Molecular and functional analysis of mutations in the transcription factor ZNF687 associated to Paget disease of bone

The zinc finger protein ZNF687 is a transcription factor containing various Cys2-His2 zinc finger domains that has been related to Paget’s disease of bone (PDB) associated with giant cell tumor of bone. Recently, four mutations have been independently identified in a Southern Italian population, and were determined as predisposal (p.Ser242Ile, p.Pro665Leu, and p.Gln784Glu,) or causal (p.Pro937Arg) for development of PDB. Moreover, it has been suggested that ZNF687 plays an important role in bone metabolism in both human and zebrafish, and that the function of this protein might be conserved throughout evolution. Nonetheless, the mechanism by which ZNF687 affects bone metabolism, and hence, PDB, remains to be elucidated. To contribute to respond to these questions we have proposed to perform in silico analysis in order to investigate how these four mutations could affect the protein conformation and function, and in vitro analyses to evaluate how mutant ZNF687 (p.Pro937Arg, mediated by site-directed mutagenesis), ZNF687 overexpression (mediated by transient transfection) and ZNF687 knock-down (mediated by CRISPR-Cas9), could affect the expression of genes involved in bone metabolism. We also assessed the mineralization process of knock-down clones and evaluated specific gene expression. Lastly, comparative in silico and in vitro analyses were performed in order to define the usefulness of zebrafish as a biological model for ZNF687 study. Therefore, the mutation analysis suggested alterations in protein-protein and protein-acid nucleic interactions that might distort ZNF687 target genes expression and lead to PDB. Moreover, preliminary results suggested that ZNF687 might regulate genes involved in osteoblastogenesis and osteoclastogenesis, such as RUNX2, OSX, RANK, SQSTM1 and OPTN, while its role in mineralization remained uncleared. Finally, by identifying significant similarities in genomic structure, protein domain, and molecular players affecting znf687a, znf687b and ZNF687 transcription, together with the identification and characterization of promoter’s regions that regulate the transcription of znf687a and human ZNF687 genes, we have confirmed that zebrafish is a useful biological model system to study ZNF687.A proteína dedo de zinco 687 (ZNF687) é um fator de transcrição que contem vários motivos Cis2-His2, sendo um dos motivos mais comuns de ligação ao DNA encontrados nos fatores de transcrições dos eucariotas. O gene ZNF687 humano tem sido associado à várias doenças, nomeadamente à leucemia mielóide aguda, à doença óssea de Paget (DOP) severa associada ao tumor de células gigantes do osso, e ao carcinoma hepatocelular, advogando um putativo papel oncogénico. Além disso, foi demostrado que a expressão de RNA mensageiro do ZNF687 era significativamente aumentada durante a osteoclastogénese e a osteoblastogénese, tanto no humano como no peixe zebra, sugerindo um papel importante no metabolismo do osso, e uma conservação quanto à função desta proteína ao longo da evolução, apesar da especiação. A doença óssea de Paget é um distúrbio metabólico crónico e raro, caracterizado por áreas focais com exagerada remodelação óssea. Com efeito, uma atividade anormal dos osteoclastos leva à reabsorção óssea excessiva, que é por sua vez, rapidamente compensada por uma hiperatividade dos osteoblastos, células responsáveis pela formação do osso. A doença pode ser monostótica ou poliostótica, mas em ambos os casos, a estrutura óssea resultante é desorganizada, desformada e frágil. A etiologia da DOP não é bem conhecida, mas um fator genético está fortemente associado à doença, existindo também um fator ambiental. Foram identificadas várias mutações em diferentes genes, nomeadamente no sequestossoma 1 (SQSTM 1), fator estimulante de colónia 1 (CSF-1), membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 11a (TNFRSF11A), superfamília 7 transmembrana 4 (TM7SF4), optineurina (OPTN), ras e intercatores rab 3 (RIN3), proteína contendo valosina (VCP), nucleoporina 205 (NUP205) e mais recentemente, ZNF687 e ribonucleoproteína nuclear heterogênea A2 / B1 (hnRNPA2B1). Recentemente, foram descritas, em estudos independentes, numa população do sul da Itália, quatro mutações associadas a DOP: três delas foram identificadas como não causais (p.Ser242Ile, p.Pro665Leu, e p.Gln784Glu) e uma delas (p.Pro937Arg) foi determinada como necessária e suficiente para desenvolver a DOP. O mecanismo pelo qual a ZNF687 afeta o metabolismo ósseo e deste modo pode causar a DOP, ainda não foi esclarecido. Para responder a estas questões, propusemos fornecer dados, realizando vários estudos in silico e in vitro. Deste modo, para estudar o efeito das mutações descritas na proteína ZNF687, efetuaram-se análises de comparação da estrutura da proteína normal versus a estrutura da proteína com as diferentes mutações. As mutações associadas a DOP não mostraram nenhuma alteração na estrutura secundária da proteína, no entanto, as diferenças nas propriedades entre os resíduos “wild-type” (WT) e os resíduos mutados podem levar às alterações, tanto na conformação local, como na interação de proteína-proteína ou de proteína-ácido nucleico. Contrariamente às mutações p.Ser242Ile e p.Pro665Leu, que não se encontram num domínio funcional, a mutação p.Glu784Gln ocorre na extremidade C-terminal de um domínio dedo de zinco (ZF), podendo afetar a interação aminoácido-DNA especifica deste local. A mutação p.Pro937Arg gera uma carga positiva adicional antes do local de sinalização nuclear (NLS). O resíduo mutado acaba por fazer parte deste NLS, tornando-o mais forte, o que pode levar a um aumento da translocação da proteína para o núcleo. Após estes resultados preliminares, fomos avaliar a expressão de genes putativos alvos da ZNF687, que estão descritos como estando envolvidos no metabolismo do osso. Para isto, a região codificante do gene, inserida num vetor de expressão, foi submetida ao processo de mutagénese dirigida para se reproduzir a mutação p.Pro937Arg. Esta construção foi posteriormente utilizada na transfeção de células SaOS-2, em paralelo com o vetor contendo a forma normal, para induzir a sobre-expressão da ZNF687 mutada e normal. Outra estratégia do nosso trabalho consistiu na obtenção de clones de células SaOS-2, em que efetuámos a repressão do gene ZNF687 através da ferramenta de edição génica, CRIPSR-Cas9. Tanto nas células submetidas a sobre-expressão como nos clones “knock-down”, o RNA foi extraído e a expressão dos níveis de mRNA de vários genes de interesse foi analisada por PCR quantitativo. Em seguida, estudámos também o processo de mineralização nos clones “knock-down” e avaliámos a expressão dos genes alvos da ZNF687. Os nossos dados preliminares sugeriram que a ZNF687 poderia desempenhar um papel regulador de RUNX2 e OSX, dois genes envolvidos na osteoblastogénese, e de RANK, SQSTM1 e OPTN, genes envolvidos na osteoclastogénese através da via de sinalização do NF-κB induzida por RANKL. No entanto, não foi possível determinar se a regulação do SQSTM1 e de OPTN pela ZNF687 dá-se de uma forma direta ou se é feita através da regulação de RANK. O mesmo pode acontecer no caso da regulação do OSX, podendo este ser diretamente regulado pelo RUNX2 e indiretamente pela ZNF687. O papel da ZNF687 no processo de mineralização também permanece incerto sendo que a diminuição dos níveis de expressão da osteocalcina (OCN) e da atividade da fosfatase alcalina (ALP), observados nos clones “knock-down”, poderia ser uma consequência da diminuição dos níveis de RUNX2, diminuição possivelmente causada pelo “knock-down” da ZNF687. Por outro lado, a expressão em células que sobre-expressam a forma mutada de ZNF687 demonstraram um padrão de expressão similar ao das células que sobre-expressam a forma WT. Anteriormente, foi descrito que a mutação p.Pro937Arg, mutação causal encontrada em pacientes com DOP, parece atuar como um ganho de função levando a um aumento da translocação de ZNF687 para o núcleo, onde a sua acumulação aumentará a expressão de genes alvos. Portanto, a alteração da expressão dos genes RUNX2, OSX, RANK, OPTN e SQSTM1, envolvidos na diferenciação dos osteoblastos e dos osteoclastos, poderá ser a causa do desenvolvimento da DOP em pacientes que apresentam essa mutação. Porém, após análises comparativas entre os genes znf687a e znf687b do peixe zebra com o gene ZNF687, foi possível sugerir que o gene znf687b era ortólogo do gene ZNF687 humano sendo que é aquele que apresentava maiores semelhanças na estrutura genómica, domínio proteico e fatores moleculares afetando a transcrição znf687a, znf687b e ZNF687. Finalmente, através da análise funcional da região promotora dos genes do peixe zebra e do humano identificou-se uma região no znf687a do zebrafish e duas regiões no ZNF687 humano como sendo responsáveis pela sua regulação. Além disso, o ensaio de co-transfecção demonstrou um efeito de repressão da transcrição da construção contendo o promotor do gene zbf687a devido ao fator de transcrição YY-1. Nos ensaios efetuados com a construção contendo o promotor do gene ZNF687 observou-se uma repressão da sua transcrição devido ao fator de transcrição AP-1. Estes resultados parecem sugerir que os promotores do gene ZNF687, tanto em humano como em peixe zebra, são regulados negativamente por factores de transcrição, que regulam genes envolvidos no desenvolvimento do osso. Estes resultados juntamente com a nossa análise in silico comparativa do locus genómico, do gene e da proteína entre as duas espécies permite-nos sugerir a potencialidade de utilizar o peixe-zebra como modelo biológico para o estudo da função da ZNF687

A mouse model of infection to investigate Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus LANA function in vivo

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Os herpesvírus são vírus ubíquos que infetam uma ampla variedade de hospedeiros. Até ao momento, oito herpesvírus foram relacionados com o ser humano, nomeadamente, o herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV). O KSHV é o agente etiológico de várias doenças, inclusive do Sarcoma de Kaposi e de outras doenças linfoproliferativas tais como o linfoma de efusão primária (PEL) e a doença de Castleman multicêntrica (MCD). Comummente com os outros herpesvírus, o KSHV possui um ciclo de vida bifásico constituído por uma fase lítica e uma fase latente. A fase lítica é caracterizada pela expressão dos genes virais e produção de novos viriões que, consequentemente, levam à lise celular. Na fase latente existe uma repressão da expressão génica e o genoma viral é circularizado, mantendo-se sob a forma de episoma no núcleo das células B do hospedeiro. O balanço entre as fases lítica e latente é essencial para a manutenção e sobrevivência do vírus. O genoma do KSHV tem um tamanho aproximado de 140 kpb e é constituído por uma região longa única, que inclui as regiões codificantes e se encontra flanqueada por um número variável de repetições terminais (TR). Uma das grandes limitações dos estudos in vivo deste vírus deve-se à sua especificidade de hospedeiro, uma vez que só infecta humanos. O herpesvírus murino 68 (MHV-68), com um genoma de 118 kpb, está geneticamente relacionado com o KSHV e consegue estabelecer infeção latente em murganhos (Mus musculus). Após a inoculação intranasal do vírus em murganhos, ocorre uma fase de replicação lítica nas células epiteliais pulmonares. De seguida, o vírus dissemina-se para o baço onde infecta as células B do centro germinativo. Nesse local ocorre a proliferação de células B infetadas, sucedendo-se o estabelecimento de latência nas células B de memória. Estas constituem o seu reservatório a longo prazo. Apesar de haver uma elevada restrição da expressão génica durante a fase latente do ciclo de vida do KSHV, alguns genes são expressos, nomeadamente os que codificam o antigénio nuclear associado à latência (LANA), a v-ciclina, a proteína v-FLIP e as kaposins. A LANA do KSHV (kLANA) é a principal proteína expressa ao longo desta fase e a sua região N-terminal interage com as histonas H2A e H2B, o que permite a sua associação aos cromossomas do hospedeiro. A região C-terminal contém um domínio de ligação ao DNA (DBD) que se liga a regiões específicas nas TR do genoma viral. Estas interações são ambas importantes para a replicação e segregação do episoma, funções cruciais para a persistência viral. A proteína LANA do MHV-68 (mLANA), semelhantemente à kLANA, contém um DBD que interage com as TR. Além disso, também interage com os cromossomas mitóticos. A interação entre o genoma viral do MHV-68 e o genoma do hospedeiro processa-se possivelmente através de um mecanismo semelhante ao mecanismo adotado pelo KSHV. Portanto, kLANA e mLANA são proteínas estruturalmente e funcionalmente conservadas e possivelmente relacionadas. Ambas mostraram ser essenciais para o estabelecimento e manutenção da latência do KSHV e MHV-68, respetivamente. Recentemente, foi desenvolvido um vírus quimera (v.kLANA) em que a kLANA foi clonada no genoma do MHV-68, substituindo a mLANA endógena. Este vírus quimera consegue estabelecer a fase latente em murganhos, apesar de se observarem níveis de latência mais baixos comparativamente aos níveis obtidos com o MHV-68. Deste modo, o vírus quimera constitui um bom modelo para estudar as funções de kLANA in vivo. Estudos in vitro recentes concluíram que a região entre os aminoácidos 33 e 194 da kLANA é essencial para a segregação do episoma. Esta função e a replicação são críticas para a manutenção do episoma do KSHV. Considerando estes resultados, o objetivo deste estudo consistiu em avaliar a importância dessa região no estabelecimento de latência in vivo, utilizando o modelo quimera supramencionado. Para esse fim, construiu-se um vírus quimera recombinante com o gene que codifica a proteína kLANA contendo uma deleção entre os aminoácidos 33 a 194 (kLANAΔ33-194). Esse gene foi clonado num cromossoma artificial bacteriano (BAC) que contém o genoma do MHV-68, substituindo o gene que codifica a mLANA. Os vírus recombinantes foram construídos em dois backgrounds, um em que o vírus expressa a yellow fluorescent protein (YFP) e outro em que não expressa esta proteína. A expressão da proteína YFP é vantajosa pela possibilidade de rastrear a infeção através de análises por citometria de fluxo, por exemplo. Após a obtenção de vários clones, estes foram analisados através de reações de digestão com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI e HindIII. Dos que apresentaram as bandas esperadas nos perfis de digestão, foram selecionados dois clones, um de cada background, para prosseguir o estudo. Os estudos in vitro realizados incluíram a análise da cinética de crescimento dos vírus e a expressão de proteínas. Para analisar a cinética de crescimento, células permissivas foram infetadas com os vírus recombinantes (v.kLANAΔ33-194 e v.kLANAΔ33-194.yfp) e com os vírus controlo (v.kLANA e MHV.68) de ambos backgrounds. As células infetadas foram recolhidas em seis tempos específicos da infeção (0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós infeção). Após um processo de congelamento e descongelamento, as amostras foram tituladas. Os títulos obtidos para cada tempo permitiram traçar uma curva de crescimento para cada vírus. Verificou-se que os vírus recombinantes apresentaram uma cinética de crescimento semelhante aos controlos utilizados. Além desta experiência, também foi realizado um western blot para a deteção da proteína kLANA usando como controlos as proteínas virais mLANA, M3 (quimiocina) e green fluorescent protein (GFP) e a proteína celular actina. Este ensaio permitiu verificar que os vírus recombinantes expressaram a proteína kLANA mutante com uma massa molecular expectavelmente inferior à apresentada pela proteína kLANA wild-type. Para analisar a relevância da região no estabelecimento de latência in vivo, 4 grupos de 5 murganhos da estirpe C57BL/6J foram infetados com os vírus recombinantes (v.kLANAΔ33-194 e v.kLANAΔ33-194.yfp), usando como controlos MHV.68 (v.WT.yfp) e v.kLANA.yfp. Ao 14º dia após a inoculação intranasal (pico de latência), os murganhos foram sacrificados e os baços foram cirurgicamente removidos e devidamente processados para os ensaios a realizar. Para avaliar o nível de latência foi realizado um ensaio de reativação ex vivo e também se determinou a frequência de células positivas para a presença de DNA viral através do ensaio de diluição limitante e PCR em tempo real. Em ambas as experiências, v.kLANA.yfp e v. kLANAΔ33-194.yfp apresentaram níveis semelhantes, quer de latência, quer de células positivas para DNA viral. No entanto, verificou-se que nessas mesmas experiências, v.kLANAΔ33-194 apresentou níveis significativamente mais baixos de latência e de células positivas para a presença de DNA viral comparativamente com v.kLANAΔ33-194.yfp. A obtenção de um fenótipo discordante entre v.kLANAΔ33-194 e v.kLANAΔ33-194.yfp não era esperada dado que o acoplamento da proteína YFP ao genoma do MHV-68 mostrou não interferir com os níveis de latência. Foi também realizada uma análise por citometria de fluxo que permitiu quantificar a percentagem de células B do centro germinativo que estão infetadas, através da deteção da proteína YFP expressa pelos vírus v.WT.yfp, v.kLANA.yfp e v. kLANAΔ33-194.yfp . Na experiência realizada verificou-se que v.kLANAΔ33-194.yfp apresenta uma frequência de infeção de células B do centro germinativo ligeiramente inferior (aproximadamente 1%), comparando com v.kLANA.yfp. No entanto, a experiência terá de ser repetida de modo a obter resultados estatisticamente significativos. Tendo em conta a discordância inesperada entre os fenótipos dos vírus recombinantes, a avaliação da importância da região em estudo utilizando o modelo vírus quimera não foi elucidada neste trabalho, sendo necessárias experiências futuras.Herpesviruses are ubiquitous in the world infecting a wide range of hosts. Eight herpesviruses have been related to humans, including Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV). KSHV is the etiological agent of several malignancies, namely, Kaposi’s sarcoma (KS), primary effusion lymphoma (PEL) and multicentric Castleman’s disease (MCD). As other members of Herpesviridae family, KSHV displays a biphasic life cycle constituted by a lytic and a latent phase. The latent phase has a highly restricted gene expression and the viral genome is circularized into an episome which is maintained in the host’s B cells. Its narrow host range constitutes a major limitation for in vivo studies. Murine herpesvirus 68 (MHV-68), which is genetically related to KSHV, is able to infect laboratory mice and to establish a latent persistent infection. The principal protein related to this phase is the latency-associated nuclear antigen (LANA). LANA from KSHV (kLANA) and LANA from MHV-68 (mLANA) are functionally related and both have been shown to be required for the maintenance of latency in KSHV and MHV-68, respectively. Recently, a MHV-68 chimeric virus (v.kLANA) was constructed where mLANA was replaced by kLANA. This constitutes a suitable model to study kLANA functions in vivo. In vitro studies demonstrated that the region encompassing amino acids 33 to 194 of kLANA is crucial for segregation. This function, together with replication, is critical for the maintenance of the viral episome. Therefore, the aim of this study was to assess the importance of that region using an in vivo model of infection. This was achieved by generating a chimeric recombinant virus where mLANA was replaced by kLANA containing a deletion encompassing amino acids 33 to 194 within MHV-68 genome. Our in vitro assays showed that recombinant viruses were able to express the LANA mutant protein and had similar growth kinetics to MHV-68 (v.WT) and v.kLANA. The results from in vivo experiments demonstrated that v.kLANAΔ33-194.yfp had similar levels of latency and frequency of viral DNA positive cells to v.kLANA.yfp. However, v.kLANAΔ33-194 showed significant lower latency levels compared to v.kLANAΔ33-194.yfp and v.kLANA.yfp. Since the two recombinant viruses had discordant phenotypes, the importance of the region remains unclear. Further studies need to be done to clarify the importance of the region

Rôle des protéines et des acides gras trans laitiers dans la variabilité de la réponse inflammatoire aux produits laitiers

Les études épidémiologiques rapportent qu’une consommation adéquate de produits laitiers pourrait diminuer l’incidence du diabète de type 2 (DT2), une maladie chronique qui devrait concerner 10,8 % des Canadiens d’ici 2020. Bien que les mécanismes à l’origine de cette association demeurent inconnus, il a été suggéré que les produits laitiers pourraient diminuer l’inflammation systémique chronique, un facteur de risque du DT2. Toutefois, les produits laitiers ont un effet variable sur les marqueurs inflammatoires dans les études cliniques. L’effet des produits laitiers peut être influencé par le statut inflammatoire des individus, mais aussi par la composition en nutriments des différents produits laitiers. Les produits laitiers contiennent des protéines, des acides aminés et des acides gras, notamment des acides gras trans naturels, dont l’effet sur l’inflammation est méconnu. De plus, il a été démontré que les nutriments laitiers pouvaient réguler l’expression des gènes inflammatoires. Néanmoins, une approche mécanistique est nécessaire afin d’élucider le rôle des produits laitiers sur l’inflammation dans le but de prévenir l’apparition du DT2. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que l’effet des produits laitiers sur l’inflammation était influencé par le statut inflammatoire des individus et par la composition en macronutriments des produits laitiers. L’objectif général des travaux présentés dans cette thèse était donc d’évaluer la contribution de ces deux facteurs sur l’inflammation. Dans un premier temps, nous avons eu accès aux données alimentaires, anthropométriques et biochimiques de deux cohortes de participants recrutés dans la région de la ville de Québec. Les résultats nous montrent que la consommation de produits laitiers est inversement corrélée à la glycémie et à la tension artérielle chez les individus en santé. Cette consommation est également faiblement corrélée à la concentration de protéine C-réactive (CRP), mais ne corrèle pas avec les autres marqueurs inflammatoires (facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et interleukine 6 (IL-6)). De plus, les concentrations dans les phospholipides plasmatiques des acides gras trans retrouvés spécifiquement dans la matière grasse laitière sont associées à la consommation de produits laitiers riches en gras, ainsi qu’à un taux d’adiponectine et à une tension artérielle plus favorables. Dans un deuxième temps, nous avons développé des modèles cellulaires avec ou sans induction de l’inflammation au TNF-α, afin d’identifier les nutriments laitiers bioactifs. Les cellules ont été incubées pendant 24 heures avec des acides gras trans laitiers, des protéines ou des acides aminés, seuls ou en combinaisons. Les acides gras trans et les composés protéiques influencent peu les gènes inflammatoires dans les cellules saines. En revanche, lorsque les cellules sont stimulées avec du TNF-α pour induire l’inflammation, les acides gras trans laitiers, les protéines du lactosérum et leurs acides aminés majoritaires (leucine, isoleucine et valine) diminuent l’expression des gènes inflammatoires dans les cellules endothéliales. Les acides gras trans laitiers diminuent également l'excrétion des prostaglandines, mais augmentent la quantité de F₂-isoprostanes dans les surnageants. De plus, les acides gras trans laitiers sont retrouvés dans de grandes proportions dans les membranes cellulaires, modifiant ainsi le profil en acides gras, ce qui pourrait affecter le bon fonctionnement des récepteurs localisés dans la membrane. Enfin, l’incubation d’acides gras trans laitiers avec des composés protéiques laitiers ne révèle aucun effet additif ou synergique sur l’expression des gènes inflammatoires et les quantités d’eicosanoïdes dans les cellules endothéliales. Les données générées vont en faveur d’un effet bénéfique des acides gras trans laitiers et des protéines du lactosérum sur l’inflammation. De plus, l’effet de ces macronutriments apparait uniquement dans les cellules en état inflammatoire, ce qui favorise l’hypothèse que l’effet des produits laitiers dépendrait du statut inflammatoire des individus. La composante cellulaire de ce projet a permis de mieux comprendre l’impact des différentes sources d’hétérogénéité sur la réponse inflammatoire. La mise en place d’études in vivo s’avère nécessaire afin de valider les sources majeures de la variabilité de la réponse inflammatoire aux produits laitiers.Epidemiological data reported that an adequate dairy product consumption may lower the incidence of type 2 diabetes (T2D), a chronic disease which may concern 10.8 % of Canadians by 2020. Although the mechanisms underlying this association remain unclear, it has been suggested that dairy product intake may improve low-grade systemic inflammation, a key etiologic factor in the development of T2D. However, dairy products have mixed effects on inflammatory markers in clinical studies. The effect of dairy products could be mediated by the inflammatory status of the participants, as well as the nutrient composition of dairy products. Dairy products contain proteins, amino acids and fatty acids, specifically natural trans fatty acids, for which the effect on inflammation remains unclear. Furthermore, it has been demonstrated that dairy nutrients can regulate inflammatory gene expression. Nevertheless, a mechanistic approach is required to elucidate the role of dairy products on inflammation and the prevention of T2D. Accordingly, we tested the hypothesis that the effect of dairy products on inflammation was influenced by the inflammatory status of the individuals and the macronutrient composition of dairy products. Therefore, the main objective of this thesis was to evaluate the contribution of those two factors on inflammation. Firstly, dietary, anthropometric and biochemical data from two cohorts of individuals recruited in Quebec City were assessed. Results show that dairy product consumption is inversely correlated with glycaemia and blood pressure in healthy individuals. Dairy intake is also slightly correlated with plasma C-reactive protein (CRP) concentrations, without influencing other inflammatory markers (tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 6 (IL-6)). Moreover, concentrations of dairy trans fatty acids in plasma phospholipids are associated to high-fat dairy product consumption, as well as favorable adiponectin levels and blood pressure. Secondly, we developed cell models, with or without induction of inflammation with TNF-α, to identify bioactive dairy nutrients. Cells were incubated for 24 hours with individual or combinations of dairy trans fatty acids, proteins or amino acids. Dairy trans fatty acids and dairy protein compounds do not influence inflammatory gene expression in healthy cells. Oppositely, dairy trans fatty acids, whey proteins and their major amino acids (leucine, isoleucine and valine) decrease inflammatory gene expression in TNFα-stimulated endothelial cells. Dairy trans fatty acids also lower prostaglandin excretion; yet they increase F₂-isoprostane levels in cell supernatants. Moreover, dairy trans fatty acids are highly incorporated into cell membranes, which modifies fatty acid profiles and possibly impairs the function of membrane receptors. Finally, co-incubation of dairy trans fatty acids and dairy protein compounds have neither an additive nor a synergic effect on inflammatory gene expression and eicosanoid levels in endothelial cells. The present work suggests a beneficial impact of dairy trans fatty acids and whey proteins on inflammation. Further, the anti-inflammatory effect of these nutrients appears only in inflamed cells, which favors the hypothesis that dairy products may positively impact inflammation according to the inflammatory status of the individuals. The cellular approach is a useful tool to investigate the impact of the different sources of variability regarding inflammatory response to dairy products. Further investigations in vivo are required to validate the major sources of variability in animal models or in humans

Aspectos controversos sobre a (in) aplicabilidade do regime falimentar às cooperativas de crédito.

O presente trabalho versa sobre a aplicabilidade do regime falimentar às cooperativas de crédito. O problema é destacado a partir da análise do artigo 1º da Lei n. 6.024 de 1974 e os artigos 2º, II e 197 da Lei 197 da Lei n. 11.101 de 2005. Ao final conclui-se que a tese apresentada é a adequada por demonstrar que há aplicabilidade do regime falimentar às cooperativas de crédito após a liquidação pelo Banco Central diante do  permissivo legal da Lei n. 6024 de 1974. A metodologia utilizada foi a descritiva e qualitativa com estudo da doutrina, jurisprudência e legislação

CRIPTOMOEDAS E O PLANEJAMENTO TRIBUTÁRIO

 O objetivo do artigo é o estudo das criptomoedas, em especial a Bitcoin, como mecanismo de planejamento tributário. O uso da criptografia garante a segurança e anonimato das transações com as criptomoedas. Diante do crescente uso das criptomoedas, começaram a ocorrer questionamentos sobre negócios jurídicos realizados com a Bitcoin, em especial na seara da tributação. Sendo assim, questiona-se se as criptomoedas podem ser utilizadas como planejamento tributário. A metodologia adotada foi a qualitativa, com leitura de artigos científicos, análise da regulamentação normativa no âmbito do direito brasileiro. Ao final conclui-se que as criptomoedas podem ser utilizadas como planejamento tributário

A (não) vinculação dos precedentes às decisões proferidas em sede de arbitragem sob a ótica do novo Código de Processo Civil.

Este trabalho tem por objeto de estudo o impacto do novo código de processo civil nas sentenças arbitrais com a instituição dos precedentes, considerando a vinculação ou não do árbitro ao proferir sua decisão. A metodologia adotada foi o estudo da legislação pátria e da doutrina sobre o tema. Por fim, conclui-se que o árbitro é vinculado à convenção de arbitragem, independentemente do modelo de procedimento arbitral a ser convencionado, podendo ser utilizado os institutos jurídicos do distinguishing ou do overruling para afastar o precedente judicial

Epidemiology of Severe Sepsis in the Emergency Department and Difficulties in the Initial Assistance

BACKGROUND: The aim of this study was to determine the occurrence rate, demographics, clinical characteristics, and outcomes of patients with severe sepsis admitted to the emergency department. METHODS: A prospective study evaluating all patients admitted to the emergency department unit in a public hospital of tertiary complexity in a six-month period was conducted. During this period, the emergency team was trained to diagnose sepsis. Patients who met the diagnostic criteria for severe sepsis were followed until their discharge from the hospital. RESULTS: A total of 5,332 patients were admitted to the emergency department, and 342 met the criteria for severe sepsis/septic shock. The median (interquartile range) age of patients was 74 (65-84) years, and 52.1% were male. The median APACHE II and SOFA scores at diagnosis were 19 (15-25) and 5 (3-7), respectively. The median number of dysfunctional organ systems per patient was 2 (1-3). The median hospital length of stay was 10 (4.7-17) days, and the hospital mortality rate was 64%. Only 31% of the patients were diagnosed by the emergency department team as septic. About 33.5% of the 342 severe sepsis patients admitted to the emergency department were referred to an ICU, with a median time delay of 24 (12-48) hours. Training improved diagnosis and decreased the time delay for septic patients in arriving at the ICU. CONCLUSIONS: The occurrence rate of severe sepsis in the emergency department was 6.4%, and the rate of sepsis diagnosed by the emergency department team as well as the number of patients transferred to the ICU was very low. Educational campaigns are important to improve diagnosis and, hence, treatment of severe sepsis

Epidemiology of severe sepsis in the emergency department and difficulties in the initial assistance

BACKGROUND: The aim of this study was to determine the occurrence rate, demographics, clinical characteristics, and outcomes of patients with severe sepsis admitted to the emergency department. METHODS: A prospective study evaluating all patients admitted to the emergency department unit in a public hospital of tertiary complexity in a six-month period was conducted. During this period, the emergency team was trained to diagnose sepsis. Patients who met the diagnostic criteria for severe sepsis were followed until their discharge from the hospital. RESULTS: A total of 5,332 patients were admitted to the emergency department, and 342 met the criteria for severe sepsis/septic shock. The median (interquartile range) age of patients was 74 (65-84) years, and 52.1% were male. The median APACHE II and SOFA scores at diagnosis were 19 (15-25) and 5 (3-7), respectively. The median number of dysfunctional organ systems per patient was 2 (1-3). The median hospital length of stay was 10 (4.7-17) days, and the hospital mortality rate was 64%. Only 31% of the patients were diagnosed by the emergency department team as septic. About 33.5% of the 342 severe sepsis patients admitted to the emergency department were referred to an ICU, with a median time delay of 24 (12-48) hours. Training improved diagnosis and decreased the time delay for septic patients in arriving at the ICU. CONCLUSIONS: The occurrence rate of severe sepsis in the emergency department was 6.4%, and the rate of sepsis diagnosed by the emergency department team as well as the number of patients transferred to the ICU was very low. Educational campaigns are important to improve diagnosis and, hence, treatment of severe sepsis