Маркеры развития рестеноза зоны реконструкции после эндоваскулярных вмешательств на артериях нижних конечностей

Restenosis of the reconstruction zone is one of the main postoperative complications of vascular reconstructions, which develops in 18–40% of cases and leads to an increase in the risk of limb loss to 20–25%. The search for new markers for predicting the development of this complication is an urgent problem today.Aim of study. To assess the dynamics of markers of apoptosis and cell proliferation at different times after endovascular intervention and their role in the development of restenosis of the reconstruction zone in patients with peripheral arterial disease (PAD).Material and methods. The clinical study included 30 patients with PAD stage III disease. After further examination, the patients underwent endovascular intervention on the arteries of the femoral-popliteal segment. If restenosis developed, the patients were re-operated. In patients before surgery, within the first hour, and then on days 1, 7, 14, 21, 30 after the operation, venous blood was taken to determine the markers Bax, sFas, PDGF BB using enzyme immunoassay.Results. After endovascular intervention, the first wave of apoptosis was triggered with an increase in the amount of proapoptotic protein Bax (p=0,00003) from 1 to 24 hours, followed by a decrease by day 7 (p=0.0008) compared to the amount on day 1. The PDGF BB level increased from day 1 after surgery (p=0.03) with maximum values on day 7 (p=0.0002) compared to the level on day 1. Then the second wave was triggered with a peak decrease in the level of the apoptosis inhibitor sFas on day 21 (p=0.002). After 9-12 months, restenosis of the intervention zone with a return of limb ischemia developed in 10 patients. During the first hour (p=0.004) in patients with restenosis, the level of Bax protein was significantly increased, with an increase in the level of PDGF BB by day 7 (p=0.011), and sFas by day 21 (p=0.0001), PDGF BB by the end of 1 month (p=0.004) compared to values in patients without this complication.Conclusion. 1. Endovascular intervention causes two waves of apoptosis in the postoperative period. The first wave is associated with an increase in Bax protein in the first hours, followed by an increase in PDGF BB on day 7. The second wave of apoptosis is due to a decrease in the inhibitor of apoptosis — sFas for 21 days against the background of the shift of the PDGF BB to the initial level. 2. An increase in Bax protein within the first hours after surgery in the course of PDGF BB growth on day 7 with an increased amount of sFas on day 21 leads and PDGF BB by the end of 1 month leads to the development of restenosis of the intervention area. Рестеноз зоны реконструкции является одним из основных послеоперационных осложнений оперативных вмешательств на артериях нижних конечностей, который развивается в 18–40% случаев и ведет к развитию тромбоза зоны реконструкции и увеличению риска потери конечности до 20–25%. Поиск новых маркеров прогнозирования развития данного осложнения у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (ОААНК) является актуальной проблемой на сегодняшний день.Цель исследования. Оценка динамики маркеров апоптоза и пролиферации клеток в различные сроки после эндоваскулярного вмешательства и их роль в развитии рестеноза зоны реконструкции у пациентов с ОААНК.Материал и методы. В исследование были включены 30 пациентов с ОААНК с III стадией заболевания. После дообследования пациентам было выполнено эндоваскулярное вмешательство на артериях бедренно-подколенного сегмента. В случае развития рестеноза зоны вмешательства пациенты были повторно оперированы. У пациентов до операции в первый час, а затем на 1-е, 7-е, 14-е, 21-е, 30-е сутки после операции была взята венозная кровь для определения маркеров Вах, sFas, PDGF BB с помощь иммуноферментного анализа.Результаты. После эндоваскулярного вмешательства происходил запуск первой волны апоптоза с повышением в крови количества белка Вах (р=0,00003) с 1 по 24 часа с его последующим снижением к 7-м суткам (р=0,0008) по сравнению с количеством на 1-е сутки. Уровень PDGF BB возрастал с 1-х суток после операции (р=0,03) с максимальными значениями на 7-е сутки (р=0,0002) по сравнению с уровнем на 1-е сутки. Затем происходил запуск второй волны с пиковым снижением уровня ингибитора апоптоза sFas на 21-е сутки (р=0,002). У 10 пациентов через 9–12 месяцев развился рестеноз зоны вмешательства с возвратом ишемии конечности. В первый час (р=0,004) у пациентов с рестенозом был статистически значимо повышен уровень белка Вах, при повышении PDGF ВВ на 7-е сутки (р=0,011), а sFas на 21-е сутки (р=0,0001), PDGF ВВ к концу 1-го месяца (р=0,004) по сравнению со значениями у пациентов без данного осложнения.Выводы. 1. Эндоваскулярное вмешательство вызывает две волны апоптоза в послеоперационном периоде. Первая волна связана с повышением содержания белка Вах в первые часы с последующим увеличением PDGF ВВ на 7-е сутки. Вторая волна апоптоза обусловлена снижением уровня ингибитора апоптоза — sFas на 21-е сутки на фоне сдвига PDGF ВВ к исходному уровню. 2. Повышение содержания белка Вах в первые часы после операции на фоне роста PDGF BB на 7-е сутки при увеличенном количестве sFas на 21-е сутки и PDGF ВВ к концу 1-го месяца ведет к развитию рестеноза зоны вмешательства.

Mitoxantrone Quantification by HPLC-MS/MS in Caco-2 Culture Media

Mitoxantrone is a marker substrate of breast cancer resistance protein (BCRP). BCRP is involved in a number of pharmacokinetic drug-drug interactions. The transporter’s possible saturability makes it advisable to use low concentrations of mitoxantrone for in vitro studies. Consequently, mitoxantrone quantification requires   a method with high sensitivity.The aim of the study was to develop and validate a procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS.Materials and methods.  The  authors  used  an  Ultimate  3000  HPLC  system  and a TSQ Fortis triple quadrupole mass spectrometer by Thermo Fisher Scientific and a Selectra C18 column (4.6×100 mm, 5 μm, 100 Å) by United Chemical Technologies. The elution ran in a gradient mode with a mobile phase of 1% formic acid solution and methanol. Experimental parameters were as follows: eluent flow rate, 0.3 mL/min; separation column temperature, 35 °C; injection volume, 5  μL; ana lysis time, 10 min; approximate mitoxantrone retention time, 5.51 min. The sample preparation involved protein precipitation from the culture medium with methanol, followed by centrifugation at 13,000 g for 10 min. The detection was performed using electrospray ionisation in the positive ion mode. Detection parameters were   as follows: electrospray voltage, 3700 V; sheath gas flow rate, 50 L/min; auxiliary    gas flow rate, 10 L/min; sweep gas flow rate, 1 L/min; ion-transfer tube temperature, 300 °C; and evaporator temperature, 350 °C. The detection was set at mass transitions of m/z 455 to 88.2 and m/z 455 to 358.1, with the collision energy for these transitions amounting to 25 V and 18 V, respectively. The source fragmentation was at 0, and the CID gas pressure was at 2 mTorr.Results. The analytical procedure showed selectivity, high sensitivity (limit of detection, 10 nmol/L; lower limit of quantification, 50 nmol/L), accuracy, precision, and linearity in the concentration range of 50–1000 nmol/L. The authors observed no carryover or matrix effects. A simulation of real-life storage conditions demonstrated high stability of mitoxantrone samples. Thus, the analytical procedure enables preclinical evaluation of medicinal product effects on the functional activity of BCRP, based on assessing the transcellular mitoxantrone transport in the presence of a test product.Conclusion. The authors developed and validated the analytical procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS

Разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде методом ВЭЖХ-МC/МС

Relevance. BCRP is an efflux transporter protein that plays an important role in the pharmacokinetics of a wide range of drugs. The BCRP activity in vitro experiments is assessed by the transport of transporter protein substrates (methotrexate, etc.) across the bilipid membrane of cells overexpressingBCRP, for example, Caco-2 cells. The aim is to develop and validate a method for the quantitative determination of the BCRP substrate, methotrexate, in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS/MS. Methods. The work was performed on an Ultimate 3000 HPLC chromatograph (ThermoFisher, USA) with a TSQ Fortis tandem mass-selective detector (ThermoFisher, USA). The conditions of chromatographic analysis were as follows: column UCT Selectra C18 4.6 mm * 100 mm 5um, 100A, Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, separation temperature 35 °С, flow rate 0.3 ml/min, injected sample volume - 2 μl, analysis time - 10 min. Used a gradient elution: the ratio of the solution of 0.1 % formic acid and acetonitrile was at 0 min 75 and 25 %; 0.4 min 60 and 40 %; 6 minutes 20 and 80 %; 8 minutes 75 and 25 %. Under these conditions, the retention time of methotrexate is 3.11 minutes. Detection conditions: methotrexate - positive ionization mode, 455.15 m / z → 308.125 m / z, collision energy 22.99 V, source fragmentation 5, CID gas pressure 2 mTorr. The extraction of methotrexate from the transport medium (Hanks solution with 25 mM Hepes and 1% dimethyl sulfoxide) after incubation with Caco-2 cells for 3 h was carried out with a mixture of methanol + water in a ratio of 1: 1. Results. The developed method was validated according to the following parameters: selectivity, linearity, accuracy, precision, limit of quantitative determination, sample transfer, sample stability. The confirmed analytical range of the method was 60 -10,000 nmol / L in the transport medium. Conclusions: a method for the quantitative determination of methotrexate in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS / MS was developed and validated.Актуальность. BCRP – эффлюксный белок-транспортёр, играющий важную роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ. Активность BCRP в опытах in vitro оценивается по транспорту субстратов белка-транспортёра (метотрексата и др.) через билипидную мембрану клеток, гиперэкспрессирующих BCRP, например, клетках линии Caco-2. Цель: разработать и валидировать методику количественного определения субстрата BCRP – метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС. Методы исследования. Работа выполнена на ВЭЖХ-хроматографе «Ultimate 3000» («ThermoFisher», США) с тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis («ThermoFisher», США). Условия хроматографического анализа были следующими: колонка UCT Selectra C18 4,6 mm ×100 mm 5um, 100A, предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, температура разделения – 35 °С, скорость потока – 0,3 мл/мин, объём вводимой пробы – 2 мкл, время анализа – 10 мин. Использовали градиентный режим элюирования: соотношение раствора 0,1 % муравьиной кислоты и ацетонитрила составило на 0 мин 75 и 25 %; 0,4 мин – 60 и 40 %; 6 мин – 20 и 80 %; 8 мин – 75 и 25 %. В данных условиях время удерживания метотрексата – 3,11 мин. Условия детектирования: метотрексат – положительный режим ионизации, 455,15 m/z → 308,125 m/z, энергия столкновения – 22,99 В, фрагментация источника – 5, давление CID-газа – 2 мТорр. Извлечение метотрексата из транспортной среды (раствор Хэнкса с 25 мМ Хепес и 1 % диметилсульфоксида) после инкубирования с клетками линии Сaco-2 в течение 3 ч осуществляли смесью метанол+вода в соотношении 1:1. Результаты. Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов. Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 60–10 000 нмоль/л в транспортной среде. Выводы: разработана и валидирована методика количественного определения метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС

Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на функциональную активность транспортёра гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере крыс в норме и при гипоксической гипоксии

Relevance. Ethylmethylhydroxypyridine succinate (EMHPS) is a reference domestic drug with pronounced antioxidant and antihypoxic activity. P-Glycoprotein (Pgp) is an ATP-dependent transport protein localized in tissue barriers and protecting cells and organs from the effects of xenobiotics. Being expressed in the blood-brain barrier (BBB), Pgp limits the penetration of drugs and toxic substances into the brain tissue. Aim – to evaluate the effect of EMHPS on the functional activity of Pgp in the BBB of rats in normal conditions and in acute hypoxic hypobaric hypoxia in the experiment. Methods. The studies were carried out on male Wistar rats weighing 200–250 g, which were divided into 4 groups: group 1 (control, n = 30) – intact rats; Group 2 (control of hypoxia, n = 30) – rats, which were simulated hypoxia and before that they were once injected with water for injection; Group 3 (n = 30) – intact animals, which were injected intravenously with EMHPS at a dose of 50 mg / kg body weight; Group 4 (n = 30) – rats, which were injected intravenously with EMHPS at a dose of 50 mg/kg body weight before modeling hypoxia. 30 minutes after injection, animals of groups 2 and 4 were simulated acute hypoxic hypoxia for 30 minutes by ascending to an altitude of 8000 m with an ascent and descent speed of 50 m/s. 3 h after descent animals of groups 2 and 4 and 30 min after intravenous injection in animals of groups 1 and 3, the functional activity of Pgp in the BBB was assessed by the penetration of fexofenadine, a marker substrate of Pgp, into the brain tissue. For this, fexofenadine was injected into the tail vein of rats at a dose of 10 mg/kg of body weight. After 5, 10, 15, 30, 45, 60 minutes after administration, they were euthanized, at least 4 ml of blood was taken from the abdominal aorta into heparinized tubes and the cortex of the frontal lobes of the brain. The concentration of fexofenadine in biosamples was analyzed by HPLC-UV according to original methods. Results. In the course of the study, it was shown that a single intravenous injection of EMHPS at a dose of 50 mg/kg of body weight causes an increase in the content of fexofenadine in the cerebral cortex of rats, which indicates a decrease in the activity of the Pgp transporter protein. Simulation of acute hypoxic hypoxia was also accompanied by an increase in the permeability of the transport protein substrate into the brain tissue. At the same time, the prophylactic administration of EMHPS before hypoxic exposure did not significantly affect the BBB permeability, which remained significantly higher than the control and did not differ from the permeability during isolated hypoxic exposure. Conclusions: EMHPS with a single intravenous injection at a dose of 50 mg/kg body weight reduces the activity of Pgp in the BBB in normal conditions and does not significantly affect the penetration of the transporter substrate – fexofenadine into the brain tissue in acute hypoxic hypoxiaАктуальность. Этилметилгидроксипиридина сукцинат (ЭМГПС) – референтный отечественный лекарственный препарат, обладающий выраженной антиоксидантной и антигипоксической активностью. Гликопротеин-Р (Pgp) – АТФ-зависимый белок-транспортёр, локализующийся в тканевых барьерах и осуществляющий защиту клеток и органов от воздействия ксенобиотиков. Экспрессируясь в гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ), Pgp ограничивает проникновение лекарственных и токсических веществ в ткань мозга. Цель – оценить влияние ЭМГПС на функциональную активность Pgp в ГЭБ крыс в норме и при острой гипоксической гипобарической гипоксии в эксперименте. Методы исследования. Исследования выполнены на крысах-самцах Wistar, массой 200–250 г, которые были разделены на 4 группы: 1-я группа (контроль, n = 30) – интактные крысы; 2-я группа (контроль гипоксии, n = 30) – крысы, которым моделировали гипоксию и перед этим однократно в/в вводили воду для инъекций; 3-я группа (n = 30) – интактные животные, которым в/в однократно вводили ЭМГПС в дозе 50 мг/кг массы; 4-я группа (n = 30) – крысы, которым перед моделированием гипоксии в/в однократно вводили ЭМГПС в дозе 50 мг/кг массы. Через 30 минут после инъекции у животных 2- и 4-й групп моделировали острую гипоксическую гипоксию в течение 30 минут путём их подъёма на высоту 8000 м со скоростью подъёма и спуска 50 м/с. Через 3 ч после спуска у животных 2- и 4-й групп и через 30 мин после в/в инъекции у животных 1- и 3-й групп оценивали функциональную активность Pgp в ГЭБ по проникновению в ткань мозга фексофенадина – маркерного субстрата Pgp. Для этого крысам в хвостовую вену вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг массы. Через 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин после введения их подвергали эвтаназии, забирали не менее 4 мл крови из брюшной аорты в гепаринизированные пробирки и кору лобных долей головного мозга. Концентрацию фексофенадина в биообразцах анализировали методом ВЭЖХ-УФ по оригинальным методикам. Результаты. В ходе исследования было показано, что внутривенное однократное введение ЭМГПС в дозе 50 мг/кг массы вызывает повышение содержания фексофенадина в коре больших полушарий головного мозга крыс, что свидетельствует о снижении активности белка-транспортёра Pgp. Моделирование острой гипоксической гипоксии также сопровождалось повышением проницаемости субстрата белка-транспортёра в ткань мозга. При этом профилактическое введение ЭМГПС перед гипоксическим воздействием существенно не влияло на проницаемость ГЭБ, которая оставалась существенно выше контроля и не отличалась от проницаемости при изолированном гипоксическом воздействии. Выводы. ЭМГПС при однократном внутривенном введении в дозе 50 мг/кг массы снижает активность Pgp в ГЭБ в норме и не оказывает существенного влияния на проникновение в ткань мозга субстрата транспортёра – фексофенадина при острой гипоксической гипоксии

Search for scalar leptoquarks and T-odd quarks in the acoplanar jet topology using 2.5 fb-1 of ppbar collision data at sqrt(s)=1.96 TeV

A search for new physics in the acoplanar jet topology has been performed in 2.5 fb-1 of data from ppbar collisions at sqrt(s)=1.96 TeV, recorded by the D0 detector at the Fermilab Tevatron Collider. The numbers of events with exactly two acoplanar jets and missing transverse energy are in good agreement with the standard model expectations. The result of this search has been used to set a lower mass limit of 205 GeV at the 95% C.L. on the mass of a scalar leptoquark when this particle decays exclusively into a quark and a neutrino. In the framework of the Little Higgs model with T-parity, limits have also been obtained on the T-odd quark mass as a function of the T-odd photon mass

Методика количественного анализа маркерного субстрата ABCB1-белка фексофенадина в лизате клеток Caco-2

One way to analyze the activity of the ABCB1 protein is to assess the accumulation of its substrate fexofenadine (F.) inside the test cells. The goal is to develop and validate a method for the quantitative analysis of F. in Caco-2 cell lysate using HPLC-MS/MS. Materials and methods. Caco-2 cell lysate was used as a matrix. The analysis was performed on an "Ultimate 3000" chromatograph with a TSQ Fortis triple quadrupole mass detector, a UCT Selectra C18 4.6 mm*100 mm 5 µm column in a gradient elution mode. The mobile phase rate was 0.3 ml/min, the sample volume was 20 µl, the ionization mode was positive, and the internal standard was amantadine (ng/ml). Sample preparation — precipitation of cell lysate protein with acetonitrile. The method was validated for the following parameters: selectivity, linearity, lower limit of quantitation (LLOQ), correctness, precision, sample transfer and sample stability. Results. Chromatograms of the blank lysate of Caco-2 cells showed no peaks with retention times characteristic of F. (5.70 min) and amantadine (3.58 min). NPKO F. was 0.5 ng/ml. F.'s transfer did not exceed 20% of NPKO, and amantadine — 5%. Based on the results of the analysis of three series of calibration standards (0.5; 1; 1.5; 5; 10; 25; 40; 50 ng/ml), linear regression equations were obtained, the correlation coefficients exceeded 0.99. Accuracy and precision were assessed within and between cycles by analyzing F. solutions in the matrix (0.5; 1.5; 25 and 40 ng/ml) within three cycles. The parameters did not exceed 20% for LLPO and 15% for other points. The stability of F. solutions (1.5 and 40 ng/ml) in the lysate was analyzed during storage at room temperature, after 3-fold freezing-thawing, storage at -80 °C for 60 days, after sample preparation and being in the autosampler for 24 hours. The accuracy was within 15% of the nominal values. Conclusions. A method for the quantitative determination of F. in Caco-2 cell lysate using HPLC-MS/MS has been developed and validated.Один из способов анализа активности ABCB1-белка — это оценка накопления его субстрата фексофенадина (Ф.) внутри тест-клеток. Цель — разработка и валидация методики количественного анализа Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Материалы и методы. В качестве матрицы использовался лизат клеток Caco-2. Анализ выполняли на хроматографе «Ultimate 3000» с тройным квадрупольным масс-детектором TSQ Fortis, колонкой UCT Selectra C18 4,6 мм×100 мм 5 мкм в градиентном режиме элюирования. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, объём пробы — 20 мкл, режим ионизации — положительный, внутренний стандарт — амантадин (нг/мл). Пробоподготовка — осаждение белка лизата клеток ацетонитрилом. Методику валидировали по параметрам: селективность, линейность, нижний предел количественного определения (НПКО), правильность, прецизионность, перенос пробы и стабильность образцов. Результаты. На хроматограммах холостого лизата клеток Caco-2 не было пиков со временем удерживания, характерным для Ф. (5,70 мин) и амантадина (3,58 мин). НПКО Ф. составил 0,5 нг/мл. Перенос Ф. не превышал 20 % НПКО, а амантадина — 5 %. По результатам анализа трёх серий градуировочных стандартов (0,5; 1; 1,5; 5; 10; 25; 40; 50 нг/мл) получены уравнения линейной регрессии, коэффициенты корреляции превышали 0,99. Правильность и прецизионность оценивали внутри и между циклами, выполняя анализ растворов Ф. в матрице (0,5; 1,5; 25 и 40 нг/мл) в рамках трёх циклов. Параметры не превышали 20 % для НПКО и 15 % — для остальных точек. Стабильность растворов Ф. (1,5 и 40 нг/мл) в лизате анализировали при хранении при комнатной температуре, после 3-кратной заморозки–разморозки, хранении при -80 °С 60 сут., после пробоподготовки и нахождения в автосемплере 24 ч. Правильность находилась в пределах 15 % от номинальных значений. Выводы. Разработана и валидирована методика количественного определения Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС

Geological Structure and Gold Mineralization of Carbonaceous Deposits of the Tyotechnaya Mountain (South Urals)

Рассмотрено геологическое строение северной части Восточно-Уральского прогиба. Особое внимание уделено кособродской толще, в пределах которой развиты углеродистые отложения. Установлено, что золото в черносланцевых образованиях района г. Тётечная приурочено к интенсивно дислоцированным, окварцованным и сульфидизированным породам, пронизанным телами порфировых диоритов биргильдинско-томинского комплекса. Бороздовое опробование по серии скважин показало содержание золота до 1,5 г/т, что позволяет надеяться на выявление здесь нового золоторудного объекта.This paper considers the geological structure of the northern part of the East-Urals Trough. Particular attention is paid to the Kosobrodskaya Formation, where the carbonaceous deposits are most abundant. It was found that the gold in the black shales of the Tyotechnaya Mountain is associated with the intensively dislocated, silicified and sulfidised rocks struck with the diorite porphyry of the Birgildin-Tomino Complex. Channel sampling on the number of wells showed the gold grades up to 1.5 g/t that allows suggesting the setting up of new gold deposit

The role of free-radical processes in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Review

the modern ideas of the role of free radical processes in the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD) are consid- ered. Data of large randomized clinical trials on application of antioxidants for prevention and therapy AMD are provided. Possibility of the differential application of antioxidants depending on the genetic status of patients is discussed

DESIGN OF HPLC METHODS OF AFOBAZOLE QUANTITATIVE ANALYSIS IN BLOOD PLASMA

The article describes a method of quantitative analysis of anxiolytic drug with neuropro-tective activity - fabomotizole (afobazole) in rabbit blood plasma by HPLC with UV detection at 302 nm. The analysis was performed in isocratic mode using Stayer chromatography system and a reversed-phase column Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250х4.6,4 µm) and a mobile phase (acetonitrile-water-glacial acetic acid-triethylamine in the ratio 100 : 240 : 100 : 0,3 : 0,25) at pH 6.1. The retention time of test-substance was 10,00 +/- 0,11 min. Fabomotizole extraction from plasma carried using diethyl ether (1.5 ml plasma and 6 ml acetonitrile) by shaking on Shaker apparatus at 400 vol./min for 10 minutes, centrifuging at 3500 rpm. for 10 minutes and evaporation of the supernatant on a vacuum rotary evaporator at 40 C. The recovery was 87%. The developed technique is characterized by sensitivity, specificity, ease of implementation, repro-ducibility and linearity in the plasma concentration range after oral administration of 3.8 mg of the substance (Afobazol tablets, 10 mg, Pharmstandart-Leksredstva, Russia) to rabbits

Количественный анализ митоксантрона методом ВЭЖХ-МС/МС в среде для культивирования клеток Caco-2

Mitoxantrone is a marker substrate of breast cancer resistance protein (BCRP). BCRP is involved in a number of pharmacokinetic drug–drug interactions. The transporter’s possible saturability makes it advisable to use low concentrations of mitoxantrone for in vitro studies. Consequently, mitoxantrone quantification requires a method with high sensitivity.The aim of the study was to develop and validate a procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS.Materials and methods. The authors used an Ultimate 3000 HPLC system and a TSQ Fortis triple quadrupole mass spectrometer by Thermo Fisher Scientific and a Selectra C18 column (4.6×100 mm, 5 µm, 100 Å) by United Chemical Technologies. The elution ran in a gradient mode with a mobile phase of 1% formic acid solution and methanol. Experimental parameters were as follows: eluent flow rate, 0.3 mL/min; separation column temperature, 35 °C; injection volume, 5 µL; analysis time, 10 min; approximate mitoxantrone retention time, 5.51 min. The sample preparation involved protein precipi tation from the culture medium with methanol, followed by centrifugation at 13,000 g for 10 min. The detection was performed using electrospray ionisation in the positive ion mode. Detection parameters were as follows: electrospray voltage, 3700 V; sheath gas flow rate, 50 L/min; auxiliary gas flow rate, 10 L/min; sweep gas flow rate, 1 L/min; ion-transfer tube temperature, 300 °C; and evaporator temperature, 350 °C. The detection was set at mass transitions of m/z 455 to 88.2 and m/z 455 to 358.1, with the collision energy for these transitions amounting to 25 V and 18 V, respectively. The source fragmentation was at 0, and the CID gas pressure was at 2 mTorr.Results. The analytical procedure showed selectivity, high sensitivity (limit of detection, 10 nmol/L; lower limit of quantification, 50 nmol/L), accuracy, precision, and linearity in the concentration range of 50–1000 nmol/L. The authors observed no carryover or matrix effects. A simulation of real-life storage conditions demonstrated high stability of mitoxantrone samples. Thus, the analytical procedure enables preclinical evaluation of medicinal product effects on the functional activity of BCRP, based on assessing the transcellular mitoxantrone transport in the presence of a test product.Conclusion. The authors developed and validated the analytical procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS.Митоксантрон — маркерный субстрат белка устойчивости рака молочной железы (BCRP), участвующего в ряде фармакокинетических межлекарственных взаимодействий. При проведении исследований in vitro в связи с возможной насыщаемостью транспортера BCRP целесообразно применять невысокие концентрации митоксантрона, поэтому необходим высокочувствительный метод его количественного определения.Цель работы: разработка и валидация методики количественного определения митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.Материалы и методы: анализ выполняли на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Ultimate 3000» (Thermo Fisher Scientific) с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором TSQ Fortis и колонкой UCT Selectra C18 4,6×100 мм, 5 мкм, 100 Å. Использовали градиентный режим элюирования, подвижная фаза — смесь раствора муравьиной кислоты 1% и метанола. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, температура разделения — 35 °С, объем пробы — 5 мкл. Длительность анализа — 10 мин, время удерживания митоксантрона — 5,51 мин. Пробоподготовка заключалась в осаждении белка среды для культивирования метанолом и центрифугировании (13 000 g, 10 мин). Детектирование проводили в режиме регистрации положительных ионов, метод ионизации — электрораспыление (3700 В), оболочечный газ 50 л/мин, вспомогательный газ 10 л/мин, продувочный газ 1 л/мин, температура трубки для переноса ионов 300 °С, температура испарителя 350 °С. Переходы масс: 455 m/z → 88,2 m/z при энергии столкновения 25 В, 455 m/z → 358,1 m/z при 18 В, фрагментация источника 0, CID gas 2 мТорр.Результаты: методика характеризовалась селективностью, чувствительностью (предел обнаружения — 10 нмоль/л, нижний предел количественного определения — 50 нмоль/л), правильностью, прецизионностью и линейностью (50−1000 нмоль/л). Отсутствовал перенос пробы и матричный эффект, образцы проб обладали стабильностью при моделировании реальных условий хранения. Методика позволяет проводить доклинические исследования влияния лекарственных веществ на активность BCRP путем оценки трансцеллюлярного переноса митоксантрона в присутствии тестируемого вещества.Выводы: разработана и валидирована ВЭЖХ-МС/МС методика количественного анализа митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2