Rational Design of Photochromic Analogues of Tricyclic Drugs

Tricyclic chemical structures are the core of many important drugs targeting all neurotransmitter pathways. These medicines enable effective therapies to treat from peptic ulcer disease to psychiatric disorders. However, when administered systemically, they cause serious adverse effects that limit their use. To obtain localized and on-demand pharmacological action using light, we have designed photoisomerizable ligands based on azobenzene that mimic the tricyclic chemical structure and display reversibly controlled activity. Pseudo-analogues of the tricyclic antagonist pirenzepine demonstrate that this is an effective strategy in muscarinic acetylcholine receptors, showing stronger inhibition upon illumination both in vitro and in cardiac atria ex vivo. Despite the applied chemical modifications to make pirenzepine derivatives sensitive to light stimuli, the most potent candidate of the set, cryptozepine-2, maintained a moderate but promising M1 vs M2 subtype selectivity. These photoswitchable “crypto-azologs” of tricyclic drugs might open a general way to spatiotemporally target their therapeutic action while reducing their systemic toxicity and adverse effects

In vivo photocontrol of orexin receptors with a nanomolar light-regulated analogue of orexin-B

Gorostiza, Pa

Optical Control of Cardiac Function with a Photoswitchable Muscarinic Agonist

Light-triggered reversible modulation of physiological functions offers the promise of enabling on-demand spatiotemporally controlled therapeutic interventions. Optogenetics has been successfully implemented in the heart, but significant barriers to its use in the clinic remain, such as the need for genetic transfection. Herein, we present a method to modulate cardiac function with light through a photoswitchable compound and without genetic manipulation. The molecule, named PAI, was designed by introduction of a photoswitch into the molecular structure of an M2 mAChR agonist. In vitro assays revealed that PAI enables light-dependent activation of M2 mAChRs. To validate the method, we show that PAI photoisomers display different cardiac effects in a mammalian animal model, and demonstrate reversible, real-time photocontrol of cardiac function in translucent wildtype tadpoles. PAI can also effectively activate M2 receptors using two-photon excitation with near-infrared light, which overcomes the scattering and low penetration of short-wave-length illumination, and offers new opportunities for intravital imaging and control of cardiac function

Reversible photocontrol of dopaminergic transmission in wild-type animals

Understanding the dopaminergic system is a priority in neurobiology and neuropharmacology. Dopamine receptors are involved in the modulation of fundamental physiological functions and dysregulation of dopaminergic transmission is associated with major neurological disorders. However, the available tools to dissect the endogenous dopaminergic circuits have limited specificity, reversibility, resolution, or require genetic manipulation. Here we introduce azodopa, a novel photoswitchable ligand that enables reversible spatiotemporal control of dopaminergic transmission. We demonstrate that azodopa activates D1-like receptors in vitro in a light-dependent manner. Moreover, it enables reversibly photocontrolling zebrafish motility on a time scale of seconds and allows separating the retinal component of dopaminergic neurotransmission. Azodopa increases the overall neural activity in the cortex of anesthetized mice and displays illuminationdependent activity in individual cells. Azodopa is the first photoswitchable dopamine agonist with demonstrated efficacy in wildtype animals and opens the way to remotely controlling dopaminergic neurotransmission for fundamental and therapeutic purposes

Development and applications of photoswitchable ligands for G protein-coupled receptors

[eng] G protein-coupled receptors (GPCRs) modulate diverse cellular responses to the majority of neurotransmitters and hormones within the human body. They exhibit much structural and functional diversity and are responsive to a plethora of ligands and stimuli including both endogenous (e.g., biogenic amines, cations, lipids, peptides, and glycoproteins) and exogenous (e.g., therapeutic drugs, photons, tastants, and odorants). Due to the key roles of GPCRs in a myriad of physiological processes, signaling pathways associated with GPCRs are implicated in the pathophysiology of various diseases, ranging from metabolic, immunological, and neurodegenerative disorders to cancer and infectious diseases. Approximately 40% of clinically approved drugs mediate their effects by modulating GPCR signaling pathways, which makes them attractive targets for drug screening and discovery. In this work, we focus on distinct GPCRs which are involved in vital pathways, such as the muscarinic acetylcholine receptors, subtype -1 and subtype -2 (M1 and M2 mAChRs; class A); the dopamine receptor 1 (D1R; class A), and the metabotropic glutamate 6 receptor (mGlu6 receptor; class C). Both M1 receptor (M1R) and M2 receptor (M2R) are important drug targets for several diseases that affect the central nervous system (CNS), including Alzheimer's disease, Parkinson’s disease (PD), schizophrenia, sleep disorders, and acute brain diseases. M2R also represent a target for cardiac disfunctions; the D1R for hypertension and PD, and mGlu6 receptor for retinal degenerative diseases, like retinitis pigmentosa. Traditional pharmacological approaches for the modulation of the GPCRs activity are still limited since precise spatiotemporal control of a ligand is lost as soon it is administrated. Photopharmacology proposes the use of small diffusible molecules called photochromic ligands (PCLs) (or photoswitches) to overcome this shortfall, since their activity can be reversibly controlled by light with high precision. In this thesis, we combined photochromic, cell-based (calcium fluorescence assays), and in vivo photopharmacological approaches to characterize several photoswitches either agonists, antagonists, dualsteric ligands or allosteric modulators. In Chapter 3 we introduce a novel method of photoswitch design named “cryptoazologization”, which replaces the tricyclic core of “privileged” drugs with different azobenzenes as molecular photoswitches. This strategy offers the advantage of producing photoswitchable compounds that are inactive in the trans configuration, the most thermodynamically stable. The cis isomer can be obtained upon illumination with the appropriate wavelength, mimicking the tricyclic geometry of the parent drug and its effect. The potential of the “cryptoazologization” has been demonstrated by the development of four pirenzepine derivatives, termed “cryptozepines”. We have characterized these new compounds for mAChRs through a calcium imaging assay in HEK cells overexpressing the M1R. The cryptozepine-2 that showed a stronger inhibitory activity was studied ex vivo in cardiac atria as well as in cortical network. The latter study is the focus of Chapter 4 where it is shown the antagonistic effect of cryptozepine-2 in ferret slices where it blocks muscarinic activation of slow oscillations. In addition, we found that cryptozepine-2 suppresses M1R-mediated epileptiform seizures in its cis active form. In parallel, it was also demonstrated the ability of the reported dualsteric agonist benzyl quinolone carboxylic acid-azo-iperoxo (BAI) to increase the frequency of slow oscillatory activity in cortical networks both ex vivo and in vivo in its trans configuration. Phthalimide-azo-iperoxo (PAI) is another dualsteric photoswitchable compound which is also active in its trans form (Chapter 8). Differently from BAI, PAI targets the M2Rs, being the first photoswitchable M2 mAChR agonist to be reported. This compound enables the control of cardiac activity with light in wild-type animals without genetic manipulation. However, the limitation of PAI and BAI is that both trans-to-cis isomerize under UV light. Consequently, the property of noninvasiveness of light, a key advantage of pharmacological agent, is lost. We managed to activate PAI with longer, tissue-penetrating wavelengths such as 840 nm under two- photon excitation (2PE) (Chapter 9). In this thesis, thereby, we also aimed at further expanding the photopharmacological toolset with the development of compounds or the optimization of methods that can resolve different shortcomings that we have identified as critical for in vivo applications. In principle, the tissue penetration depth limitation can be overcome by shifting the operational wavelengths into the “biological window” (650-1100 nm). Besides the operational wavelength, another shortcoming is represented by the large excitation volume caused by the linear dependence of one-photon excitation (1PE). In contrast, the nonlinearity of multiphoton excitation at the focal point affords subcellular resolution in three dimensions. To meet both requirements of deep tissue penetration and focalized photoswitching, multiphoton pharmacology takes advantage of NIR pulsed lasers and nonlinear absorption of certain photochromic moieties. In Chapter 5, we developed a set of cis-on xanomeline (i.e., muscarinic agonist) derivatives named “xanoswitches”. The best-in-class compounds were selected based on their responses to an in vitro assay and these photoswitches were chemically modified to allow photoisomerization by two-photon excitation (2PE) using a pulsed NIR light laser. This was done using single point, bio-isosteric modifications at the azobenzene. These 2PE xanoswitches afforded photocontrol of calcium oscillation in various settings, including in vitro and, for the first time, bidirectional, reversible photomodulation of neuronal activity in vivo using NIR-light. In Chapter 9 we have presented the first proof of concept for photoactivation of a photoswitchable compound (i.e., PAI) by three-photon excitation (3PE) in vitro and in vivo. The wide application of two photon and three-photon pharmacology would be transformative for research and development in chemical biology and to progress with advanced phototherapies. Depending on the biological application, the three-dimensional micrometric spatial resolution obtained by 2PE might not be necessary or desired. Instead, 1PE possesses significant advantages to activate larger areas of tissue. Chapter 6 describes the development of 1PE xanoswitches through the introduction into the molecular structure of a tetra-ortho chlorinated azobenzene. These compounds allowed reversible modulation of calcium oscillation in vitro with orange light and photocontrol of zebrafish motility. This would also allow using standard “off-the-shelf” light emitting diodes (LEDs) which are lightweight and widely accessible, simplifying its applicability for photopharmacological therapies for the PNS and CNS. Another goal of this work was to develop the first reversibly photoswitchable allosteric modulators for class A GPCRs, described in Chapter 7. Using the prototypical M1R positive allosteric modulator benzyl quinolone carboxylic acid (BQCA), a set of Photo-BQCAs was developed. These compounds exhibit complementary photopharmacological properties, one being cis- and one being trans-on. Biological characterization demonstrated their ability to modulate receptor activation in presence of an orthosteric agonist in a light dependent manner. These photoswitches represent interesting and useful tools in the ongoing efforts to understand complex signaling mechanism of GPCRs. Moreover, this work presents the development and application of azodopa, a photopharmacological agent that is aimed at light-regulation of dopaminergic system (Chapter 10). We demonstrated that this compound activates D1-like receptors in vitro in a light-dependent manner and it enables reversibly photocontrolling zebrafish motility on a time scale of seconds. Moreover, it increases the overall neural activity in the cortex of anesthetized mice. Azodopa is the first photoswitchable dopamine agonist with demonstrated efficacy in wild-type animals, opening the way to remotely control dopaminergic neurotransmission for fundamental and therapeutic purposes. In Chapter 11, we describe the development and application of a photoswitchable compound library targeting metabotropic glutamate 6 (mGlu6) receptors and acting as agonist and positive allosteric modulators (ago-PAM) with nanomolar potency. We performed a high-throughput screening of 15 photoswitchable allosteric ligands using a microplate reader and we identified two compounds (i.e., 1492 and 1495) that and are fast relaxing, blue light switching, and allow in vivo restoration of visual acuity for the first time. Moreover, they restore light-avoidance behavior in blind mice by topical administration. The characteristics of these compounds make them excellent candidates for further preclinical studies and a potential drug-based therapy for sight restoration in humans. The presented findings broaden the availability of photopharmacological tools not only to investigate complex signaling pathways that underlie many (patho)physiological processes but also for innovative and noninvasive treatments of different pathologies with light.[spa] Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) modulan diversas respuestas celulares a la mayoría de los neurotransmisores y hormonas del cuerpo humano. Presentan una gran diversidad estructural y funcional y responden a una plétora de ligandos y estímulos endógenos (aminas biógenas, cationes, lípidos, péptidos y glicoproteínas) y exógenos (fármacos terapéuticos, fotones, sustancias gustativas y odorantes). Debido a las funciones clave de los GPCR en una miríada de procesos fisiológicos, las vías de señalización asociadas a los GPCR están implicadas en la fisiopatología de diversas enfermedades, desde trastornos metabólicos, inmunológicos y neurodegenerativos hasta cáncer y enfermedades infecciosas. Aproximadamente el 40% de los fármacos aprobados clínicamente median sus efectos modulando las vías de señalización de los GPCRs, lo que los convierte en dianas atractivas para el cribado y descubrimiento de fármacos. En este trabajo, nos centramos en distintos GPCR que intervienen en vías vitales, como los receptores muscarínicos de acetilcolina, subtipo-1 y subtipo-2 (M1 y M2 mAChR; clase A); el receptor de dopamina 1 (D1R; clase A) y el receptor metabotrópico de glutamato 6 (receptor mGlu6; clase C). Tanto el receptor M1 (M1R) como el receptor M2 (M2R) son importantes dianas farmacológicas para varias enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, los trastornos del sueño y las enfermedades cerebrales agudas. Los M2R también representan una diana para disfunciones cardiacas; los D1R para la hipertensión y la enfermedad de Parkinson y el receptor mGlu6 para enfermedades degenerativas de la retina, como la retinosis pigmentaria. Los enfoques farmacológicos tradicionales para la modulación de la actividad de los GPCR siguen siendo limitados, ya que el control espaciotemporal preciso de un ligando se pierde en cuanto se administra. La fotofarmacología propone el uso de pequeñas moléculas difusibles llamadas ligandos fotocrómicos (PCLs) (o fotoconmutadores) para superar este déficit, ya que su actividad puede ser controlada reversiblemente por la luz con alta precisión. En esta tesis, hemos combinado enfoques fotoquímicos, celulares (ensayos de fluorescencia del calcio) y fotofarmacológicos in vivo para caracterizar varios fotoconmutadores, ya sean agonistas, antagonistas, ligandos dualstéricos o moduladores alostéricos. En el Capítulo 3 se muestra el desarrollo de un método novedoso denominado "criptoazologuización", que sustituye el núcleo tricíclico de fármacos “privilegiados” por diferentes azobencenos como fotoconmutadores moleculares. Esta estrategia ofrece la ventaja de producir compuestos fotoactivables que son inactivos en la configuración trans, la más estable termodinámicamente. El isómero cis puede obtenerse tras iluminar con la longitud de onda adecuada, imitando la geometría tricíclica del fármaco original y su efecto. El potencial de la "criptoazologuización" se ha demostrado con el desarrollo de cuatro derivados de pirenzepina, denominados “criptozepinas”. Hemos caracterizado estos nuevos compuestos para los mAChR mediante un ensayo de imagen de calcio en células HEK que sobreexpresan el M1R. La criptozepina-2, que mostró una mayor actividad inhibidora, se estudió ex vivo en aurículas cardíacas, así como en la red cortical. Este último estudio es el tema central del Capítulo 4, donde se muestra el efecto antagonista de la criptozepina-2 en rodajas de hurón, donde bloquea la activación muscarínica en las oscilaciones lentas. Además, descubrimos que la criptozepina-2 suprime las convulsiones epileptiformes mediadas por M1R en su forma cis activa. Paralelamente, también se demostró la capacidad del agonista benzil quinolona carboxílico-azo-iperoxo (BAI) para aumentar la frecuencia de la actividad oscilatoria lenta en redes corticales tanto ex vivo como in vivo en su configuración trans. La ftalimida-azo-iperoxo (PAI) es otro compuesto fotoisomerizable dualstérico que también es activo en su forma trans (Capítulo 8). A diferencia del BAI, el PAI se dirige a los M2R, siendo el primer agonista fotoconmutable de los mAChR M2 que se ha descrito. Este compuesto permite controlar la actividad cardiaca con luz en animales silvestres sin manipulación genética. Sin embargo, la limitación de PAI y BAI es que ambos isomerizan de trans a cis con luz UV, que presenta baja penetración en el tejido. En consecuencia, se pierde la propiedad de no invasividad de la luz, una ventaja clave del agente farmacológico. Hemos conseguido activar el PAI con longitudes de onda más largas, como 840 nm, bajo excitación de dos fotones (2PE) (Capítulo 9). En esta tesis, por tanto, también pretendemos ampliar el conjunto de herramientas fotofarmacológicas con el desarrollo de compuestos o la optimización de métodos que puedan resolver diferentes deficiencias que hemos identificado como críticas para las aplicaciones in vivo. En principio, la limitación de la profundidad de penetración en los tejidos puede superarse desplazando las longitudes de onda operativas a la “ventana biológica” (650-1100 nm). Además de la longitud de onda operativa, otra deficiencia está representada por el gran volumen de excitación causado por la dependencia lineal de la excitación monofotónica (1PE). Por el contrario, la no linealidad de la excitación en el punto focal permite una resolución subcelular en tres dimensiones. Para cumplir ambos requisitos de penetración tisular profunda y de fotoconmutación focalizada, la farmacología multifotónica aprovecha los láseres pulsados NIR y la absorción no lineal de ciertas moléculas fotocrómicas. En el Capítulo 5 se desarrolló un conjunto de derivados de xanomelina (es decir, agonista muscarínico) cis-on denominados “xanoconmutadores”. Se seleccionaron los mejores compuestos de su clase mediante un ensayo in vitro y estos fotoconmutadores se modificaron químicamente para permitir la fotoisomerización mediante excitación de dos fotones (2PE) utilizando un láser pulsado de luz NIR. Para ello se utilizaron modificaciones bioisostéricas de un solo punto en el azobenceno. Con estos xanoconmutadores activados mediante 2PE, logramos fotocontrolar las oscilaciones de calcio en varios escenarios in vitro y, por primera vez, la fotomodulación bidireccional y reversible de la actividad neuronal in vivo con luz NIR. En el Capítulo 9 hemos presentado la primera prueba de concepto de fotoactivación de un compuesto fotosensible (es decir, PAI) mediante excitación trifotónica (3PE) in vitro e in vivo. La aplicación generalizada de la farmacología de dos fotones y tres fotones puede transformar la investigación y el desarrollo en biología química y promover las fototerapias avanzadas. Dependiendo de la aplicación biológica, la estimulación a escala micrométrica con 2PE puede conllevar limitaciones. En su lugar, la 1PE posee ventajas significativas para activar áreas más extensas de tejido. El Capítulo 6 describe el desarrollo de xanoconmutadores activados con 1PE mediante la introducción en la estructura molecular de un azobenceno tetra-orto clorado. Estos compuestos permitieron la modulación reversible de las oscilaciones de calcio in vitro con luz naranja y el fotocontrol de la motilidad de peces cebra. Ello permitiría también utilizar diodos emisores de luz (LED) convencionales, ligeros y fácilmente disponibles, lo que simplificaría su aplicabilidad en terapias fotofarmacológicas para el SNP y el SNC. Otro de los objetivos de este trabajo fue el desarrollo de los primeros moduladores alostéricos reversibles y fotosensibles para GPCR de clase A, descritos en el Capítulo 7. Utilizando el M1 prototípico, se desarrolló un modulador alostérico reversible para GPCR de clase B. A partir del modulador alostérico positivo prototípico del M1R, el ácido bencil quinolona carboxílico (BQCA), se desarrolló un conjunto de Photo-BQCAs. Estos compuestos presentan propiedades fotofarmacológicas complementarias, una cis y otra trans. La caracterización biológica demostró su capacidad para modular la activación del receptor en presencia de un agonista ortostérico de forma dependiente de la luz. Estos fotoconmutadores representan compuestos interesantes y útiles en los esfuerzos que se están realizando para comprender el complejo mecanismo de señalización de los GPCRs. Además, este trabajo presenta el desarrollo y la aplicación de la azodopa, un agente fotofarmacológico dirigido a la regulación lumínica del sistema dopaminérgico (Capítulo 10). Demostramos que este compuesto activa los receptores D1R in vitro de forma dependiente de la luz y permite fotocontrolar de forma reversible la motilidad de peces cebra en una escala temporal de segundos. Además, aumenta la actividad neuronal global en la corteza de ratones anestesiados. La azodopa es el primer agonista dopaminérgico fotoconmutable con eficacia demostrada en animales silvestres, lo que abre el camino al control remoto de la neurotransmisión dopaminérgica con fines fundamentales y terapéuticos. En el Capítulo 11, describimos el desarrollo y la aplicación de una biblioteca de compuestos nuevos que actúan como agonistas y moduladores alostéricos positivos (ago-PAM) con potencia nanomolar y que se dirigen a los receptores metabotrópicos de glutamato 6 (mGlu6). Realizamos un cribado de alto rendimiento de 15 ligandos alostéricos fotosensibles utilizando un lector de microplacas e identificamos dos compuestos (es decir, 1492 y 1495) que son de relajación rápida, conmutan con luz azul y permiten por primera vez la restauración in vivo de la agudeza visual. Además, restauran el comportamiento de evitación de la luz en ratones ciegos mediante administración tópica. Las características de estos compuestos los convierten en excelentes candidatos para nuevos estudios preclínicos y en una posible terapia farmacológica para la restauración de la vista en humanos. Los hallazgos presentados amplían la disponibilidad de herramientas fotofarmacológicas no sólo para investigar vías de señalización complejas que subyacen a muchos procesos (pato)fisiológicos, sino también para tratamientos innovadores y no invasivos de diferentes patologías mediante luz

Development and applications of photoswitchable ligands for G protein-coupled receptors

Tesi realitzada a l'Institut de Biotecnologia de Catalunya (IBEC)[eng] G protein-coupled receptors (GPCRs) modulate diverse cellular responses to the majority of neurotransmitters and hormones within the human body. They exhibit much structural and functional diversity and are responsive to a plethora of ligands and stimuli including both endogenous (e.g., biogenic amines, cations, lipids, peptides, and glycoproteins) and exogenous (e.g., therapeutic drugs, photons, tastants, and odorants). Due to the key roles of GPCRs in a myriad of physiological processes, signaling pathways associated with GPCRs are implicated in the pathophysiology of various diseases, ranging from metabolic, immunological, and neurodegenerative disorders to cancer and infectious diseases. Approximately 40% of clinically approved drugs mediate their effects by modulating GPCR signaling pathways, which makes them attractive targets for drug screening and discovery. In this work, we focus on distinct GPCRs which are involved in vital pathways, such as the muscarinic acetylcholine receptors, subtype -1 and subtype -2 (M1 and M2 mAChRs; class A); the dopamine receptor 1 (D1R; class A), and the metabotropic glutamate 6 receptor (mGlu6 receptor; class C). Both M1 receptor (M1R) and M2 receptor (M2R) are important drug targets for several diseases that affect the central nervous system (CNS), including Alzheimer's disease, Parkinson’s disease (PD), schizophrenia, sleep disorders, and acute brain diseases. M2R also represent a target for cardiac disfunctions; the D1R for hypertension and PD, and mGlu6 receptor for retinal degenerative diseases, like retinitis pigmentosa. Traditional pharmacological approaches for the modulation of the GPCRs activity are still limited since precise spatiotemporal control of a ligand is lost as soon it is administrated. Photopharmacology proposes the use of small diffusible molecules called photochromic ligands (PCLs) (or photoswitches) to overcome this shortfall, since their activity can be reversibly controlled by light with high precision. In this thesis, we combined photochromic, cell-based (calcium fluorescence assays), and in vivo photopharmacological approaches to characterize several photoswitches either agonists, antagonists, dualsteric ligands or allosteric modulators. In Chapter 3 we introduce a novel method of photoswitch design named “cryptoazologization”, which replaces the tricyclic core of “privileged” drugs with different azobenzenes as molecular photoswitches. This strategy offers the advantage of producing photoswitchable compounds that are inactive in the trans configuration, the most thermodynamically stable. The cis isomer can be obtained upon illumination with the appropriate wavelength, mimicking the tricyclic geometry of the parent drug and its effect. The potential of the “cryptoazologization” has been demonstrated by the development of four pirenzepine derivatives, termed “cryptozepines”. We have characterized these new compounds for mAChRs through a calcium imaging assay in HEK cells overexpressing the M1R. The cryptozepine-2 that showed a stronger inhibitory activity was studied ex vivo in cardiac atria as well as in cortical network. The latter study is the focus of Chapter 4 where it is shown the antagonistic effect of cryptozepine-2 in ferret slices where it blocks muscarinic activation of slow oscillations. In addition, we found that cryptozepine-2 suppresses M1R-mediated epileptiform seizures in its cis active form. In parallel, it was also demonstrated the ability of the reported dualsteric agonist benzyl quinolone carboxylic acid-azo-iperoxo (BAI) to increase the frequency of slow oscillatory activity in cortical networks both ex vivo and in vivo in its trans configuration. Phthalimide-azo-iperoxo (PAI) is another dualsteric photoswitchable compound which is also active in its trans form (Chapter 8). Differently from BAI, PAI targets the M2Rs, being the first photoswitchable M2 mAChR agonist to be reported. This compound enables the control of cardiac activity with light in wild-type animals without genetic manipulation. However, the limitation of PAI and BAI is that both trans-to-cis isomerize under UV light. Consequently, the property of noninvasiveness of light, a key advantage of pharmacological agent, is lost. We managed to activate PAI with longer, tissue-penetrating wavelengths such as 840 nm under two- photon excitation (2PE) (Chapter 9). In this thesis, thereby, we also aimed at further expanding the photopharmacological toolset with the development of compounds or the optimization of methods that can resolve different shortcomings that we have identified as critical for in vivo applications. In principle, the tissue penetration depth limitation can be overcome by shifting the operational wavelengths into the “biological window” (650-1100 nm). Besides the operational wavelength, another shortcoming is represented by the large excitation volume caused by the linear dependence of one-photon excitation (1PE). In contrast, the nonlinearity of multiphoton excitation at the focal point affords subcellular resolution in three dimensions. To meet both requirements of deep tissue penetration and focalized photoswitching, multiphoton pharmacology takes advantage of NIR pulsed lasers and nonlinear absorption of certain photochromic moieties. In Chapter 5, we developed a set of cis-on xanomeline (i.e., muscarinic agonist) derivatives named “xanoswitches”. The best-in-class compounds were selected based on their responses to an in vitro assay and these photoswitches were chemically modified to allow photoisomerization by two-photon excitation (2PE) using a pulsed NIR light laser. This was done using single point, bio-isosteric modifications at the azobenzene. These 2PE xanoswitches afforded photocontrol of calcium oscillation in various settings, including in vitro and, for the first time, bidirectional, reversible photomodulation of neuronal activity in vivo using NIR-light. In Chapter 9 we have presented the first proof of concept for photoactivation of a photoswitchable compound (i.e., PAI) by three-photon excitation (3PE) in vitro and in vivo. The wide application of two photon and three-photon pharmacology would be transformative for research and development in chemical biology and to progress with advanced phototherapies. Depending on the biological application, the three-dimensional micrometric spatial resolution obtained by 2PE might not be necessary or desired. Instead, 1PE possesses significant advantages to activate larger areas of tissue. Chapter 6 describes the development of 1PE xanoswitches through the introduction into the molecular structure of a tetra-ortho chlorinated azobenzene. These compounds allowed reversible modulation of calcium oscillation in vitro with orange light and photocontrol of zebrafish motility. This would also allow using standard “off-the-shelf” light emitting diodes (LEDs) which are lightweight and widely accessible, simplifying its applicability for photopharmacological therapies for the PNS and CNS. Another goal of this work was to develop the first reversibly photoswitchable allosteric modulators for class A GPCRs, described in Chapter 7. Using the prototypical M1R positive allosteric modulator benzyl quinolone carboxylic acid (BQCA), a set of Photo-BQCAs was developed. These compounds exhibit complementary photopharmacological properties, one being cis- and one being trans-on. Biological characterization demonstrated their ability to modulate receptor activation in presence of an orthosteric agonist in a light dependent manner. These photoswitches represent interesting and useful tools in the ongoing efforts to understand complex signaling mechanism of GPCRs. Moreover, this work presents the development and application of azodopa, a photopharmacological agent that is aimed at light-regulation of dopaminergic system (Chapter 10). We demonstrated that this compound activates D1-like receptors in vitro in a light-dependent manner and it enables reversibly photocontrolling zebrafish motility on a time scale of seconds. Moreover, it increases the overall neural activity in the cortex of anesthetized mice. Azodopa is the first photoswitchable dopamine agonist with demonstrated efficacy in wild-type animals, opening the way to remotely control dopaminergic neurotransmission for fundamental and therapeutic purposes. In Chapter 11, we describe the development and application of a photoswitchable compound library targeting metabotropic glutamate 6 (mGlu6) receptors and acting as agonist and positive allosteric modulators (ago-PAM) with nanomolar potency. We performed a high-throughput screening of 15 photoswitchable allosteric ligands using a microplate reader and we identified two compounds (i.e., 1492 and 1495) that and are fast relaxing, blue light switching, and allow in vivo restoration of visual acuity for the first time. Moreover, they restore light-avoidance behavior in blind mice by topical administration. The characteristics of these compounds make them excellent candidates for further preclinical studies and a potential drug-based therapy for sight restoration in humans. The presented findings broaden the availability of photopharmacological tools not only to investigate complex signaling pathways that underlie many (patho)physiological processes but also for innovative and noninvasive treatments of different pathologies with light.[spa] Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) modulan diversas respuestas celulares a la mayoría de los neurotransmisores y hormonas del cuerpo humano. Presentan una gran diversidad estructural y funcional y responden a una plétora de ligandos y estímulos endógenos (aminas biógenas, cationes, lípidos, péptidos y glicoproteínas) y exógenos (fármacos terapéuticos, fotones, sustancias gustativas y odorantes). Debido a las funciones clave de los GPCR en una miríada de procesos fisiológicos, las vías de señalización asociadas a los GPCR están implicadas en la fisiopatología de diversas enfermedades, desde trastornos metabólicos, inmunológicos y neurodegenerativos hasta cáncer y enfermedades infecciosas. Aproximadamente el 40% de los fármacos aprobados clínicamente median sus efectos modulando las vías de señalización de los GPCRs, lo que los convierte en dianas atractivas para el cribado y descubrimiento de fármacos. En este trabajo, nos centramos en distintos GPCR que intervienen en vías vitales, como los receptores muscarínicos de acetilcolina, subtipo-1 y subtipo-2 (M1 y M2 mAChR; clase A); el receptor de dopamina 1 (D1R; clase A) y el receptor metabotrópico de glutamato 6 (receptor mGlu6; clase C). Tanto el receptor M1 (M1R) como el receptor M2 (M2R) son importantes dianas farmacológicas para varias enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, los trastornos del sueño y las enfermedades cerebrales agudas. Los M2R también representan una diana para disfunciones cardiacas; los D1R para la hipertensión y la enfermedad de Parkinson y el receptor mGlu6 para enfermedades degenerativas de la retina, como la retinosis pigmentaria. Los enfoques farmacológicos tradicionales para la modulación de la actividad de los GPCR siguen siendo limitados, ya que el control espaciotemporal preciso de un ligando se pierde en cuanto se administra. La fotofarmacología propone el uso de pequeñas moléculas difusibles llamadas ligandos fotocrómicos (PCLs) (o fotoconmutadores) para superar este déficit, ya que su actividad puede ser controlada reversiblemente por la luz con alta precisión. En esta tesis, hemos combinado enfoques fotoquímicos, celulares (ensayos de fluorescencia del calcio) y fotofarmacológicos in vivo para caracterizar varios fotoconmutadores, ya sean agonistas, antagonistas, ligandos dualstéricos o moduladores alostéricos. En el Capítulo 3 se muestra el desarrollo de un método novedoso denominado "criptoazologuización", que sustituye el núcleo tricíclico de fármacos “privilegiados” por diferentes azobencenos como fotoconmutadores moleculares. Esta estrategia ofrece la ventaja de producir compuestos fotoactivables que son inactivos en la configuración trans, la más estable termodinámicamente. El isómero cis puede obtenerse tras iluminar con la longitud de onda adecuada, imitando la geometría tricíclica del fármaco original y su efecto. El potencial de la "criptoazologuización" se ha demostrado con el desarrollo de cuatro derivados de pirenzepina, denominados “criptozepinas”. Hemos caracterizado estos nuevos compuestos para los mAChR mediante un ensayo de imagen de calcio en células HEK que sobreexpresan el M1R. La criptozepina-2, que mostró una mayor actividad inhibidora, se estudió ex vivo en aurículas cardíacas, así como en la red cortical. Este último estudio es el tema central del Capítulo 4, donde se muestra el efecto antagonista de la criptozepina-2 en rodajas de hurón, donde bloquea la activación muscarínica en las oscilaciones lentas. Además, descubrimos que la criptozepina-2 suprime las convulsiones epileptiformes mediadas por M1R en su forma cis activa. Paralelamente, también se demostró la capacidad del agonista benzil quinolona carboxílico-azo-iperoxo (BAI) para aumentar la frecuencia de la actividad oscilatoria lenta en redes corticales tanto ex vivo como in vivo en su configuración trans. La ftalimida-azo-iperoxo (PAI) es otro compuesto fotoisomerizable dualstérico que también es activo en su forma trans (Capítulo 8). A diferencia del BAI, el PAI se dirige a los M2R, siendo el primer agonista fotoconmutable de los mAChR M2 que se ha descrito. Este compuesto permite controlar la actividad cardiaca con luz en animales silvestres sin manipulación genética. Sin embargo, la limitación de PAI y BAI es que ambos isomerizan de trans a cis con luz UV, que presenta baja penetración en el tejido. En consecuencia, se pierde la propiedad de no invasividad de la luz, una ventaja clave del agente farmacológico. Hemos conseguido activar el PAI con longitudes de onda más largas, como 840 nm, bajo excitación de dos fotones (2PE) (Capítulo 9). En esta tesis, por tanto, también pretendemos ampliar el conjunto de herramientas fotofarmacológicas con el desarrollo de compuestos o la optimización de métodos que puedan resolver diferentes deficiencias que hemos identificado como críticas para las aplicaciones in vivo. En principio, la limitación de la profundidad de penetración en los tejidos puede superarse desplazando las longitudes de onda operativas a la “ventana biológica” (650-1100 nm). Además de la longitud de onda operativa, otra deficiencia está representada por el gran volumen de excitación causado por la dependencia lineal de la excitación monofotónica (1PE). Por el contrario, la no linealidad de la excitación en el punto focal permite una resolución subcelular en tres dimensiones. Para cumplir ambos requisitos de penetración tisular profunda y de fotoconmutación focalizada, la farmacología multifotónica aprovecha los láseres pulsados NIR y la absorción no lineal de ciertas moléculas fotocrómicas. En el Capítulo 5 se desarrolló un conjunto de derivados de xanomelina (es decir, agonista muscarínico) cis-on denominados “xanoconmutadores”. Se seleccionaron los mejores compuestos de su clase mediante un ensayo in vitro y estos fotoconmutadores se modificaron químicamente para permitir la fotoisomerización mediante excitación de dos fotones (2PE) utilizando un láser pulsado de luz NIR. Para ello se utilizaron modificaciones bioisostéricas de un solo punto en el azobenceno. Con estos xanoconmutadores activados mediante 2PE, logramos fotocontrolar las oscilaciones de calcio en varios escenarios in vitro y, por primera vez, la fotomodulación bidireccional y reversible de la actividad neuronal in vivo con luz NIR. En el Capítulo 9 hemos presentado la primera prueba de concepto de fotoactivación de un compuesto fotosensible (es decir, PAI) mediante excitación trifotónica (3PE) in vitro e in vivo. La aplicación generalizada de la farmacología de dos fotones y tres fotones puede transformar la investigación y el desarrollo en biología química y promover las fototerapias avanzadas. Dependiendo de la aplicación biológica, la estimulación a escala micrométrica con 2PE puede conllevar limitaciones. En su lugar, la 1PE posee ventajas significativas para activar áreas más extensas de tejido. El Capítulo 6 describe el desarrollo de xanoconmutadores activados con 1PE mediante la introducción en la estructura molecular de un azobenceno tetra-orto clorado. Estos compuestos permitieron la modulación reversible de las oscilaciones de calcio in vitro con luz naranja y el fotocontrol de la motilidad de peces cebra. Ello permitiría también utilizar diodos emisores de luz (LED) convencionales, ligeros y fácilmente disponibles, lo que simplificaría su aplicabilidad en terapias fotofarmacológicas para el SNP y el SNC. Otro de los objetivos de este trabajo fue el desarrollo de los primeros moduladores alostéricos reversibles y fotosensibles para GPCR de clase A, descritos en el Capítulo 7. Utilizando el M1 prototípico, se desarrolló un modulador alostérico reversible para GPCR de clase B. A partir del modulador alostérico positivo prototípico del M1R, el ácido bencil quinolona carboxílico (BQCA), se desarrolló un conjunto de Photo-BQCAs. Estos compuestos presentan propiedades fotofarmacológicas complementarias, una cis y otra trans. La caracterización biológica demostró su capacidad para modular la activación del receptor en presencia de un agonista ortostérico de forma dependiente de la luz. Estos fotoconmutadores representan compuestos interesantes y útiles en los esfuerzos que se están realizando para comprender el complejo mecanismo de señalización de los GPCRs. Además, este trabajo presenta el desarrollo y la aplicación de la azodopa, un agente fotofarmacológico dirigido a la regulación lumínica del sistema dopaminérgico (Capítulo 10). Demostramos que este compuesto activa los receptores D1R in vitro de forma dependiente de la luz y permite fotocontrolar de forma reversible la motilidad de peces cebra en una escala temporal de segundos. Además, aumenta la actividad neuronal global en la corteza de ratones anestesiados. La azodopa es el primer agonista dopaminérgico fotoconmutable con eficacia demostrada en animales silvestres, lo que abre el camino al control remoto de la neurotransmisión dopaminérgica con fines fundamentales y terapéuticos. En el Capítulo 11, describimos el desarrollo y la aplicación de una biblioteca de compuestos nuevos que actúan como agonistas y moduladores alostéricos positivos (ago-PAM) con potencia nanomolar y que se dirigen a los receptores metabotrópicos de glutamato 6 (mGlu6). Realizamos un cribado de alto rendimiento de 15 ligandos alostéricos fotosensibles utilizando un lector de microplacas e identificamos dos compuestos (es decir, 1492 y 1495) que son de relajación rápida, conmutan con luz azul y permiten por primera vez la restauración in vivo de la agudeza visual. Además, restauran el comportamiento de evitación de la luz en ratones ciegos mediante administración tópica. Las características de estos compuestos los convierten en excelentes candidatos para nuevos estudios preclínicos y en una posible terapia farmacológica para la restauración de la vista en humanos. Los hallazgos presentados amplían la disponibilidad de herramientas fotofarmacológicas no sólo para investigar vías de señalización complejas que subyacen a muchos procesos (pato)fisiológicos, sino también para tratamientos innovadores y no invasivos de diferentes patologías mediante luz

Histone H1 Favors Folding and Parallel Fibrillar Aggregation of the 1–42 Amyloid‑β Peptide

Alzheimer’s disease (AD) is one of the most prevalent neurodegenerative diseases of the central nervous system. The aggregation of the amyloid-β peptide, Aβ(1–42), is believed to play an important role in the pathogenesis of AD. Histone H1 is found in the cytoplasm of neurons in AD, and it has been shown to interact with aggregated amyloid-β peptides and with amyloid fibrils. We have used Thioflavin T (ThT) fluorescence enhancement, circular dichroism spectroscopy (CD), coprecipitation, and transmission electron microscopy (TEM) to study the interaction of histone H1 with Aβ(1–42). Both freshly prepared (monomeric) Aβ(1–42) and histone H1 solutions showed negative CD bands typical of the random coil. Mixing Aβ(1–42) and histone H1 led to the loss of the random coil, which was replaced mostly by β-structure. Therefore, both Aβ(1–42) and histone H1 behave as intrinsically disordered proteins with coupled binding and folding. Mutual structure induction demonstrates the interaction of Aβ(1–42) and histone H1. The interaction was confirmed by coprecipitation followed by SDS-PAGE. Mutual structure induction was also observed with the H1 terminal domains. Incubation of Aβ(1–42) for 1 week in the presence of histone H1 led to the formation of laminar aggregates and thick bundles, characterized by the parallel association of large numbers of fibrils. The aggregates were particularly large and ordered with the H1 subtype H1.2. Further aging of the complexes led to tight compaction of fibril bundles and to fiber growth. Stabilization of fibril–fibril interactions appeared to be determined by the C-terminal domain of histone H1. In summary, these observations indicate that histone H1 has at least two effects: it helps the folding of Aβ monomers and stabilizes the parallel association of fibrils

Three-photon infrared stimulation of endogenous neuroreceptors in vivo

To interrogate neural circuits and crack their codes, in vivo brain activity imaging must be combined with spatiotemporally precise stimulation in three dimensions using genetic or pharmacological specificity. This challenge requires deep penetration and focusing as provided by infrared light and multiphoton excitation, and has promoted two-photon photopharmacology and optogenetics. However, three-photon brain stimulation in vivo remains to be demonstrated. We report the regulation of neuronal activity in zebrafish larvae by three-photon excitation of a photoswitchable muscarinic agonist at 50 pM, a billion-fold lower concentration than used for uncaging, and with mid-infrared light of 1560 nm, the longest reported photoswitch wavelength. Robust, physiologically relevant photoresponses allow modulating brain activity in wild-type animals with spatiotemporal and pharmacological precision. Computational calculations predict that azobenzene-based ligands have high three-photon absorption cross-section and can be used directly with pulsed infrared light. The expansion of three-photon pharmacology will deeply impact basic neurobiology and neuromodulation phototherapies

In vivo photocontrol of orexin receptors with a nanomolar light-regulated analogue of orexin-B

Orexinergic neurons are critically involved in regulating arousal, wakefulness, and appetite. Their dysfunction has been associated with sleeping disorders, and non-peptide drugs are currently being developed to treat insomnia and narcolepsy. Yet, no light-regulated agents are available to reversibly control their activity. To meet this need, a photoswitchable peptide analogue of the endogenous neuroexcitatory peptide orexin-B was designed, synthesized, and tested in vitro and in vivo. This compound (photorexin) is the first photo-reversible ligand reported for orexin receptors. It allows dynamic control of activity in vitro (including full agonism, nanomolar activity, and subtype selectivity to human OX2 receptors) and in vivo in zebrafish larvae by direct application in water. Photorexin induces dose- and light-dependent changes in locomotion and a reduction in the successive induction reflex that is associated with sleep behavior. Molecular dynamics calculations indicate that trans and cis photorexins adopt similar bent conformations and that the only discriminant between their structures and activities is the positioning of the N-terminus at the extracellular region of the orexin receptor. Thus, our approach could be extended to a broad and important family of neuropeptides that share a “message-address” mechanism when binding to their cognate receptors