Maternal thyroid hormones role in Zebrafish neural development

Thyroid hormones (TH) are essential for proper embryonic development of the central nervous system. During this period maternal supply of TH is the only source of these hormones to the embryo. Using a zebrafish MCT8 knockdown model, with consequent inhibition of maternal thyroid hormones (MTH) uptake to the target cells, the aim of this thesis is to start a comprehensive understanding of the role of MTH during embryonic neural development. We characterised the transcriptome in 25hpf CTRL and MCT8MO zebrafish embryos and found 4,343 differentially expressed genes. Reactome analysis show that MTH regulate the expression of core developmental pathways such as NOTCH, SHH and WNT. The cellular distribution of neural MTH-target genes demonstrated their cell specific action on neural stem cells and differentiated neuron classes. We identified a series of genes involved in several key neurogenic processes to be modulated by MTH. By analysing these genes by qPCR in a temporal series, from the start of segmentation through hatching, we determined the developmental time-window where MTH are required for appropriate CNS development. We show MTH are involved in the regulation of NOTCH pathway components such as notch1a, dla, dld, her2 and her4 during neurogenesis, whereas neuroectodermal genes are not affected. Response to MTH begins at 12hpf, and the time window between 22-25hpf is particularly sensitive to MTH action. Overall, these results, show that MTH is not involved in neuroectoderm specification nor CNS compartmentalisation but stress the involvement of MTH in the early stages of neurogenesis by promoting the maintenance of specific neural progenitor populations. Analyzing the cytoarchitecture of the spinal cord we found that by the end of embryogenesis cells populating the spinal cord of control and MCT8 MO zebrafish are substantially different. Lack of thyroid hormone uptake leads to a generalized disorganization of the neural tissue, together with a decrease in: neural stem cells population, subpopulations of neuron progenitor cells, radial glial cells, mature glial cells and oligodendrocyte precursors, while the primary motor neuron domain was maintained. Colocalization analysis of neural progenitors with thraa, thrab and mct8 allowed identifying cells under the regulation of MTH via MCT8. Survival and proliferation of neural progenitor cells are compromised in MCT8MO, which could later impact on the diversity of neural cell populations obtained in the end of embryogenesis. Analysis of cell autonomous Notch activation showed it cannot rescue the phenotype induced by the lack of MTH demonstrating the niche importance in the regulation of TH action. Given that MTH regulate several important morphogenetic pathways it is likely that its action occurs as an integrator enabling an adequate equilibrium between all these signals in a time a context dependent manner. MTH actions are reflected on the timely development of neurons and glial cells. It is of great interest to continue to explore the significance of these findings to further clarify the genetic and cellular causes underlying human AHDS syndrome. In conclusion with this work, we show that thyroid hormone transferred from the mother to the embryo allows the enrichment of neural progenitor pools and the generation of cell diversity necessary to produce a fully functional central nervous tissue.As hormonas da tiróide (TH) são essenciais para o correto desenvolvimento embrionário do sistema nervoso central (CNS). Durante este período o fornecimento de hormona da tiróide pela via materna é a única fonte destas hormonas para o embrião, uma vez que a produção endógena desta hormona é iniciada apenas numa fase posterior do desenvolvimento. Evidências mostram que mesmo níveis baixos de deficiência de hormona da tiróide na mãe estão associados a desordens neurológicas e psiquiátricas nos filhos. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ação desta hormona no embrião e feto continuam amplamente desconhecidos. Em humanos, mutações no principal transportador celular de TH, MCT8, causa a síndrome de Herndon-Dudley (AHDS). Esta síndrome é caracterizada pelo atraso mental, atraso global no desenvolvimento, impossibilidade de falar e uma deficiência neuromotora severa. O MCT8 é o principal transportador de hormona da tiróide presente no embrião. No presente trabalho utilizamos o “knockdown” deste transportador, inibindo a sua tradução, no modelo de peixe zebra. Este modelo foi previamente estabelecido e possui características semelhantes à síndrome AHDS humana. Neste modelo o transporte da hormona da tiróide materna (MTH) para as células alvo é bloqueado, uma vez que o MCT8 está ausente, inibindo a ação da hormona. O objetivo desta tese é começar a compreender o papel destas hormonas durante o desenvolvimento neural embrionário. Para isso caracterizamos o transcriptoma de peixe-zebra CTRL e MCT8MO às 25 horas pósfertilização (hpf) por RNA-seq. Foram encontrados 4343 genes diferencialmente expressos. A análise utilizando o Reactome revelou que a MTH está envolvida direta ou indiretamente na expressão de genes pertencentes a importantes vias de sinalização, incluindo Notch, Shh e Wnt. A análise da distribuição celular de genes alvo da MTH por hibridação in-situ revelou uma ação celular específica em células estaminais neurais, mas também sobre várias classes de neurónios diferenciados. A análise transcriptómica revelou também que uma série de genes envolvidos em vários passos de processos-chave da neurogénese são modulados pela MTH. Analisando alguns destes genes numa série temporal desde a fase da segmentação até à eclosão do embrião de peixe-zebra por qPCR, determinamos a janela temporal na qual a MTH é necessária para um correto desenvolvimento do sistema nervoso central no peixezebra. Mostramos que a MTH está envolvida na regulação de componentes da sinalização Notch, tais como notch1a, dla, dld, her2 e her4 durante o processo de neurogénese, enquanto que genes envolvidos na formação e manutenção da neuroectoderme não são regulados pela MTH. A resposta à ausência de MTH inicia-se às 12hpf, sendo que a janela de desenvolvimento entre as 22 e 25hpf parece ser particularmente sensível à ação da MTH. Globalmente estes resultados mostram que a MTH não está envolvida na indução neural, nem na compartimentalização do sistema nervoso central. No entanto é demonstrada a importância da MTH na fase inicial da neurogénese pela promoção da manutenção de populações de células progenitoras neurais. A análise à citoarquitectura da medula espinhal revelou que na fase final do desenvolvimento embrionário as células neurais presentes em embriões CTRLMO e MCT8MO diferem substancialmente. A diminuição de transporte de MTH para as células alvo leva a uma desorganização geral do tecido neural, para além duma redução em células estaminais neurais, subpopulações de células progenitoras de neurónios, células radiais gliais, células da glia maduras e progenitoras de oligodendrócitos; enquanto que a população de neurónios motores primários é mantida na ausência de MTH. Análise de colocalização de células progenitoras neurais her2(+), dla(+) e fabp7a(+) com RNAm de componentes do metabolismo da hormona da tiroide, nomeadamente recetores (thraa e thrab) e o transportador mct8, permitiu a identificação de células que estão sob a regulação da MTH. Um dos papeis clássicos da TH envolve a sobrevivência a proliferação celulares, no entanto a sua função varia com o tipo celular, o estadio de desenvolvimento e contexto celular. Verificámos que em embriões MCT8MO a sobrevivência e proliferação de células progenitoras neurais her2(+) e dla(+) estava comprometida, tanto na medula espinhal como no romboencéfalo. Este facto pode impactar a diversidade das células neurais obtidas no final da embriogénese. Na verdade, a divisão assimétrica de células progenitoras originando células da glia ou progenitoras intermediárias está diminuída nos embriões MCT8MO, mostrando um possível papel da MTH na sua formação. Com vista a esclarecer o papel da MTH sobre a sinalização Notch procedeu-se à ativação da sinalização Notch em células neurais da espinhal medula de embriões MCT8MO e CTRLMO. Esta sobre-expressão celular isolada da sinalização Notch em células individuais mostrou ser insuficiente para recuperar o fenótipo induzido pela falta de MTH, demonstrando a importância do nicho celular na regulação da ação da MTH. A ação da MTH parece estar envolvida no memanismo de divisão assimétrica de células neuroepiteliais. Este tipo de divisão está na origem da diversidade de células neurais obtidas. Um reflexo da perda deste tipo de divisões na espinhal medula pode ser a perda de progenitores intermediários que expressam neurogenina 1 e neurod6b. Dado que a MTH regula várias vias morfogenéticas é provável que a sua ação seja a de integradora entre estas vias, permitindo o equilíbrio entre estes sinais num determinado tempo e contexto celular específicos. As ações da MTH refletem-se no desenvolvimento correto e atempado de neurónios e células da glia. É de grande interesse continuar a explorar o significado destas descobertas, nomeadamente para esclarecer as causas genéticas e celulares que causam a síndrome de Herdnon-Dudley (AHDS). Foi desenvolvido um modelo de ação da MTH durante o desenvolvimento no peixe zebra, em que em subpopulações de células progenitoras contendo MCT8 e recetores da hormona da tiroide (sensíveis a TH) na ausência desta sofrem apoptose e/ou redução na proliferação em momentos distintos do desenvolvimento neural. As células progenitoras não responsivas à TH prosseguem o seu desenvolvimento. O balanço final será uma diminuição da diversidade de progenitores neurais e consequente perda na variedade de neurónios e células da glia maduros. Este efeito a nível celular terá efeito na função do CNS. Em conclusão este trabalho mostra que a hormona da tiroide transmitida da mãe para o embrião e que dá entrada nas células alvo através do MCT8 permite o desenvolvimento de populações de progenitores neurais e o consequente enriquecimento da diversidade celular, necessária à formação de um sistema nervoso central funcional.This study received Portuguese national funds from operational programmes CRESC Algarve 2020 and COMPETE 2020 through project EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER- 022121. The author was a recipient of a FCT PhD grant SFRH/BD/111226/201

Expression of matrix gla protein (MGP) in breast cancer: a molecular and cellular approach

Dissertação de mestrado, Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017Every year around 8.2 million people die due to cancer, in Portugal, breast cancer is the leading cause of women death (in cancer patients). Several risk factors could be pointed being age (over 50 years old), gender (females), reproductive and hormonal factors and genetic predisposition (presence of mutations in BRCA 1 and BRCA 2) the most commons. Staging is done regarding several aspects, e.g.: histology, histopathologic localization, hormone receptors, mutations or expression of cluster genes. Research from last decades is focused into targeted therapies. MGP, matrix Gla protein, was pointed as a possible target. MGP primary structure consists in a signal peptide, a phosphorylation domain and a γ-carboxylase recognition site. MGP has also five Gla residues. For a long time, only an isoform with four exons was known, but recently was discovered a second isoform with five exons, with three additional putative binding sites, conferring, possible, a higher binding capability as well as a presumably higher calcification inhibitory power. Although MGP role in cancer is not fully understood, being upregulated in some types of tumors and downregulated others, in breast cancer, was established, as a prognostic factor, being overexpressed in poor diagnose cases. Being MGP role in tumorigenesis to be defined, the aims of this work were: clarify MGP expression in normal vs tumoral tissue (using in silica method – TCGA database); as well as clarify regulatory mechanisms of MGP (TCGA database); analyze expression of each isoform in breast cancer cell lines (results were obtained performing qRT-PCR followed by electrophoresis and sequencing of the extracted bands) and assess the result of overexpression of each isoform (using XTT and wound healing assay). We could conclude that both variants could be expressed in simultaneous. Every cell line presented E4 isoform but just a few presented E5 isoform. Hound healing assay revealed that an overexpression of E4 and E5 variants slow down the rate of the area invaded by migrating cells, specially an overexpression of E4 isoform. After in silica analyze we could conclude that MGP is more expressed in tumoral tissue vs normal tissue, existing a negative correlation between MGP expression and mir155 expression and methylation, that means that: in tumoral tissue mir155 is less expressed than in normal tissue and occurs an hypomethylation in tumoral tissue. Knowing that MGP inhibits calcification and is correlated with angiogenesis, our hypothesis is that overexpression of MGP in tumoral tissue is a mechanism of cancer to facilitate angiogenesis – a hallmark of cancer.Introdução: o cancro é caracterizado por um crescimento anormal e incontrolado de células que podem adquirir características malignas por acumulação de mutações. Hanahan and Weinberg (2000) descreveram que o desenvolvimento tumoral baseado em vários passos está assente na aquisição, por parte do tumor, de seis princípios biológicos: i) manter sinalização proliferativa; ii) desenvolver mecanismos de defesa contra supressores de crescimento; iii) resistir á morte celular; iv) ativar imortalidade replicativa, v) induzir angiogénese e vi) ativar invasão e metástase. Se uma visão mais tradicional atribuía estas alterações ao resultado de mutações genéticas, uma visão mais atual do cancro engloba também a epigenética como fator crucial na repressão e ativação de genes capazes de conferir as características malignas aos tumores; a metilação genómica é um exemplo de um mecanismo já descrito com um papel importante na atividade tumoral, sendo que está associado a hipometilação do genoma com o cancro. Determinar os mecanismos moleculares desta doença aproximam a população científica de terapias alvo que permitam ajudar a controlar a disseminação desta doença que é considerada pela organização mundial de saúde uma doença epidémica em ascensão. Todos os anos morrem no mundo 8.2 milhões de pessoas devido a cancro (cerca de 13% de todas as mortes do mundo), sendo a segunda causa de morte em Portugal, EUA e Europa. Em Portugal, o cancro do pulmão e brônquios é a primeira causa de morte por cancro nos homens, enquanto que a primeira causa de morte por cancro nas mulheres é o Cancro da Mama (CM). Existem vários fatores de risco para o CM, sendo os principais: i) idade acima dos 50 anos; ii) ser do sexo feminino (apenas 1% dos casos corresponde a homens); iii) história pessoas ou familiar de CM; iv) fatores reprodutivos e hormonais; v) exposição endógena a estrogénios (como p.e. uso da pílula) e vi) predisposição genética (comumente mutação nos genes BRCA1 e BRCA2). O estadiamento da doença é feito usando TNM (avalia tamanho do Tumor, Nódulos e Metástases). Contudo, outras características são usadas em cancro para definir o tratamento, nomeadamente: localização histopatológica (divide os carcinomas in situ dos carcinomas invasivos); expressão de determinados recetores hormonais e expressão de genes em clusters/aglomerados (conferindo a divisão em Luminal A, Luminal B, HER2 e tipo basal), sendo que nas últimas décadas tem se procurado encontrar terapias direcionas, sendo que cada vez mais se procuram novos alvos terapêuticos. Um possível alvo terapêutico é a MGP (proteína Gla da matriz). Está localizada no braço pequeno do cromossoma 12 (12p12.3) e é uma proteína dependente da vitamina K. A sua estrutura primária consiste num péptido de sinal, um domínio de fosforilação e um local de reconhecimento da γ-carboxilase; tem também cinco resíduos Gla que após conversão pela enzima γ-glutamil carboxilase passam a ter uma maior afinidade para minerais e iões minerais (como o cálcio, fosfato e cristais de hidroxiapatite – componentes minerais do esqueleto). Durante muito tempo apenas uma variante era conhecida E4 (quatro exões) contudo foi identificada uma nova isoforma: E5 (cinco exões), que apresenta três locais putativos adicionais de ligação a γ-carboxilação; esta característica pode provocar um aumento da sua capacidade de ligação, levando a um poder inibitório mais forte. MGP está associada à inibição de calcificação (devido à sua afinidade de ligação mineral e iónica), e mutações neste gene estão associadas a aterosclerose (calcificação vascular), síndrome de Keutel e cancro. No caso do cancro estudos revelam um papel na diferenciação, proliferação e migração celular, no início da angiogénese e na tumorigénese. Contudo o seu papel na oncogénese e a correlação entre a sua expressão e o tipo de tumores está ainda por determinar; sendo que para alguns tipos de tumores, apresenta maior expressão no tecido tumoral e em outros mais em tecido normal. No cancro da mama contudo, tem sido apontado como fator de prognóstico, estando a sua sobreexpressão associada a um pior prognóstico. Objectivos: Estando o papel da MGP no cancro ainda por definir, o principal objetivo deste trabalho passa por tentar correlacionar a sua expressão em tecido normal e tumoral assim como em subgrupos de pacientes; clarificar a expressão das variantes em linhas celulares do cancro da mama, assim como qual o resultado a sobreexpressão das variantes na proliferação e migração celular e, identificar mecanismos regulatórios da MGP e o sua expressão em tecido normal vs tumoral. Materiais e métodos: Para cada linha celular foi averiguado qual a(s) variante(s) expressa(s), recorrendo para isso a qRT-PCR e posteriormente a uma confirmação por sequenciação das bandas obtidas por electroforese, das amostras do qRT-PCR. O efeito da sobreexpressão das isoformas na proliferação e migração celular foi avaliado em duas linhas celulares da mama (linhas não comerciais) previamente transfetadas com o plasmídeo de interesse (E4, E5 e um vector vazio usado como controlo) que foram sujeitadas a ensaios de XTT e do risco. A relação entre a expressão da MGP em tecidos tumorais, assim como a análise da expressão do mir155 foi averiguada recorrendo a um estudo in silico a partir da base de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA). Usou-se esta ferramenta também para avaliação da metilação de quatro CpGs da MGP. Contudo, fez-se também uma avaliação de uma CpGs na linha celular de cancro da mama T47D, fazendo inicialmente um tratamento com 5-azacitidina para desmetilar o genoma. A análise da metilação foi feita recorrendo a um tratamento com bissulfito e posterior análise por PCR. Conclusão: As duas variantes podem ser expressas em simultâneo, sendo que em todas as linhas celulares em estudo foi comprovada a expressão da variante E4, já a variante E5 não foi detetada em várias linhas celulares. Ensaio do risco mostrou que uma maior expressão da MGP (tanto variante E4 como E5, sendo que na variante E4 os resultados foram mais significativos) parece promover uma diminuição da taxa de migração celular, sendo que após as 72h de ensaio as células não transfectadas (ou transfetadas com vetor vazio) tinham já ocupado 100% da área, enquanto que as células transfetadas com E5 só foi possível verificar os 100% às 96h, e nas células transfetadas com E4 ao fim das 96h ainda não tinha ocorrido 100% de área invadida. Os ensaios in silico demostraram que a MGP está mais expressa no tecido tumoral, e que há uma correlação negativa entre expressão da MGP e metilação (ocorrendo uma hipometilação no tecido tumoral) assim como com a expressão de mir155. Sabendo que MGP inibe calcificação e, está relacionada com a angiogénese, parece que a maior expressão da MGP em tecido tumoral seja um mecanismo do tumor para promover a angiogénese – uma marca do cancro (Hallmark of Cancer)

Certification of quality management systems under ISO 9000 versus business bottom line: empirical evidence

Esta investigación, tiene como objetivo principal la posible correlación entre la calidad y los beneficios que proporciona, tanto humanos, económicos y tecnológicos, materializados en un incremento de los resultados, lo que permitirá algunas empresas resolver los desafíos y oportunidades en el mundo de hoy, cada vez más interconectado. La aplicación de las herramientas de calidad puede resultar clave para el éxito de las organizaciones, proporcionando una ventaja competitiva en la actual economía mundial y una mayor satisfacción de sus clientes en términos del valor que perciben. De forma más explicita, esta investigación pretende demostrar la relación entre la certificación ISO 9001, la medición de los costes de la calidad y los resultados de la empresa, sobre la base de un estudio empírico. Por lo tanto, este trabajo de investigación tiene como objetivo estudiar y entender la importancia de aplicar sistemas de gestión de calidad total y control de costes en la gestión de la calidad de la empresa. En particular, estamos especialmente interesados en si la aplicación de estas herramientas aumenta el resultado de la empresa. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un estudio empírico de las empresas certificadas por el NP EN ISO 9001:2000, en Portugal, en la región de Ribatejo (Distrito de Santarém) y recopilar datos sobre si la empresa añade valor.Quality is the main focus of the current paper, as well as the great importance of its benefits to businesses. These benefits, which shall consubstantiate increased earnings, are deemed as significant to companies from an economical, technological and human resources point of view, considering also that its development may facilitate the entrepreneurial capacity of firms to deal with the ever evolving challenges and opportunities of the current interconnected world. More specifically, the current investigation aims to demonstrate the existence of an objective relation between the standard ISO 9000 certification, quality costs measuring and earnings, based on our empirical study. So, the current investigation was aimed to study and understand the importance of the implementation of total quality management systems as well as quality cost control in a firm’s quality management system. In particular we would like to understand whether the implementation of quality tools has a positive influence in a firm’s earnings. In order to fulfil such objective within the Portuguese context, we have developed an empirical study which targeted companies accredited under NP EN ISO 9001:2000 on a particular sub-region of Portugal (Ribatejo, Santarém’s district), and collected data in order to verify whether the implementation of such quality management systems adds value to those companies

Nosocomial and community-acquired urinary tract infections

No passado, acreditava-se que o trato urinário fosse um local estéril, onde a aquisição de bactérias era um fator disruptivo para o aparecimento de infeções do trato urinário. Estudos clínicos contradizem essa ideologia, confirmando a presença de um microbioma saudável, com mecanismos de defesa importantes. As infeções do trato urinário são consideradas a segunda causa mais comum de doenças infeciosas, assumindo 40% de todas as infeções nosocomiais e a maioria das infeções adquiridas na comunidade. Importa reiterar que muitas destas são desenvolvidas em pacientes saudáveis, sem comorbilidades. As repercussões financeiras das infeções do trato urinário são enormes, principalmente devido à sua elevada incidência. Dois exemplos, como a cistite e a pielonefrite, são os principais contribuintes para este problema de saúde. Os custos incluem prescrições de antibióticos, ausências laborais por doença, despesas de hospitalização, entre outos. Adicionalmente, o fator de recorrência acaba por avultar os custos associados a uma infeção urinária. Um dos grandes problemas que surge é a crescente resistência antibiótica, uma vez que o tratamento usual das infeções urinárias exige este tipo de prescrição. O associado uso excessivo de antibióticos causa problemas preocupantes, não só para a segurança do paciente, como também para a comunidade envolvente. Desta forma, o médico deve não só questionar a gravidade da infeção, mas ainda, se existe benefício no tratamento antibiótico de um determinado paciente. Para mudar o paradigma da resistência aos antibióticos estão a ser desenvolvidas novas estratégias de tratamento e medidas profiláticas. No entanto, existe ainda um longo caminho para ser percorrido, através da amplificação do número de estudos clínicos e do aprofundamento do conhecimento tanto do microbioma existente no trato urinário como das opções terapêuticas que dele podem resultar.Formerly it was thought that the urinary tract was a sterile place, where the acquisition of bacteria was a disruptive factor for the appearance of urinary tract infections. Nowadays, the clinical studies contradict this ideology, confirming the presence of a healthy microbiome, with important defence mechanisms. Urinary tract infections are considered the second most common cause of infectious diseases, assuming 40% of all infections acquired in the hospitals and the majority of community-acquired infections. It is noteworthy that many of these are developed in healthy patients, without comorbidities. The financial implications of urinary tract infections are enormous, predominantly a result of its high incidence. Two examples of it, such as cystitis and pyelonephritis, are major contributors to the overall health burden. The costs include antimicrobial prescriptions, sick days, hospitalization expenses, among others. Furthermore, the recurrence factor ends up looming the costs associated with a urinary infection. One of the big problems arising is the growing resistance to antibiotics, since the usual treatment of urinary infections requires antibiotic prescription. The associated antibiotic overuse causes serious problems, not only for the specific patient safety but for the surrounding community. Thus, the physician must question not only the state of the infection, but if there is benefit in a certain patient’s antibiotic treatment. To shift the paradigm of antibiotic resistance, new treatment strategies and prophylactic measures are emerging. However, there is still a long way to go, through the amplification of the number of clinical studies and the knowledge of both the microbiome existing in the urinary tract and the therapeutic options that may result from it.Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia

Social reincorporation of FARC-EP's former combatants: The case of the Colombian Peace Agreement 2016

Four years after the implementation of the 2016 Peace Agreement in Colombia, this dissertation evaluates the development of the measures related to the social reincorporation of the FARC-EP into the community. The social reincorporation of former combatants was considered, since the beginning of the debates on the Agreement, as one of the key factors for the success and consolidation of the peace process. The study uses a triangulation method that includes document analysis and interviews, stemming from fieldwork in Colombia, supported by scientific articles and meetings, as well as nonparticipant observation in conferences. This work analyses the perceptions of the actors involved and the guerrilla who seeks to reincorporate into a social life within a legal framework. Although the existing literature is critical about the degree of success, this work shows that social reincorporation, in general, is being achieved, with some exceptions in which the Agreement likely will have to be adapted to the current needs and urgencies.Quatro anos após a implementação do Acordo de Paz de 2016 na Colômbia, esta dissertação avalia a implementação de medidas relacionadas com a reintegração social das FARC-EP na vida civil. A reinserção social da guerrilha foi considerada, desde o início dos debates em torno do acordo, como um dos fatores-chave para o sucesso e consolidação do processo de paz. Este estudo utiliza uma triangulação de métodos que inclui análise documental e entrevistas, resultado de trabalho de campo na Colômbia, suportadas por artigos científicos e reuniões, bem como observação não-participante em conferências. A investigação analisa também as perceções dos atores envolvidos e dos guerrilheiros que procuram reintegrar-se na vida social dentro do âmbito da lei. Embora a literatura existente seja crítica quanto ao grau de sucesso, este trabalho mostra que a reincorporação social, em geral, está sendo alcançada, com algumas exceções em que o Acordo terá provavelmente que ser adequado às necessidades e urgências do presente

The maximum multiplicity and the two largest multiplicities of eigenvalues in a Hermitian matrix whose graph is a tree

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