Ultrastructural analysis of HIV-1 infection in human cells

Das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) ist der Auslöser des erworbenen Immundefizienz-Syndroms (acquired immune deficiency syndrome, AIDS). HIVInfektion, weltweit eine der problematischsten Infektionskrankheiten, betrifft etwa 40 Millionen Menschen und tötet schätzungsweise 3 Millionen Menschen jährlich. Obwohl die Behandlung von HIV-Patienten heute möglich ist, gibt es weiterhin keinen Impfschutz und keine Heilung. Mit der vorliegenden Arbeit habe ich Zellbiologie und Virologie vereint, um mittels quantitativer Elektronenmikroskopie (EM) neue Einblicke in die HIV-Infektion zu gewinnen. Im ersten Teil habe ich die Verteilung eines zellulären, ESCRT benannten, Proteinkomplexes analysiert. ESCRT ist essentiell für die Freisetzung von HIV aus infizierten Zellen und spielt sowohl beim Sortieren von Proteinen in die internen Vesikel eines multivesikulären endosomalen Kompartiments (multivesicular body, MVB) als auch bei der Bildung dieser Vesikel eine Rolle. ESCRT fand sich im gesamten endosomalen System einschliesslich der Plasmamembran, und war besonders an tubulär-vesikulären endosomalen Membranen, aber nicht an MVBs, angereichert. Entgegen der Erwartungen führte HIV-Infektion nicht zu einer Umverteilung von ESCRT zu den Orten der Virusfreisetzung aus Zellen, der Plasmamembran in primären humanen T Zellen bzw. Endosomen in Makrophagen. In T-Zellen fand sich mehr ESCRT an der Plasmamembran als in Makrophagen, was darauf hindeutet, dass endogene ESCRT Mengen für die HIV-Freisetzung hinreichend sind. Die Ergebnisse weisen auch auf eine bisher unbekannte Rolle von tubulär-vesikulären endosomalen Membranen bei der Funktion von ESCRT hin. Im zweiten Teil habe ich den Ort der HIV-Freisetzung aus infizierten Makrophagen mittels EM untersucht. Neuere Studien wiesen darauf hin, dass neu gebildete HIV-Partikel in die Endosomen infizierter Makrophagen entlassen werden und somit in intrazellulären Speichern akkumulieren, die die Heilung infizierter Patienten erschweren könnten. Übereinstimmend mit bekannten Daten zeigte unsere EM-Analyse von Makrophagen, dass Viren in grossen, intrazellulären Vakuolen akkumulierten. Eine Methode zur eindeutigen Unterscheidung von endosomalen Membranen und der Plasmamembran offenbarte aber die komplexe Morphologie der Plasmamembran mit vielen Aus- und Einstülpungen. In diesen tiefen Einstülpungen, die nicht von endosomalen Membranen, sondern von der Plasmamembran begrenzt werden, wurden Viruspartikel freigesetzt und angehäuft. Dieses Ergebnis eröffnet einen neuen Blickwinkel auf die HIV-Infektion von Makrophagen, besonders deren mögliche Rolle bei der Persistenz von Viren. Zusammenfassend haben diese Daten eine wichtige Bedeutung hinsichtlich der scheinbar zentralen Rolle von MVBs/Endosomen bei der HIV-Freisetzung als auch der Rolle von ESCRT bei deren Bildung

The Regulated Secretory Pathway in CD4+ T cells Contributes to Human Immunodeficiency Virus Type-1 Cell-to-Cell Spread at the Virological Synapse

Direct cell-cell spread of Human Immunodeficiency Virus type-1 (HIV-1) at the virological synapse (VS) is an efficient mode of dissemination between CD4+ T cells but the mechanisms by which HIV-1 proteins are directed towards intercellular contacts is unclear. We have used confocal microscopy and electron tomography coupled with functional virology and cell biology of primary CD4+ T cells from normal individuals and patients with Chediak-Higashi Syndrome and report that the HIV-1 VS displays a regulated secretion phenotype that shares features with polarized secretion at the T cell immunological synapse (IS). Cell-cell contact at the VS re-orientates the microtubule organizing center (MTOC) and organelles within the HIV-1-infected T cell towards the engaged target T cell, concomitant with polarization of viral proteins. Directed secretion of proteins at the T cell IS requires specialized organelles termed secretory lysosomes (SL) and we show that the HIV-1 envelope glycoprotein (Env) localizes with CTLA-4 and FasL in SL-related compartments and at the VS. Finally, CD4+ T cells that are disabled for regulated secretion are less able to support productive cell-to-cell HIV-1 spread. We propose that HIV-1 hijacks the regulated secretory pathway of CD4+ T cells to enhance its dissemination

HIV-1 Buds Predominantly at the Plasma Membrane of Primary Human Macrophages

HIV-1 assembly and release are believed to occur at the plasma membrane in most host cells with the exception of primary macrophages, for which exclusive budding at late endosomes has been reported. Here, we applied a novel ultrastructural approach to assess HIV-1 budding in primary macrophages in an immunomarker-independent manner. Infected macrophages were fed with BSA-gold and stained with the membrane-impermeant dye ruthenium red to identify endosomes and the plasma membrane, respectively. Virus-filled vacuolar structures with a seemingly intracellular localization displayed intense staining with ruthenium red, but lacked endocytosed BSA-gold, defining them as plasma membrane. Moreover, HIV budding profiles were virtually excluded from gold-filled endosomes while frequently being detected on ruthenium red–positive membranes. The composition of cellular marker proteins incorporated into HIV-1 supported a plasma membrane–derived origin of the viral envelope. Thus, contrary to current opinion, the plasma membrane is the primary site of HIV-1 budding also in infected macrophages

Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision

New methodology improves the spatial resolution and sensitivity of correlative light and EM tomography, revealing new insights into dynamic cellular processes

Coatomer and dimeric ADP ribosylation factor 1 promote distinct steps in membrane scission

During membrane budding, coatomer drives initial curvature of the bud, whereas dimeric Arf1 is necessary for membrane scission

High-throughput ultrastructure screening using electron microscopy and fluorescent barcoding.

Genetic screens using high-throughput fluorescent microscopes have generated large datasets, contributing many cell biological insights. Such approaches cannot tackle questions requiring knowledge of ultrastructure below the resolution limit of fluorescent microscopy. Electron microscopy (EM) reveals detailed cellular ultrastructure but requires time-consuming sample preparation, limiting throughput. Here we describe a robust method for screening by high-throughput EM. Our approach uses combinations of fluorophores as barcodes to uniquely mark each cell type in mixed populations and correlative light and EM (CLEM) to read the barcode of each cell before it is imaged by EM. Coupled with an easy-to-use software workflow for correlation, segmentation, and computer image analysis, our method, called "MultiCLEM," allows us to extract and analyze multiple cell populations from each EM sample preparation. We demonstrate several uses for MultiCLEM with 15 different yeast variants. The methodology is not restricted to yeast, can be scaled to higher throughput, and can be used in multiple ways to enable EM to become a powerful screening technique.This work was financially supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1129 Z2 to J.A.G. Briggs), EMBL (to J.A.G. Briggs), the Medical Research Council (MC_UP_1201/16 to J.A.G. Briggs), and the German Ministry of Education and Research (031A605 to K.R. Patil). The Schuldiner laboratory is supported by the European Research Council CoG 646604 Peroxisystem, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant SFB1190 and a Deutsch-Israelische Projektkooperation [DIP] collaborative grant). N. Gabrielli was supported by the EMBL interdisciplinary postdoctoral program. M. Schuldiner is an incumbent of the Dr. Gilbert Omenn and Martha Darling Professorial Chair in Molecular Genetics