Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Sendo considerada a unidade básica da vida, a célula constitui o nível mais baixo de organização a que o organismo pode ser reduzido mantendo as características da vida. Os organismos multicelulares, tal como os conhecemos, são constituídos por diferentes tipos de células que comunicam entre si de forma a assegurar o normal funcionamento dos mesmos. Esta extensa e complexa rede de conexões, quando devidamente regulada, garante a manutenção da homeostasia necessária para a sobrevivência dos organismos. Toda esta organização funcional é ditada pela informação que se encontra codificada na longa molécula de 2 metros que se encontra confinada ao núcleo da célula eucariótica, o DNA. No entanto, para que a célula tenha acesso a essa informação, várias maquinarias moleculares trabalham em conjunto no sentido de copiar e traduzir a informação presente na molécula de DNA para uma “linguagem” percetível à célula. Este processo é definido de expressão génica.
A expressão génica é um processo complexo e altamente regulado que define a identidade das diferentes células e tecidos que constituem o organismo. Sendo constituída por uma sequência ordenada de eventos, a expressão génica consiste, maioritariamente, em duas etapas principais: a transcrição, onde a informação codificada na molécula de DNA é transferida para a molécula de RNA, ou mais especificamente para o RNA mensageiro no caso de genes que codificam proteínas; e a tradução, etapa na qual a informação presente no RNA mensageiro é traduzida para uma sequência de aminoácidos dando origem às proteínas. Para o início da transcrição diversas proteínas regulatórias, nomeadamente fatores de transcrição, têm de ser sequencialmente recrutadas, juntamente com a RNA polimerase (do tipo II, no caso da transcrição de genes codificadores de proteínas), para o promotor do gene alvo. O recrutamento destes componentes, que está dependente da existência de sequências de reconhecimento específicas presentes na região promotora do gene, permite a formação de um complexo de pré-iniciação funcional, sendo este essencial para o início da transcrição. No entanto, alguns constrangimentos estruturais podem impedir a formação do referido complexo. Como referido anteriormente, o DNA é uma molécula bastante longa que, nas células eucarióticas, se encontra empacotada dentro de um pequeno compartimento, o núcleo. De forma a acomodar-se dentro deste, evitando a formação de nós ou emaranhados, várias proteínas, designadas de histonas, interagem com a molécula de DNA, compactando-a sob a forma de cromatina. Dependendo dos diferentes graus de compactação que pode assumir, a cromatina é um importante fator de regulação de vários processos biológicos que requerem acesso ao DNA, tais como a replicação, a reparação do DNA e a transcrição. Por exemplo, durante a transcrição, o reconhecimento, por parte dos fatores de transcrição, das suas sequências específicas de ligação presentes no DNA pode ser impedido pela estrutura compacta da cromatina. Sendo assim, e de forma a facilitar a acessibilidade de diversos fatores ao DNA, as células desenvolveram algumas estratégias que permitem a remodelação da estrutura da cromatina, nomeadamente através de modificações pós-traducionais de histonas e da atividade de complexos remodeladores de cromatina. Desta forma, o controlo da estrutura dinâmica da cromatina permite a montagem do complexo de pré-iniciação que, na ausência de outras adversidades, leva à transcrição produtiva do gene alvo.
Como é possível perceber, a expressão génica é um processo vital à vida, sendo que qualquer perturbação à coordenada cascata de eventos que a constituem pode resultar em consequências devastadoras. Danos no DNA são um dos fatores responsáveis pela alteração da expressão dos genes afetados. Durante o seu período de vida, o genoma de uma célula é sujeito a vários tipos de dano. Na realidade, acredita-se que, por dia, uma célula sofra milhares de lesões que desafiam a integridade do genoma, sendo que a capacidade da mesma em detetar e reparar o dano formado no DNA torna-se crucial para a manutenção das suas funções normais e para a supressão de eventos mutagénicos que podem originar cancro. Diversos fatores endógenos e exógenos originam vários tipos de danos no DNA, o que, consequentemente, levou as células a desenvolveram diversos mecanismos de reparação especializados para lidar com esses tipos distintos de danos no DNA. O processo de reparação do DNA envolve um amplo conjunto de eventos integrados nos quais diversas proteínas, denominadas proteínas reparadoras, sentem, sinalizam e reparam o dano no sentido de proteger a célula e, consequentemente, o organismo de qualquer ameaça que pode advir.
Danos no DNA podem interferir de diversas maneiras com a transcrição génica. Enquanto que, danos localizados nas cadeias transcritas dos genes que estão a ser expressos podem resultar na obstrução da elongação da RNA polimerase, danos localizados nas regiões promotoras podem alterar e/ou impedir o recrutamento de diversos fatores de transcrição. No seu conjunto, todas estas alterações resultam na inibição da transcrição, sendo esta um dos impactos mais frequentemente associado à interação entre danos no DNA e transcrição. No entanto, esta visão de que a indução de danos no DNA apenas resulta em consequências negativas para a transcrição tem sido contrariada nos últimos anos. Evidências crescentes têm reportado que a indução fisiológica de quebras na molécula de DNA pode resultar na ativação da transcrição de vários genes. Na verdade, vários autores demonstraram que a indução dos programas transcricionais de genes dependentes de estímulos envolve a formação de danos no DNA, nomeadamente quebras da dupla cadeia de DNA (um dos danos mais letais para a células), sendo estes aparentemente necessários para a eficiente ativação transcricional desses genes. Os mecanismos através dos quais a introdução de uma quebra na molécula de DNA medeia a ativação da transcrição ainda não são completamente conhecidos; no entanto, algumas evidências revelam que essa mesma ativação possa resultar da resolução de restrições topológicas que impeçam a RNA polimerase de iniciar o processo de elongação ou então, da remodelação da estrutura da cromatina que se verifica após o dano, e durante a consequente reparação, e que consequentemente pode criar um ambiente permissivo para a transcrição.
Tendo em conta a emergente interação que se verifica ente danos no DNA e transcrição, o presente projeto tem como objetivo investigar se a introdução programada de uma quebra na cadeia dupla de DNA no promotor de um gene regula a sua ativação. Para isso, foram selecionados três genes diferentes, sendo estes o CDKN2A, GSTP1 e o RASSF1. Os genes CDKN2A e GSTP1 são genes supressores de tumor que se encontram epigeneticamente silenciados, através da hiper-metilação do seu promotor, no cancro colorretal e no carcinoma hepatocelular, respetivamente, enquanto que o gene RASSF1, mais precisamente a sua isoforma C, considerada um oncogene, encontra-se expresso no carcinoma hepatocelular. Para o estudo do impacto da introdução de uma quebra no DNA na transcrição dos genes selecionados, linhas celulares do cancro colorretal e do carcinoma hepatocelular, HCT116 e HepG2, respetivamente, foram infetadas com lentivírus portadores do sistema CRISPR/Cas9, com RNAs guias que têm como alvo a região promotora de cada gene. Os resultados obtidos demonstraram que a introdução de uma quebra no promotor dos genes supressores de tumor, nomeadamente no promotor da isoforma do gene CDKN2A, p14ARF, e no promotor do gene GSTP1, leva à reativação da sua transcrição, o que é consistente com o papel positivo dos danos no DNA na transcrição, como foi reportado em diversos estudos. Por outro lado, danos no DNA na região promotora da isoforma C do gene RASSF1 resulta numa evidente diminuição da sua transcrição. Resultados semelhantes foram previamente reportados em um estudo recente realizado no nosso laboratório.
Em conjunto, estes resultados demonstram que a indução de uma quebra no promotor de um gene ativamente transcrito ou de um gene silenciado apresenta consequências distintas no processo de transcrição. De facto, os dados revelam que o impacto do dano no DNA na transcrição depende do status transcricional da região alvo. O entendimento da organização estrutural da cromatina associada à região promotora, antes e depois do dano, bem como dos componentes moleculares envolvidos na resposta ao dano poderá ajudar a clarificar a razão desta variabilidade.Multicellular organisms are composed of different tissues and cells that interact with each other in a coordinated and synchronized way in order to maintain homeostasis. The identities of the different cells and consequently of the tissues that comprise them are determined by the tightly temporal and spatial control of the transcriptional programs that enable accurate gene expression. In fact, the proportion of genes expressed at a given time defines cell fate and function. Gene transcription in eukaryotes is a complex and layered process accomplished by the interaction of regulatory factors with specific sequences present in the control regions of genes. The coordinated cascade of events involved in this process can be affected, at least transiently, by DNA damage. For instance, transcription repression has been recognized as a major outcome of DNA damage. Nonetheless, this view has been challenged over the last years by studies suggesting that DNA damage can promote gene expression activation. Several studies reported that activation of stimulus-dependent gene expression involves the formation of DNA damage, which in turn seems to be sufficient for transcription initiation. In this project, we aim to investigate whether the programmed introduction of a DNA double strand break (DSB) in the promoter of a gene regulates its activation. For that, we selected three different genes, namely CDKN2A, GSTP1 and RASSF1. CDKN2A and GSTP1 are tumour suppressor genes epigenetically silenced by promoter hypermethylation in colorectal cancer and hepatocellular carcinoma, respectively. RASSF1, namely its oncogenic isoform C, is expressed in hepatocellular carcinoma. The induction of a locus-specific DSB was accomplished by using the CRISPR/Cas9 system with guide RNAs directed to the promoter region of the genes. The results demonstrated that the introduction of a DSB in the promoter of the tumour suppressor genes, namely in CDKN2A and in GSTP1 leads to transcription activation. On the other hand, the induction of a DSB in the C isoform promoter region of the RASSF1 gene results in a clear decrease in its transcription. Altogether, these results demonstrate that a DSB in the promoter of an actively transcribed gene or of a silenced gene displays different outcomes. These data reveal that the impact of DNA damage in transcription depends on the transcriptional status of the target region
