas, 41 femininas e 79 juvenis. O peso médio dos megaestróbilos (iniciais, em desenvolvimento e maduros) ficou entre 72,83 g e 1.437,39 g; o diâmetro médio entre 15,91 cm e 45,08 cm e o comprimento médio entre 6,95 cm e 22,88 cm. Nos megaestróbilos maduros, 85% do seu rendimento são brácteas estéreis, enquanto as sementes e as sementes chochas equivaleram a aproximadamente 10% cada. Os resultados podem contribuir em operações de coletas de sementes que visem à melhoria reprodutiva, conservação de germoplasma e conservação in situ da população nativa estudada

The transition of proembryogenic masses to somatic embryos in Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze is related to the endogenous contents of IAA, ABA and polyamines

In somatic embryogenesis (SE) of conifers, the inability of many embryogenic cell lines to form well-developed somatic embryos may results from failure and constraints during the transition of proembryogenic masses (PEMs) to early somatic embryos. In the present work, we propose the inclusion of a preculture and prematuration steps looking at enhancing PEM III-to-early somatic embryos transition. It was further hypothesized that these results would correlate with the contents of endogenous indole-3-acetic acid (IAA), abscisic acid (ABA) and polyamines (PA). To test these hypotheses, the embryogenic culture was subjected to preculture with fluridone (FLD) and prematuration treatments with different combinations of carbon source and polyethylene glycol (PEG). The frequency of PEM III was increased after FLD preculture and the contents of IAA and ABA decreased, while the contents of PA increased. Putrescine (Put) was the most abundant PA present at this stage, followed by spermidine (Spd) and spermine (Spm). In early embryogenesis, prematuration treatments supplemented with maltose or lactose plus PEG enhanced the PEM III-to-early somatic embryos transition. IAA and ABA contents increased at this stage, while a decrease of the total free PA levels was observed. Put was the most abundant PA, followed by Spd and Spm, mainly in the treatment supplemented with PEG. This resulted in a decrease of PA ratio (Put/Spd + Spm) and, hence, PEM III-to-early somatic embryos transition. It was concluded that the preculture with FLD and prematuration treatments promote the PEM III-to-early somatic embryos transition throughout the whole early developmental process in Araucaria angustifolia.This study was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brazil) and Fundação de Apoio à Pesquisa Cientifica e Inovação Tecnológica do Estado de Santa Catarina (FAPESC). This study is part of the Ph.D. thesis of the first author

Effect of Thermal Stress on Tissue Ultrastructure and Metabolite Profiles During Initiation of Radiata Pine Somatic Embryogenesis

Climate change will inevitably lead to environmental variations, thus plant drought tolerance will be a determinant factor in the success of plantations and natural forestry recovery. Some metabolites, such as soluble carbohydrates and amino acids, have been described as being the key to both embryogenesis efficiency and abiotic stress response, contributing to phenotypic plasticity and the adaptive capacity of plants. For this reason, our main objectives were to evaluate if the temperature during embryonal mass initiation in radiata pine was critical to the success of somatic embryogenesis, to alter the morphological and ultrastructural organization of embryonal masses at cellular level and to modify the carbohydrate, protein, or amino acid contents. The first SE initiation experiments were carried out at moderate and high temperatures for periods of different durations prior to transfer to the control temperature of 23°C. Cultures initiated at moderate temperatures (30°C, 4 weeks and 40°C, 4 days) showed significantly lower initiation and proliferation rates than those at the control temperature or pulse treatment at high temperatures (50°C, 5 min). No significant differences were observed either for the percentage of embryogenic cell lines that produced somatic embryos, or for the number of somatic embryos per gram of embryonal mass. Based on the results from the first experiments, initiation was carried out at 40°C 4 h; 50°C, 30 min; and a pulse treatment of 60°C, 5 min. No significant differences were found for the initiation or number of established lines or for the maturation of somatic embryos. However, large morphological differences were observed in the mature somatic embryos. At the same time, changes observed at cellular level suggested that strong heat shock treatments may trigger the programmed cell death of embryogenic cells, leading to an early loss of embryogenic potential, and the formation of supernumerary suspensor cells. Finally, among all the differences observed in the metabolic profile, it is worth highlighting the accumulation of tyrosine and isoleucine, both amino acids involved in the synthesis of abiotic stress response-related secondary metabolites