Correction of the ion transport defect in Cystic Fibrosis by small molecules

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Cystic fibrosis (CF) is the most common life-shortening genetic disorder amoung Caucasians, affecting about 1 in 2500-6000 live births and with a carrier frequency of 1 in 25 individuals. More than 1900 CF mutations have already been reported on the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene, but one single mutation, named F508del, is responsible for 70% of CF chromosomes worldwide. CFTR is expressed at the apical membrane of epithelial cells to control salt and water transport. Clinically, CF is characterized by multiple manifestations in different organs, but is dominated by the respiratory disease, the main cause of morbidity and mortality. Bacterial infections, especially by Pseudomonas aeruginosa, cause inefficient mucociliary clearance, originating thick mucus, and recurrent infections give rise to an exacerbated inflammatory response contributing to impairment of respiratory function and ultimately to death. Other CF classical symptoms include exocrine pancreatic insufficiency (85%), intestinal obstruction (meconium ileus in 15-20% of CF newborns and/or distal intestinal obstruction syndrome at a later age), elevated sweat electrolytes and male infertility (95%). Besides this classic picture of the CF disease, there is a minority of patients presenting non-classic phenotypes and being diagnosed from child to adulthood. Moreover the increasing numbers of asymptomatic patients identified in recent newborn CF screens have posed major challenges to clinicians for the establishment of CF diagnoses, prognosis and adequacy of therapeutics. High-throughput screens have identified several novel small molecules with potential to treat the basic defect in CF and some are starting hit the clinical setting. These include correctors (like VX-661 and VX-809-Lumacaftor, both in Phase IIb clinical trial) that partially rescue the trafficking defect of F508del-CFTR, and a potentiator (like VX-770-, Ivacaftor (FDA-approved drug) that corrects the gating defect of G551D-CFTR, which underwent pre-clinical validation in CF airway primary cultures. However, to accelerate the entry of novel compounds into the clinic, the respective mechanism of action should be established, which usually requires studies in cellular systems with heterologous expression. Comparative efficacy assessment between heterologous expression systems and airway primary cutures/native human tissues is thus of the ultimate importance before CFTR modulators reach the clinical setting. In the first part of this work, we aimed to further establish measurement of CFTR function as a sensitive and robust biomarker for diagnosis and prognosis of CF. To this end, we assessed cholinergic and cAMP-CFTR-mediated Cl- secretion in 524 freshly excised rectal biopsies from 118 individuals, including patients with confirmed CF clinical diagnosis (n=51), individuals with clinical CF suspicion (n=49) and age-matched non-CF controls (n=18). Conclusive measurements were obtained for 96% of cases. Patients with "Classic CF", presenting earlier onset of symptoms, pancreatic insufficiency, severe lung disease and were found to lack CFTR-mediated Clsecretion (≤5%). Individuals with milder CF disease presented residual CFTRmediated Cl- secretion (10-57%), and non-CF controls show CFTR-mediated Clsecretion above 30-35%. Moreover, this data was well correlated with various clinical parameters and proved to be the best discriminator among Classic/Non-Classic CF and non-CF groups. Determination of CFTR-mediated Cl- secretion in rectal biopsies is demonstrated here to be a sensitive, reproducible and robust predictive biomarker for the diagnosis and prognosis of CF. In the second part, our goals were: first, to evaluate technical aspects of this procedure regarding the viability of the rectal specimens for ex vivo bioelectrical and biochemical laboratory analyses; and secondly, to evaluate the overall assessment (comfort, invasiveness, pain, sedation requirement, etc) of the rectal biopsy procedure from the patients perspective, in order to assess its feasibility as an outcome measure for (pre-)clinical trials. Regarding the technical aspects of biopsing, we compared three solutions for bowel preparation (NaCl 0.9%, glycerol 12% and oral mannitol), and two biopsy forceps (standard and jumbo) in 580 rectal specimens. As to the assessment of the overall rectal biopsy procedure, telephone surveys were applied to 75 individuals. Our data shows that disruption and friability of the specimens obtained correlate with their transepithelial resistance and are also influenced by the solution used for bowel preparation and biopsy forceps, with NaCl 0.9% proving to be the most compatible with the analysis and jumbo the best forceps. The great majority of the individuals (76%) did not report high levels of discomfort due to the short time (max 15 min) and relatively painless procedure (79%). Moreover, this procedure was shown to be well tolerated by patients with or without sedation: most (53%) accept repeating it four more times, demonstrating the feasibility of the current approach as an outcome measure for (pre-)clinical trials. Finally, in the last chapter of this thesis we proposed to evaluate the impact of different small molecules correctors and potentiators on CFTRprotein maturation and Cl- channel activity in heterologous cellular systems, so as to better understand their mechanism of action; and also to comparatively determine efficacy of those compounds in modulating CFTR activity in those systems and directly in primary cultures of human airway cells/and in native human tissues ex vivo. Functional data for F508del-CFTR rescue by iodide efflux on heterologous systems (BHK cells) shows that VRT- 325, C4a, VRT-640 and VRT-532 are all able to rescue CFTR function to at varying levels (26, 33, 19 and 35%, respectively of wt-CFTR function), with both VRT-325 and C4a having additive effects to the low temperature. On polarized F508del-transduced CFBE cells, VRT-325 and C4a treatment resulted 3.32 and 8.5% in CFTR function, respectively, relative to wt-CFTR monolayer cells. In contrast, preliminary data resulting from the functional analysis conducted in primary airway cells indicates that the efficiency of the correctors VRT-325 and C4a is reduced (4.18% and 3.16% of wt-CFTR function, respectively). Remarkably, VX-809 treatment resulted in a ~5.7-fold increase in CFTR-mediated Cl- secretion, which represents a recovery of ~16% of the CFTR function observed in primary non-CF HBE monolayers cells. Preliminary results in biopsies from F508del/F508del and F508del/G542X patients did not provide evidence for a clear effect for VRT-325 and nor C4a correctors, but showed a modest effect for a novel corrector compound (TS-01- 02-D8) which we recently identified. All together, these results suggest that the effects of a given compound in rescuing F508del-CFTR activity in heterologous systems are poorly predictive of its rescuing capacity in native tissues, which indicates that further pre-clinical validation in native tissues ex vivo is highly recommended.A Fibrose Quística (FQ) e a doença autossómica recessiva letal mais comum na população Caucasiana, afectando cerca de 1 em 2500-6000 nados vivos, dependendo da região geográfica, e com uma frequência de portadores de 1 em cada 25 indivíduos. Esta doença e causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) localizado no cromossoma 7. Até à data, foram já descritas mais de 1900 mutações neste gene. No entanto, uma única mutação denominada por F508del (representando a deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína) é responsável por 70% dos cromossomas FQ mundiais. A proteína CFTR e expressa na membrana apical das células epiteliais onde funciona como um canal de cloreto (Cl-), regulando o transporte de sais e de água. Clinicamente, a FQ é caracterizada por múltiplas manifestações em diferentes órgãos, sendo contudo a doença a nível pulmonar a principal causa de morbilidade e mortalidade. A desidratação das vias respiratórias e a produção de secreções brônquicas extremamente viscosas devido a infecções bacterianas de repetição e persistentes, levam a um transporte/limpeza mucociliar ineficiente o que resulta na obstrução das glândulas exócrinas e, consequentemente, das vias respiratórias. Estas infecçoes bacterianas contribuem ainda para uma resposta inflamatória exacerbada que, por sua vez, origina o agravamento da insuficiência respiratória e, finalmente, a morte. Outros sintomas clássicos da FQ incluem insuficiência pancreática exócrina (85%), obstrução intestinal (íleo meconial em 15-20% dos recém-nascidos e/ou síndrome de obstrução intestinal distal na idade adulta), infertilidade masculina (95%) e concentração elevada de electrólitos no suor (característica utilizada no principal teste de diagnóstico). A apresentação dum quadro clínico grave, em conjunto com a demonstração de que a proteína CFTR e disfuncional, no geral, através de dois testes do suor alterados ou da detecção de duas mutações no gene CFTR, permitem o diagnóstico da maioria dos doentes ainda na primeira infância. No entanto, nem todos os doentes apresentam este quadro clássico da doenca, existindo um grupo de doentes que apresenta fenótipos não-clássicos, resultando no seu diagnóstico tardio, o que pode prejudicar o seu tratamento. Mais recentemente, os números crescentes de doentes FQ assintomáticos, identificados através dos programas de rastreio neonatal, têm colocado grandes desafios clínicos no que toca ao estabelecimento do diagnóstico FQ definitivo, prognóstico e adequadas estratégias terapêuticas. E crucial implantar um método que permita discriminar estes dois grupos de doentes através do seu diagnóstico diferencial. A FQ apesar de todos os avanços clínicos e científicos é actualmente ainda uma doença letal, sendo a esperança média de vida acima dos 25 anos. Felizmente, nos últimos anos tem vindo a ser identificadas, em screens de alto rendimento, diversas pequenas moléculas com potencial terapêutico para corrigir o defeito básico na FQ estando já algumas aprovadas para uso clinico. Como exemplo, existem: i) os compostos “correctores” como o VX-661 e o VX- 809-Lumacaftor (ambos em ensaio clínicos de fase IIb) que visam corrigir os defeitos básicos de folding e tráfego da proteína mutada, F508del-CFTR; e b) os compostos “potencializadores” (como o VX-770-Ivacaftor (recentemente aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), nos Estados Unidos da América) que pretendem restaurar o defeito de gating do canal de Cl- mutado, G551D-CFTR. Para poderem entrar em ensaios clínicos, todos estes compostos sofreram uma pré-validação clínica em culturas primárias de células epiteliais brônquicas humanas. No entanto, para acelerar a entrada de novos compostos em ensaios clínicos, os respectivos mecanismos de acção destas moléculas deverão ser determinados, o que, regra geral, exige estudos em sistemas celulares de expressão heteróloga. Deste modo, estudos que pretendam comparar a avaliação da eficácia destes compostos em sistemas de expressão heteróloga e em culturas primárias ou em tecidos nativos humanos são da máxima importância. A primeira parte deste trabalho procura consolidar a medição da função do canal CFTR como um marcador biológico sensível e robusto para o diagnóstico e prognóstico da doença FQ. Para este fim, avaliaram-se as secreções de Cl- através da CFTR com estimulação colinérgica e mediada pelo AMP cíclico (cAMP) em 524 biópsias rectais de 118 individuos. Este estudo incluiu pacientes com diagnostico clinico de FQ (n = 51), indivíduos com suspeita clínica de FQ (n = 49) e indivíduos controlos não-FQ (n = 18). No decorrer do estudo, foram obtidos resultados bioeléctricos conclusivos para 96% dos casos. Nos doentes clinicamente caracterizados com a forma clássica da doença, ou seja, apresentando um início mais precoce dos sintomas clínicos, insuficiência pancreática e doença pulmonar grave, observou-se uma ausência de secreção de Cl- mediada pela CFTR ou apenas existência de níveis muito baixos (≤ 5%). Para os indivíduos que apresentavam uma doença mais suave (não-clássica) e um diagnóstico mais tardio, foi possível a detecção de uma secreção de Cl- residual mediada pela CFTR (10-57%) e, no que diz respeito aos indivíduos controlo nao-FQ, a secreção de Cl- mediada pela CFTR situou-se acima dos 30-35%. Mais ainda, estes dados bioeléctricos evidenciaram boas correlações com os diversos parâmetros clínicos estudados, demonstrando constituir o melhor discriminador entre as formas clássica e não clássica da doença e estes e os indivíduos não-FQ. Assim, podemos concluir que a determinação da secreção de Cl- mediada pela CFTR em biópsias rectais e um marcador biológico sensível, reprodutível e robusto, e ainda preditivo prognóstico da FQ. O foco da segunda parte deste trabalho doutoral foi, por um lado, avaliar os aspectos técnicos deste procedimento em relação a viabilidade das amostras rectais para a realização das análises laboratoriais bioeléctricas e bioquímicas ex vivo; e, por outro lado, avaliar globalmente o procedimento de sigmoidoscopia para recolha da biópsia rectal (conforto, grau de invasão, dor, requisito de sedação, etc) sob a perspectiva do paciente, com o objectivo último de estimar a sua viabilidade como forma para avaliar a eficácia terapêutica de novas pequenas moléculas em ensaios (pré-)clínicos. Quanto aos aspectos técnicos deste procedimento, foram comparadas três soluções para a preparação intestinal (cloreto de sódio 0,9%, glicerol 12% e manitol oral) e duas pinças de biópsia (padrão e jumbo) em 580 biópsias rectais. Os dados recolhidos mostram que a integridade e friabilidade dos tecidos obtidos esta correlacionada com a sua resistência transepitelial, ou seja, com a sua viabilidade, sendo que quanto maior a integridade e menor friabilidade da biópsia, maior a resistência observada. Estas características dos tecidos colhidos são influenciadas pela solução utilizada durante a preparação intestinal e pinça de biópsia, sendo a preparação com cloreto de sódio e a pinça jumbo as que permitem uma maior viabilidade do tecido, logo mais compatíveis com a análise bioeléctrica . Quanto a avaliação global do procedimento de colheita da biópsia rectal, foram feitas entrevistas telefónicas a 75 indivíduos que tinham sido submetidos ao procedimento de sigmoidoscopia e colheita de biópsia. A grande maioria dos indivíduos (76%) nao relatou níveis elevados de desconforto devido ao curto período de tempo requerido (máximo 15 minutos) e ao facto deste procedimento ser praticamente indolor (79%). Além disso, este exame mostra ser bem tolerado pelos pacientes com ou sem sedação visto que maioria dos entrevistados (53%) aceitam repeti-lo mais quatro vezes, demonstrando a viabilidade desta abordagem como uma ferramenta para medir em ensaios (pré-) clínicos, a eficácia de novas moléculas com potencial terapêutico para a FQ. Finalmente, no último capítulo desta tese, avaliou-se o impacto de diferentes pequenas moléculas correctoras e potencializadoras da maturação e função da proteína CFTR mutada em sistemas celulares de expressão heteróloga, de modo a compreender melhor seu mecanismo de acção. Os dados funcionais resultantes da técnica de efluxo de iodeto em células BHK (sistema de expressão heteróloga) que expressam estavelmente a proteína mutante, F508del-CFTR, mostram que os compostos VRT-325, C4a, VRT-640 e VRT-532 são capazes de resgatar a função CFTR em níveis diferentes: 26, 33, 19 e 35% da função observada em wt-CFTR, respectivamente. Verificou-se ainda que tanto o VRT-325 como o C4a tem efeitos aditivos ao tratamento com baixa temperatura. Fez-se também uma análise comparativa da eficácia de tais compostos na actividade moduladora da CFTR em sistemas heterológos, em culturas primárias de células brônquicas humanas e em tecidos nativos (biopsias rectais). Em celulas CFBE transduzidas com um vector viral que expressa o mutante F508del-CFTR e polarizadas, o tratamento com os compostos VRT-325 e C4a resultou na correcção de 3.32 e 8,5% da função observada em wt-CFTR, respectivamente. Em contraste, os dados preliminares resultantes da análise funcional em células primárias do epitélio brônquico indicam que a eficiência dos correctores VRT-325 e C4a é reduzida neste sistema (4.18% e 3.16% da função observada em wt-CFTR, respectivamente). Notavelmente, o tratamento com o corrector VX-809-Lumacaftor resultou num aumento de cerca de 6 vezes da secreção de Cl- mediada pela CFTR relativamente a células CFBE F508del-CFTR controlo, este valor representa uma recuperação de ~16% da função da proteína CFTR observada em células primárias brônquicas não-FQ. No que diz respeito às medições da secreção de Cl- mediada pela CFTR em biópsias rectais de pacientes F508del/F508del e F508del/G542X, os resultados preliminares desta pesquisa não evidenciam um efeito claro dos correctores VRT-325 e C4a, mas mostram um efeito modesto para um outro composto corrector (TS-01-02-D8), recentemente identificado noutros estudos realizados no nosso laboratório. Os resultados apresentados para os compostos aqui estudados sugerem que a análise da correcção da actividade da proteína mutante F508del-CFTR como canal de Clem em sistemas heterólogos se revela pouco preditiva da sua capacidade real de restaurar esta função em culturas primárias e em tecidos nativos. Indicando, assim que a validação pré-clínica dos moduladores do canal CFTR em tecidos nativos (ex vivo) é de extrema importância para a avaliação correta do seu potencial interesse terapêutico. No global, o trabalho realizado nesta tese doutoral permitiu validar técnica de análise funcional da proteína CFTR como canal de cloreto em biópsias rectais com meio de diagnóstico discriminante e correcto prognóstico da doença FQ. Esta técnica revela-se ainda de grande interesse para a validação pré-clínica de terapias com novas moléculas com potencial para corrigir ou potencializar a função da CFTR em doentes FQ. Em conjunto, estes resultados poderão no futuro permitir um diagnóstico correcto da FQ e antecipar a validação de novas formas eficazes de terapia, o que tem uma importância crucial para a escolha da terapêutica mais eficaz e, consequentemente, para a melhoria de vida dos doentes com FQ.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT,SFRH/BD/35936/2007); Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER

Investigation of LANA: a human virus tumor gene

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is one of the seven recognized human tumor viruses. It is the etiologic agent underlying Kaposi sarcoma, primary effusion lymphoma and multicentric Castleman’s disease. This gammaherpesvirus establishes a lifelong persistence infection in the host and displays a lifecycle with two distinct phases: a short productive lytic phase and a prolonged latent phase. Latency-associated nuclear antigen (LANA) is the major latent gene and is strongly expressed in all forms of KSHV-associated malignancies. LANA mediates episomal replication, segregation and persistence, which is required for long-term maintenance of viral DNA. LANA proteins are also modulators of transcription through E3-ubiquitin ligase activity. Ubiquitination is an essential regulatory mechanism in eukaryotes, controlling a wide range of cellular pathways, including protein degradation. KSHV, like other viruses, has evolved mechanisms to hijack protein degradation pathways in order to establish an environment that favors its propagation. LANA protein has a bipartite SOCS-box motif divided into a Cullin-box and a BC-box located within its C-terminal and N-terminal regions, respectively. The BC-box interacts with an Elongin C and establishes a LANA-Elongin BC complex, which associates with a Cullin/Rbx1 module thus reconstituting a complex protein with E3 ubiquitin-ligase activity. This complex protein assembles an EC5S ubiquitin ligase, which enables the virus to hijack the E3 ligase components of the cell, thus modulating the ubiquitination pathway of its host. In this project, by taking advantage of the MHV68 in vivo model to study KSHV pathogenesis, chimeric viruses with engineered mutations within the BC-box were generated in order to assess the importance of the BC-box motif within the kLANA N-terminal region. Results showed that mutations within kLANA BC-box neither affect protein expression or viral growth in vivo and viral lytic phase in the lungs was not significantly affected. Latency results were not conclusive and therefore the importance and role of kLANA BC-box is still unclear and viral phenotypes need to be reassessed.Os herpesvírus pertencem à grande família de vírus, Herpesviridae e distinguem-se pela sua capacidade de infetar uma enorme variedade de hospedeiros. Até à data, foram identificados oito herpesvírus capazes de infetar humanos e estima-se que quase toda a população adulta esteja infetada por pelo menos um dos vírus pertencentes a esta família. Os os herpesvírus humanos são capazes de se adaptar ao meio intracelular do hospedeiro e escapar ao seu sistema imunitário estabelecendo uma infeção crónica que pode permanecer em estado de latência durante toda a vida do hospedeiro. No entanto, estes vírus normalmente não são causadores de doenças graves, a não ser que o sistema imunitário do hospedeiro esteja extremamente debilitado. A família Herpesviridae pode ser dividida em 3 subfamílias: alfa, beta e gama. E, tendo em conta os vírus capazes de infetar humanos, a família alfa inclui os herpesvirus simplex (HHV-1 e HHV-2) e o vírus varicela-zóster (HHV-3). Os herpesvírus pertencentes à subfamília beta são o citomegalovírus (HHV-5), HHV-6 (variantes A e B) e ainda o HHV-7. Finalmente, os membros da família gama são o vírus Epstein-Barr (HHV-4) e o herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (HHV-8) e são associados a alguns tipos de doenças cancerígenas. Estes vírus são capazes de induzir a proliferação de células B infetadas através de reações que ocorrem no centro germinativo e expandir a latência viral às células B de memória, que são o maior reservatório de latência dos gamaherpesvírus. Em particular, o herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV), um dos sete vírus causadores de cancro até hoje conhecidos, evoluiu no sentido de perturbar os mecanismos celulares normais do hospedeiro como o crescimento celular, a apoptose e até mesmo o sistema imunitário bem como as respostas antivirais. Esta contínua desregulação celular ao longo dos anos pode eventualmente levar ao desenvolvimento de doenças neoplásticas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. Sabe-se que o KSHV é o agente etiológico responsável pelo linfoma primário de efusão primário, pela doença de Castleman multicêntrica e pelo sarcoma de Kaposi, que é o tipo de cancro mais comum em pacientes infetados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O ciclo de vida do KSHV, tal como os outros herpesvírus, pode ser distinguido em duas fases distintas: uma fase lítica e uma fase de latência. Após a infeção inicial, os genes de ambas as fases são expressos mas após alguns ciclos de replicação viral, a fase lítica decresce e a fase de latência é estabelecida. Para que o genoma viral se mantenha nas células em divisão, o epissoma viral associa-se às histonas e estabelece-se como um cromossoma extra no núcleo 4 das células infetadas com expressão genética muito limitada. Esta reduzida expressão genética ajuda o vírus a escapar ao sistema imunitário do hospedeiro e ao mesmo tempo garante a sua sobrevivência e persistência viral. Uma das principais características deste tipo de vírus é sua capacidade de persistir no hospedeiro através da manutenção da latência viral, o que requer proteínas virais e celulares. Cerca de 90% das células infetadas possui o programa genético necessário à manutenção da latência viral. O programa de latência traduz-se num locus, onde são expressos vários genes que codificam para proteínas essenciais à latência viral, tal como a LANA (Latency-associated Nuclear Antigen). A LANA é considerada a proteína responsável pela persistência viral e, consequentemente pela latência viral. É uma proteína multifuncional, sendo maioritariamente responsável pela segregação, replicação e manutenção do epissoma. No entanto, a LANA pode também interferir com os mecanismos de transcrição e interagir com diversas proteínas celulares e interferir com os mecanismos anti-tumorais do hospedeiro. A LANA, atuando como uma ubiquitina ligase E3, é capaz de regular a transcrição e sinalizar para degradação proteossomal supressores tumorais tais como o von Hippel-Lindau (VHL), o p53 ou ainda o nuclear factor-kappa B (NF-B). A ubiquitinação está presente em todas as células eucarióticas e é um mecanismo regulatório essencial no ciclo celular, na apoptose, na endocitose ou ainda na resposta imunitária. Sendo assim, o KSHV, desenvolveu mecanismos com o objetivo de modular o seu funcionamento a seu favor. A ubiquitinação é um processo que ocorre através de uma cascata enzimática constituída por 3 enzimas: E1 (enzima ativadora da ubiquitina), E2 (enzima conjugadora) e E3 (ubiquitina ligase). Numa primeira etapa há a ligação da ubiquitina à E1 que, depois de ativada, é transferida para uma E2 que, juntamente com uma E3, transferem a ubiquitina para o substrato proteico para que seja degradado via proteossoma. A enzima E3 parece ser a responsável pelo reconhecimento específico do substrato e existem vários tipos de E3, tal como as Ellongin BC-Cullin5-SOCS (EC5S). As EC5S são complexos proteicos constituídos por várias subunidades, incluindo uma Cullin5 que se liga a uma Rbx1, formando assim o módulo Cullin 5-Rbx1, um heterodímero Elongin BC e uma proteína de reconhecimento de substrato SOCS (supressor of cytokine signaling). Todas as proteínas SOCS possuem uma homologia de sequência de 40 aminoácidos conservada – motivo SOCS-box. Este motivo SOCS-box é o responsável pela interação entre a Elongin BC e a Cullin5, estabelecendo a ligação entre o substrato de ubiquitinação e a E2. O complexo Elongin BC é um regulador positivo da RNA polimerase II e possui duas subunidades reguladoras (B e C). Este complexo desempenha um papel importante na regulação da transcrição e ainda ajuda a estabelecer a ligação entre as proteínas SOCS e as Cullin 5. Curiosamente, a proteína viral LANA possui uma SOCS-box 5 bipartida: BC-box + Cullin-box, localizadas na região C-terminal e N-terminal da proteína, respetivamente. Esta sequência proteica BC-box interage com uma Elongin C e estabelece um complexo proteico LANA-Elongin BC, que por sua vez ao ligar-se a um complexo Cullin5/Rbx reconstitui o complexo proteico: Ellongin BC-Cullin5-SOCS. Este complexo assemelha-se ao EC5S, funcionando como uma ubiquitina ligase, modulando os mecanismos de ubiquitinação do hospedeiro a favor do vírus. A infeção causada pelo KSHV é naturalmente limitada a humanos, por isso é muito importante o estabelecimento de um modelo animal de infeção para que o seu mecanismo de patogénese viral possa ser estudado in vivo. Visto que o herpesvirus murídeo 68 (MHV68), um vírus endémico que infeta o rato-do-campo Europeu e é capaz de infetar ratinhos de laboratório (Mus musculus), partilha alguma homologia de sequência genómica com o KSHV e codifica uma proteína homóloga à LANA do KSHV (mLANA), pode ser utilizado para a infeção de ratinhos de laboratório, providenciando um excelente modelo de estudo para o KSHV. A mLANA também possui uma região C-terminal, é expressa nas células B do centro germinativo e está envolvida na persistência do epissoma viral. Por último, a mLANA também é capaz de regular a transcrição genómica através de um complexo proteico EC5S, que é mediado por uma “SOCS-box” viral que partilha alguma homologia com a SOCS-box presente na kLANA. Neste projeto, tirando partido do modelo de infeção já estabelecido no laboratório, foram gerados vírus quimera (v-kLANA Elo-BC 46 e v-KM Elo-BC 34) com mutações na BC-box da kLANA (T212A, L213A, N214A, P215A, I216A, C217A) com o objetivo de avaliar a importância deste motivo na patogénese viral in vivo. O v-kLANA é um vírus quimera em que a mLANA foi substituída pela kLANA completa, incluindo a sua região 5´UTR e o v-KM é um vírus quimera que contém uma proteína de fusão entre a kLANA e a mLANA, ou seja, possui a kLANA mas com a região C-terminal da mLANA. Após mutagénese e reconstituição dos vírus quimera mutantes, 80 ratinhos foram divididos em 4 grupos distintos de infeção e inoculados com o vírus correspondente: 2 grupos com os vírus controlo (v-kLANA e v-KM) e 2 grupos com os vírus mutantes (v-kLANA Elo-BC 46 e v-KM Elo-BC 34). Aos dias 5, 7 e 10 pós infeção os ratinhos foram sacrificados e os pulmões foram devidamente extraídos e aos dias 10, 14 e 21 pós infeção os baços foram cirurgicamente removidos, post mortem. Após o processamento dos pulmões e baços, foi possível calcular os títulos virais na fase lítica e latente, respetivamente, e ainda averiguar o número de células positivas nos baços para DNA viral. Os resultados demonstraram que as mutações inseridas na BC-box da kLANA não afetaram a expressão proteica e, no geral, também não afetaram a fase lítica do vírus nos pulmões. Estes resultados permitem concluir que os vírus mutantes v-kLANA Elo-BC 46 e v-KM 6 Elo-BC 34 são ambos viáveis. No entanto, os resultados in vivo não permitiram tirar conclusões acerca da importância e possível função da BC-box na latência, o que significa que estudos futuros terão de ser feitos no sentido de confirmar ou refutar os fenótipos virais descritos neste projeto.KSHV;LANA;;u;SOCS-box motif;BC-box;Cullin-box;EC5S ubiquitin ligas

Comparison between aerobic power parameters at different time-averaging intervals in swimming: An update

Sousa et al. (Open Sports Sci J, 3: 22 – 24, 2010) showed that different time averaging intervals lead to distinct VO2 values in a maximal 200m front crawl effort, evidencing higher VO2 values for breath-by-breath sampling, and differences between this latter data acquisition and all the other less frequent time intervals studied (5, 10, 15 and 20 s). These are interesting outputs in the field of exercise physiology applied to swimming once: (1) VO2 assessment is conducted in a swimming pool with a portable gas analyser which allowed breath-by-breath measurements, and not in a swimming flume with a Douglas bag technique or mixing chamber analyser, as traditionally occurs, and (2) the comparison between different time-averaging intervals used to remove breath-by-breath fluctuations during exercise periods has remained neglected, in sport in general and swimming in particular. Therefore, in the present study, we investigate the influence that different time averaging intervals have in aerobic power related parameters (VO2peak and VO2max). Ten subjects performed 200m front crawl effort at supra-maximal intensities (all-out test) and other ten subjects performed 200m front crawl effort at maximal aerobic intensities (100% of VO2max).The intensity at which the 200m front crawl was performed (supra-maximal and maximal intensities) had a significant effect on VO2peak and VO2max values obtained for each averaging intervals studied.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Programmed DNA damage as a new tool to regulate gene activation

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Sendo considerada a unidade básica da vida, a célula constitui o nível mais baixo de organização a que o organismo pode ser reduzido mantendo as características da vida. Os organismos multicelulares, tal como os conhecemos, são constituídos por diferentes tipos de células que comunicam entre si de forma a assegurar o normal funcionamento dos mesmos. Esta extensa e complexa rede de conexões, quando devidamente regulada, garante a manutenção da homeostasia necessária para a sobrevivência dos organismos. Toda esta organização funcional é ditada pela informação que se encontra codificada na longa molécula de 2 metros que se encontra confinada ao núcleo da célula eucariótica, o DNA. No entanto, para que a célula tenha acesso a essa informação, várias maquinarias moleculares trabalham em conjunto no sentido de copiar e traduzir a informação presente na molécula de DNA para uma “linguagem” percetível à célula. Este processo é definido de expressão génica. A expressão génica é um processo complexo e altamente regulado que define a identidade das diferentes células e tecidos que constituem o organismo. Sendo constituída por uma sequência ordenada de eventos, a expressão génica consiste, maioritariamente, em duas etapas principais: a transcrição, onde a informação codificada na molécula de DNA é transferida para a molécula de RNA, ou mais especificamente para o RNA mensageiro no caso de genes que codificam proteínas; e a tradução, etapa na qual a informação presente no RNA mensageiro é traduzida para uma sequência de aminoácidos dando origem às proteínas. Para o início da transcrição diversas proteínas regulatórias, nomeadamente fatores de transcrição, têm de ser sequencialmente recrutadas, juntamente com a RNA polimerase (do tipo II, no caso da transcrição de genes codificadores de proteínas), para o promotor do gene alvo. O recrutamento destes componentes, que está dependente da existência de sequências de reconhecimento específicas presentes na região promotora do gene, permite a formação de um complexo de pré-iniciação funcional, sendo este essencial para o início da transcrição. No entanto, alguns constrangimentos estruturais podem impedir a formação do referido complexo. Como referido anteriormente, o DNA é uma molécula bastante longa que, nas células eucarióticas, se encontra empacotada dentro de um pequeno compartimento, o núcleo. De forma a acomodar-se dentro deste, evitando a formação de nós ou emaranhados, várias proteínas, designadas de histonas, interagem com a molécula de DNA, compactando-a sob a forma de cromatina. Dependendo dos diferentes graus de compactação que pode assumir, a cromatina é um importante fator de regulação de vários processos biológicos que requerem acesso ao DNA, tais como a replicação, a reparação do DNA e a transcrição. Por exemplo, durante a transcrição, o reconhecimento, por parte dos fatores de transcrição, das suas sequências específicas de ligação presentes no DNA pode ser impedido pela estrutura compacta da cromatina. Sendo assim, e de forma a facilitar a acessibilidade de diversos fatores ao DNA, as células desenvolveram algumas estratégias que permitem a remodelação da estrutura da cromatina, nomeadamente através de modificações pós-traducionais de histonas e da atividade de complexos remodeladores de cromatina. Desta forma, o controlo da estrutura dinâmica da cromatina permite a montagem do complexo de pré-iniciação que, na ausência de outras adversidades, leva à transcrição produtiva do gene alvo. Como é possível perceber, a expressão génica é um processo vital à vida, sendo que qualquer perturbação à coordenada cascata de eventos que a constituem pode resultar em consequências devastadoras. Danos no DNA são um dos fatores responsáveis pela alteração da expressão dos genes afetados. Durante o seu período de vida, o genoma de uma célula é sujeito a vários tipos de dano. Na realidade, acredita-se que, por dia, uma célula sofra milhares de lesões que desafiam a integridade do genoma, sendo que a capacidade da mesma em detetar e reparar o dano formado no DNA torna-se crucial para a manutenção das suas funções normais e para a supressão de eventos mutagénicos que podem originar cancro. Diversos fatores endógenos e exógenos originam vários tipos de danos no DNA, o que, consequentemente, levou as células a desenvolveram diversos mecanismos de reparação especializados para lidar com esses tipos distintos de danos no DNA. O processo de reparação do DNA envolve um amplo conjunto de eventos integrados nos quais diversas proteínas, denominadas proteínas reparadoras, sentem, sinalizam e reparam o dano no sentido de proteger a célula e, consequentemente, o organismo de qualquer ameaça que pode advir. Danos no DNA podem interferir de diversas maneiras com a transcrição génica. Enquanto que, danos localizados nas cadeias transcritas dos genes que estão a ser expressos podem resultar na obstrução da elongação da RNA polimerase, danos localizados nas regiões promotoras podem alterar e/ou impedir o recrutamento de diversos fatores de transcrição. No seu conjunto, todas estas alterações resultam na inibição da transcrição, sendo esta um dos impactos mais frequentemente associado à interação entre danos no DNA e transcrição. No entanto, esta visão de que a indução de danos no DNA apenas resulta em consequências negativas para a transcrição tem sido contrariada nos últimos anos. Evidências crescentes têm reportado que a indução fisiológica de quebras na molécula de DNA pode resultar na ativação da transcrição de vários genes. Na verdade, vários autores demonstraram que a indução dos programas transcricionais de genes dependentes de estímulos envolve a formação de danos no DNA, nomeadamente quebras da dupla cadeia de DNA (um dos danos mais letais para a células), sendo estes aparentemente necessários para a eficiente ativação transcricional desses genes. Os mecanismos através dos quais a introdução de uma quebra na molécula de DNA medeia a ativação da transcrição ainda não são completamente conhecidos; no entanto, algumas evidências revelam que essa mesma ativação possa resultar da resolução de restrições topológicas que impeçam a RNA polimerase de iniciar o processo de elongação ou então, da remodelação da estrutura da cromatina que se verifica após o dano, e durante a consequente reparação, e que consequentemente pode criar um ambiente permissivo para a transcrição. Tendo em conta a emergente interação que se verifica ente danos no DNA e transcrição, o presente projeto tem como objetivo investigar se a introdução programada de uma quebra na cadeia dupla de DNA no promotor de um gene regula a sua ativação. Para isso, foram selecionados três genes diferentes, sendo estes o CDKN2A, GSTP1 e o RASSF1. Os genes CDKN2A e GSTP1 são genes supressores de tumor que se encontram epigeneticamente silenciados, através da hiper-metilação do seu promotor, no cancro colorretal e no carcinoma hepatocelular, respetivamente, enquanto que o gene RASSF1, mais precisamente a sua isoforma C, considerada um oncogene, encontra-se expresso no carcinoma hepatocelular. Para o estudo do impacto da introdução de uma quebra no DNA na transcrição dos genes selecionados, linhas celulares do cancro colorretal e do carcinoma hepatocelular, HCT116 e HepG2, respetivamente, foram infetadas com lentivírus portadores do sistema CRISPR/Cas9, com RNAs guias que têm como alvo a região promotora de cada gene. Os resultados obtidos demonstraram que a introdução de uma quebra no promotor dos genes supressores de tumor, nomeadamente no promotor da isoforma do gene CDKN2A, p14ARF, e no promotor do gene GSTP1, leva à reativação da sua transcrição, o que é consistente com o papel positivo dos danos no DNA na transcrição, como foi reportado em diversos estudos. Por outro lado, danos no DNA na região promotora da isoforma C do gene RASSF1 resulta numa evidente diminuição da sua transcrição. Resultados semelhantes foram previamente reportados em um estudo recente realizado no nosso laboratório. Em conjunto, estes resultados demonstram que a indução de uma quebra no promotor de um gene ativamente transcrito ou de um gene silenciado apresenta consequências distintas no processo de transcrição. De facto, os dados revelam que o impacto do dano no DNA na transcrição depende do status transcricional da região alvo. O entendimento da organização estrutural da cromatina associada à região promotora, antes e depois do dano, bem como dos componentes moleculares envolvidos na resposta ao dano poderá ajudar a clarificar a razão desta variabilidade.Multicellular organisms are composed of different tissues and cells that interact with each other in a coordinated and synchronized way in order to maintain homeostasis. The identities of the different cells and consequently of the tissues that comprise them are determined by the tightly temporal and spatial control of the transcriptional programs that enable accurate gene expression. In fact, the proportion of genes expressed at a given time defines cell fate and function. Gene transcription in eukaryotes is a complex and layered process accomplished by the interaction of regulatory factors with specific sequences present in the control regions of genes. The coordinated cascade of events involved in this process can be affected, at least transiently, by DNA damage. For instance, transcription repression has been recognized as a major outcome of DNA damage. Nonetheless, this view has been challenged over the last years by studies suggesting that DNA damage can promote gene expression activation. Several studies reported that activation of stimulus-dependent gene expression involves the formation of DNA damage, which in turn seems to be sufficient for transcription initiation. In this project, we aim to investigate whether the programmed introduction of a DNA double strand break (DSB) in the promoter of a gene regulates its activation. For that, we selected three different genes, namely CDKN2A, GSTP1 and RASSF1. CDKN2A and GSTP1 are tumour suppressor genes epigenetically silenced by promoter hypermethylation in colorectal cancer and hepatocellular carcinoma, respectively. RASSF1, namely its oncogenic isoform C, is expressed in hepatocellular carcinoma. The induction of a locus-specific DSB was accomplished by using the CRISPR/Cas9 system with guide RNAs directed to the promoter region of the genes. The results demonstrated that the introduction of a DSB in the promoter of the tumour suppressor genes, namely in CDKN2A and in GSTP1 leads to transcription activation. On the other hand, the induction of a DSB in the C isoform promoter region of the RASSF1 gene results in a clear decrease in its transcription. Altogether, these results demonstrate that a DSB in the promoter of an actively transcribed gene or of a silenced gene displays different outcomes. These data reveal that the impact of DNA damage in transcription depends on the transcriptional status of the target region

Discriminação salarial entre homens e mulheres : evidência empírica para a Região Autónoma dos Açores

Dissertação de Mestrado em Ciências Económicas e Empresariais.Esta dissertação analisa o hiato salarial entre homens e mulheres na Região Autónoma dos Açores. Para esse propósito, utiliza-se uma base de dados contendo observações sobre as características dos trabalhadores e dos respectivos empregadores para o ano de 2008. Os resultados indicam que as diferenças salariais entre homens e mulheres são significativas e motivadas pela existência de fenómenos de discriminação no mercado de trabalho. De facto, na ausência de discriminação as mulheres ganhariam mais do que os homens tendo por base as características individuais e do respectivo emprego.ABSTRACT: This dissertation examines the gender wage-gap in the Azores. For this purpose, we use a large matched employer-employee data set for the year of 2008. The results indicate that the gender wage-gape is sizable and motivated by the existence of discrimination in the labour market. Indeed, in the absence of discrimination females would earn more than males due to differences in their observed individual and job related attributes

A pintura e o desenvolvimento da comunicação no Primeiro Ciclo do Ensino Básico, na criança Autista

Esta dissertação, realizada no âmbito da obtenção do mestrado em Ciências da Educação: Educação Especial, Domínio Cognitivo e Motor, apresenta como tema condutor de todo o desenrolar da investigação a Pintura e o Desenvolvimento da Comunicação no Primeiro Ciclo do Ensino Básico, na Criança Autista. Pretende-se, através de um estudo comparativo entre docentes especializados na intervenção em crianças autistas de Portugal e dos Estados Unidos da América, analisar e tirar conclusões acerca da possível contribuição da pintura no desenvolvimento da comunicação verbal e não-verbal na criança pertencente ao primeiro ciclo do ensino básico, tendo em conta que a comunicação é um domínio comprometido em qualquer sujeito autista, ainda que em níveis de comprometimento díspares. A investigação decorreu com a colaboração de docentes ligados à intervenção em crianças autistas que frequentem este nível de ensino. Foi objetivo geral deste estudo averiguar se as atividades de pintura produzem qualquer tipo de efeitos positivos e/ou negativos na área da comunicação verbal e não-verbal na criança autista frequentando o 1º Ciclo do Ensino Básico (CEB). Como objetivos específicos encontram-se os seguintes: Aferir se a pintura é um meio facilitador da comunicação verbal e não-verbal com os pares e com o adulto; Verificar se os profissionais da educação recorrem à pintura como terapia facilitadora do desenvolvimento da comunicação nas crianças autistas; Aferir se a criança autista revela comportamentos dissemelhantes na sua comunicação quando recorre à pintura e quando não recorre à pintura. Esta investigação foi suportada na articulação entre a metodologia quantitativa e qualitativa, com triangulação de resultados obtidos pela aplicação dos instrumentos de recolha de dados: o questionário e a entrevista. Atingiram-se totalmente os Objetivos definidos: Aferir se a pintura é um meio facilitador da comunicação verbal e não-verbal com os pares e com o adulto; Verificar se os profissionais da educação recorrem à pintura como terapia facilitadora do desenvolvimento da comunicação nas crianças autistas; Aferir se a criança autista revela comportamentos dissemelhantes na sua comunicação quando recorre à pintura e quando não recorre à pintura.This research project, carried out under the master degree in Education Sciences: Special Needs, Cognitive and Motor Area, presents as driving theme of all the research Painting and Communication Development in the First Cycle of Basic Education in the Autistic Child. So, it is intended, through a comparative study between specialized teachers in autistic children intervention from Portugal and United States of America, to analyze and draw conclusions about the contribution of painting in verbal and non-verbal communication development in the child belonging to the first cycle of basic education, considering that communication is a committed area in any autistic child, even if at different levels of commitment. The research was carried out with the collaboration of teachers related to the intervention in autistic children who attend this school level. It’s the general objective of this study to investigate whether painting activities produce any kind of positive and / or negative effects in verbal and non verbal communication area in the autistic child, attending the 1st Cycle of Basic Education (CEB). As specific objectives there are the following: verify if painting is a facilitator of verbal and non-verbal communication with the pairs and with the adult; verify if education professionals use painting as a facilitating therapy for the development of communication in autistic children; verify whether the autistic child reveals dissimilar behaviors in his communication when he use painting and when he does not use painting. This research was developed by articulating quantitative and qualitative methodology, with triangulation of the results obtained by the using of the following instruments for data collection: questionnaire and interview. The objectives were fully achieved: Verify if painting is a facilitator of the verbal and non-verbal communication with the pairs and with the adult; Verify if education professionals use painting as a facilitating therapy for the development of communication in autistic children; Verify whether the autistic child reveals dissimilar behaviors in his communication when he use painting and when he does not use painting

Influence of Prior Exercise on VO2 Kinetics Subsequent Exhaustive Rowing Performance

Prior exercise has the potential to enhance subsequent performance by accelerating the oxygen uptake (VO2) kinetics. The present study investigated the effects of two different intensities of prior exercise on pulmonary VO2 kinetics and exercisetime during subsequent exhaustive rowing exercise. It was hypothesized that in prior heavy, but not prior moderateexercise condition, overall VO2 kinetics would be faster and the VO2 primary amplitude would be higher, leading to longerexercise time at VO2max. Six subjects (mean 6 SD; age: 22.964.5 yr; height: 181.267.1 cm and body mass: 75.563.4 kg)completed square-wave transitions to 100% of VO2max from three different conditions: without prior exercise, with priormoderate and heavy exercise. VO2 was measured using a telemetric portable gas analyser (K4b2, Cosmed, Rome, Italy) andthe data were modelled using either mono or double exponential fittings. The use of prior moderate exercise resulted in afaster VO2 pulmonary kinetics response (t1 = 13.4163.96 s), an improved performance in the time to xhaustion(238.8650.2 s) and similar blood lactate concentrations ([La2]) values (11.861.7 mmol.L21) compared to the onditionwithout prior exercise (16.065.56 s, 215.3660.1 s and 10.761.2 mmol.L21, for t1, time sustained at VO2max and [La2], respectively). Performance of prior heavy exercise, although useful in accelerating the VO2 pulmonary kinetics responseduring a subsequent time to exhaustion exercise (t1 = 9.1861.60 s), resulted in a shorter time sustained at VO2max(155.5646.0 s), while [La2] was similar (13.561.7 mmol.L21) compared to the other two conditions. Although both priormoderate and heavy exercise ulted in a faster pulmonary VO2 kinetics response, only prior moderate exercise lead to improved rowing performance.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Effect of nitrogen, phosphorus, potassium and boron fertilizers on essential oils yield in lemon verbena (Alyosia triphylla)

Essential oils (EO) are liquid mixtures of volatile compounds obtained from aromatic plants. They constitute what is called the "essence" of a plant and usually have pleasantly scented fragrances[1]. The chemical composition of the EO extracted from Lemon verbena [Aioysia triphylla (L'Her) Britton], has been frequently studied because the aerial parts of this plant are used in folk medicine. Lemon verbena is an herbal species indigenous to South America which was introduced into Europe at 17th century[2]. it has been cultivated mainly due to the lemon-like aroma and utilized for herbal tea, which is reputed to have antispasmodic, antipyretic, sedative and digestive properties[3). The aim of this study was to determine the accumulation of EO in Lemon verbena growth under different fertilizer regimes of nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K) and boron (B). All the nutrients were applied as liquid organic fertilizers. The nutrient solution was applied in soil surface through the holes made in the anti-weeds plastic mulch by where the plants grow. The nutrients were applied at the rates: 0, 37.5, 75 and 112.5 kg N ha·•; 0, 37.5 and 75 kg P P s ha·1; 0, 37.5 and 75 kg ~0 ha·1; and 0. 75 and 1.5 kg B ha·•. The total rates of fertilizers were fractionated into three applications during the growing season. The experimental design included three replications of all fertilizer treatments. Field samples, 5 to 6 individual plants were collected, weighed and dried. The determination of the EO yield was performed by the hydro-distilled process. The plant material was subjected to extraction for 3 h using a Clevenger-type apparatus. The results here presented should be considered preliminary. However, it seems that the increase in biomass due to the increasing rates of N, P and B decreased the oil content in the plant. ForK treatment, that relationship was not found. The high oil yields were found from the samples coming from the most productive plots.Funded by Projects PRODER no 46025 - Gestao Sustentave/ da Produr;ao de Plantas Aromaticas e Medicinais, and PRODER n° 46207 - Adaptar;ao cultural de hortela-vulgar e Stevia.info:eu-repo/semantics/publishedVersio