Functional Analysis of Human Beta Defensin-1: Novel Insight into Its Role in Prostate Cancer

Prostate cancer is the second leading cause of cancer-related deaths in men in the United States. The molecular pathogenesis of this disease includes genetic alterations, infection, and exposure to inflammatory or dietary oxidants. Recently, research has focused on the role of host defense peptides in tumor immunity. Defensins, a highly conserved multigene family of proteins that possess antimicrobial and antiviral properties, play an essential role in innate and adaptive immunity. These peptides are categorized into alpha- and beta-defensins based upon the spacing and connection between the six conserved cysteine residues of the mature peptide. Human Beta Defensin-1 (hBD-1), an important component of the innate immune system, is frequently lost in malignant prostate tissue, while expression is maintained in adjacent benign regions. Several studies indicate there may be multiple tumor suppressor genes present within the 8p22-23 region in prostate carcinoma, an area where frequent genetic alterations occur. The high incidence of loss of hBD-1 expression in prostate cancer, along with its chromosomal location of 8p23.2, raised the possibility that it may play a role in tumor suppression. Our studies demonstrated that induction of hBD-1 expression results in significant changes in cell viability, membrane permeability, and the activation of caspase-mediated apoptosis in DU145 and PC3 human prostate cancer cell lines. However, no effect was observed following the induction of hBD-1 in LNCaP. To gain insight into the caspase-mediated cell death, we analyzed the activation of specific caspases within the intrinsic and extrinsic pathway following the induction of hBD-1 expression. In DU145 and PC3 prostate cancer cell lines the activation of both apoptotic pathways was observed, specifically the activation of caspases 3, 8 and 9. However, no caspase activation was observed in the LNCaP prostate cancer cell line. Although our studies suggest that within our expression system and employed methodologies, hBD-1 does not exhibit a \u27bystander effect\u27 on neighboring cells, the results indicate a possible upward trend suggesting that hBD-1 may exhibit a \u27bystander effect\u27 under different conditions than those used in this study. Collectively, this data indicates the loss of hBD-1 in the area surrounding prostate cancer cells may create an environment that promotes the progression of prostate cancer

Einfluss von lysosomalen Cysteinproteasen auf das Migrations-/Invasionsverhalten von Prostatakarzinomzelllinien

Die lysosomalen Cysteinproteasen (Cathepsine) wurden bereits bei verschiedenen Tumorentitäten untersucht und ihre Beteiligung bei der Tumorprogression, insbesondere der Tumorinvasion und der Metastasierung belegt. Während eine Überexpression der Cathepsine B und L nur bei invasiven Prostatakarzinomen zu beobachten ist, ist Cathepsin X auch in Präkanzerosen, einschließlich der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN), deutlich erhöht. Anders als bei Cathepsin B war zu Beginn der Arbeit über die Ursachen und Wirkung dieser erhöhten Cathepsin X-Expression nur wenig bekannt. Um festzustellen, ob Cathepsine Invasions- oder Migrationsprozesse beim Prostatakarzinom beeinflussen, wurde mittels der siRNA-Technologie ein transienter Knock-Down der Cathepsine X, B und L in der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 etabliert. Die Effizienz des Knock-Downs wurde durch qRT-PCR und ELISA verifiziert. Das invasive Potential und die Migrationsfähigkeit der Cathepsin-defizienten PC-3-Zellen wurde in vitro in Transwell-Kammersystemen analysiert. Es wurde eine deutliche Verringerung der Invasions-/Migrationsfähigkeit gegenüber der Kontrolle festgestellt. Dies deutet auf eine Rolle dieser Cathepsine bei Invasionsprozessen hin. Cathepsin B und L, die über endoproteolytische Aktivität verfügen, sind wahrscheinlich an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt. Da Cathepsin X nur Carboxypeptidaseaktivität besitzt, ist ein direkter Abbau der extrazellulären Matrix unwahrscheinlich. Erste Studien belegen, dass diese Protease auch nicht-proteolytische Funktionen hat, zum Beispiel als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen. Cathepsin X wird von einer Vielzahl verschiedener Zelltypen sezerniert und könnte an outside-in-Signalkaskaden durch Bindung an die Zelloberfläche beteiligt sein. Um die potentielle extrazelluläre Rolle von Cathepsinen in der Signaltransduktion zu untersuchen, wurden PC-3-Zellen mit den Cathepsinen X, B und L stimuliert. Daraufhin wurde die Aktivierung von Signaltransduktionswegen, die bekanntermaßen Zellproliferation, Zellmotilität und Zellüberleben beeinflussen, untersucht. Es zeigte sich, dass die Interaktion von Cathepsin X und B mit PC-3-Zellen zu einer Aktivierung des MAPK-Signalweges durch Phosphorylierung von ERK führt. Darüber hinaus wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression der Cathepsine X, B und L und dem Seneszenzverhalten von PC-3-Zellen untersucht. Hierfür wurden ß-Galaktosidasefärbungen und die Untersuchung der Seneszenzmarker p16, p21 und p53 durchgeführt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass nach einem transienten Knock-Down der Cathepsine X, B und L der Anteil der seneszenten Zellen steigt. Die Erkenntnis, dass Cathepsine auch in der Signaltransduktion und der zellulären Seneszenz eine Rolle spielen können, eröffnet für die Tumorforschung neue Ansatzpunkte, um effizientere Strategien zur Therapie des Prostatakarzinoms entwickeln zu können

Einfluss von lysosomalen Cysteinproteasen auf das Migrations-/Invasionsverhalten von Prostatakarzinomzelllinien

Die lysosomalen Cysteinproteasen (Cathepsine) wurden bereits bei verschiedenen Tumorentitäten untersucht und ihre Beteiligung bei der Tumorprogression, insbesondere der Tumorinvasion und der Metastasierung belegt. Während eine Überexpression der Cathepsine B und L nur bei invasiven Prostatakarzinomen zu beobachten ist, ist Cathepsin X auch in Präkanzerosen, einschließlich der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN), deutlich erhöht. Anders als bei Cathepsin B war zu Beginn der Arbeit über die Ursachen und Wirkung dieser erhöhten Cathepsin X-Expression nur wenig bekannt. Um festzustellen, ob Cathepsine Invasions- oder Migrationsprozesse beim Prostatakarzinom beeinflussen, wurde mittels der siRNA-Technologie ein transienter Knock-Down der Cathepsine X, B und L in der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 etabliert. Die Effizienz des Knock-Downs wurde durch qRT-PCR und ELISA verifiziert. Das invasive Potential und die Migrationsfähigkeit der Cathepsin-defizienten PC-3-Zellen wurde in vitro in Transwell-Kammersystemen analysiert. Es wurde eine deutliche Verringerung der Invasions-/Migrationsfähigkeit gegenüber der Kontrolle festgestellt. Dies deutet auf eine Rolle dieser Cathepsine bei Invasionsprozessen hin. Cathepsin B und L, die über endoproteolytische Aktivität verfügen, sind wahrscheinlich an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt. Da Cathepsin X nur Carboxypeptidaseaktivität besitzt, ist ein direkter Abbau der extrazellulären Matrix unwahrscheinlich. Erste Studien belegen, dass diese Protease auch nicht-proteolytische Funktionen hat, zum Beispiel als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen. Cathepsin X wird von einer Vielzahl verschiedener Zelltypen sezerniert und könnte an outside-in-Signalkaskaden durch Bindung an die Zelloberfläche beteiligt sein. Um die potentielle extrazelluläre Rolle von Cathepsinen in der Signaltransduktion zu untersuchen, wurden PC-3-Zellen mit den Cathepsinen X, B und L stimuliert. Daraufhin wurde die Aktivierung von Signaltransduktionswegen, die bekanntermaßen Zellproliferation, Zellmotilität und Zellüberleben beeinflussen, untersucht. Es zeigte sich, dass die Interaktion von Cathepsin X und B mit PC-3-Zellen zu einer Aktivierung des MAPK-Signalweges durch Phosphorylierung von ERK führt. Darüber hinaus wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression der Cathepsine X, B und L und dem Seneszenzverhalten von PC-3-Zellen untersucht. Hierfür wurden ß-Galaktosidasefärbungen und die Untersuchung der Seneszenzmarker p16, p21 und p53 durchgeführt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass nach einem transienten Knock-Down der Cathepsine X, B und L der Anteil der seneszenten Zellen steigt. Die Erkenntnis, dass Cathepsine auch in der Signaltransduktion und der zellulären Seneszenz eine Rolle spielen können, eröffnet für die Tumorforschung neue Ansatzpunkte, um effizientere Strategien zur Therapie des Prostatakarzinoms entwickeln zu können

Regulation of androgen receptor function by tyrosine phosphorylation

Androgen receptor (AR) re-activation under low androgen environment is the hallmark of castration resistant or hormone refractory prostate cancer (HRPC). Non-receptor tyrosine kinases phosphorylate AR in an androgen independent manner, and are thereby involved in HRPC. Herein, we investigated the role of Ack1 target phosphorylation sites (Tyr-267 and Tyr-363) on growth factor-regulated AR phosphorylation as well as AR transcriptional and functional activity. Both Tyr-267 and Tyr-363 have a critical role for ligand-dependent and -independent control of activity of AR. Treatment of LNCaP cells overexpressing full length or truncated AR (missing the ligand binding domain (LBD) with epidermal growth factor (EGF), heregulin, or Gas6 (ligand binding to Mer receptor tyrosine kinase and activating Ack1 downstream) induced AR phosphorylation at Tyr-267 and that phosphorylation was lost in the AR-Y267F mutant protein. The full length (FL) AR overexpressing cells proliferated strongly without androgen treatment and they reached optimal growth at a lower dose of DHT treatment (0.1 nM DHT). However, cells expressing full- or -truncated AR-Y267F mutant did not show androgen-independent proliferation and did not respond to androgen treatment. Overexpression of the Y267F mutant within full length- or truncated-AR showed significant reduction in soft agar colony formation, compared to the AR-WT. The extent of reduction in colony formation of Y363F AR expressing cells was moderate, but not as much as Y267F. The analysis of AR subcellular localization by both immunoblotting and immunofluoresence assays suggested that mutating the Tyr-267 site impaired both androgen-dependent and -independent nuclear translocation, compared to the AR-WT. Global gene expression profiling analysis demonstrated that there were no common genes regulated by both full length AR and AR-Y267F, suggesting that mutating Tyr-267 has a significant impact on not only AR dependent target gene expression but also global gene expression of LNCaP cells. Taken together, the results of our study demonstrate that tyrosine kinase target phosphorylation sites are important for both ligand-dependent and ligand-independent activity of AR protein. Targeting upstream tyrosine kinases and the N terminal domain of AR in truncated AR missing LBD may expand the repertoire of therapeutics for combating prostate cancer

An Integrated Bioinformatics Approach for the Identification of Melanoma-Associated Biomarker Genes. A Ranking and Stratification Approach as a New Meta-Analysis Methodology for the Detection of Robust Gene Biomarker Signatures of Cancers.

Genome-wide microarray technology has facilitated the systematic discovery of diagnostic biomarkers of cancers and other pathologies. However, meta-analyses of published arrays using melanoma as a test cancer has uncovered significant inconsistences that hinder advances in clinical practice. In this study a computational model for the integrated analysis of microarray datasets is proposed in order to provide a robust ranking of genes in terms of their relative significance; both genome-wide relative significance (GWRS) and genome-wide global significance (GWGS). When applied to five melanoma microarray datasets published between 2000 and 2011, a new 12-gene diagnostic biomarker signature for melanoma was defined (i.e., EGFR, FGFR2, FGFR3, IL8, PTPRF, TNC, CXCL13, COL11A1, CHP2, SHC4, PPP2R2C, and WNT4). Of these, CXCL13, COL11A1, PTPRF and SHC4 are components of the MAPK pathway and were validated by immunocyto- and immunohisto-chemistry. These proteins were found to be overexpressed in metastatic and primary melanoma cells in vitro and in melanoma tissue in situ compared to melanocytes cultured from healthy skin epidermis and normal healthy human skin. One challenge for the integrated analysis of microarray data is that the microarray data are produced using different platforms and bio-samples, e.g. including both cell line- and biopsy-based microarray datasets. In order to address these challenges, the computational model was further enhanced the stratification of datasets into either biopsy or cell line derived datasets, and via the weighting of microarray data based on quality criteria of data. The methods enhancement was applied to 14 microarray datasets of three cancers (breast, prostate, and melanoma) based on classification accuracy and on the capability to identify predictive biomarkers. Four novel measures for evaluating the capability to identify predictive biomarkers are proposed: (1) classifying independent testing data using wrapper feature selection with machine leaning, (2) assessing the number of common genes with the genes retrieved in independent testing data, (3) assessing the number of common genes with the genes retrieved in across multiple training datasets, (4) assessing the number of common genes with the genes validated in the literature. This enhancement of computational approach (i) achieved reliable classification performance across multiple datasets, (ii) recognized more significant genes into the top-ranked genes as compared to the genes detected by the independent test data, and (iii) detected more meaningful genes than were validated in previous melanoma studies in the literature

Rôle de l'endogline et de la protéine kinase c-tak1 dans le cancer de la prostate

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal