Amniotic Fluid Stem Cells: Future Perspectives

The existence of stem cells in human amniotic fluid was reported for the first time almost ten years ago. Since this discovery, the knowledge about these cells has increased dramatically. Today, amniotic fluid stem (AFS) cells are widely accepted as a new powerful tool for basic research as well as for the establishment of new stem-cell-based therapy concepts. It is possible to generate monoclonal genomically stable AFS cell lines harboring high proliferative potential without raising ethical issues. Many different groups have demonstrated that AFS cells can be differentiated into all three germ layer lineages, what is of relevance for both, the scientific and therapeutical usage of these cells. Of special importance for the latter is the fact that AFS cells are less tumorigenic than other pluripotent stem cell types. In this paper, we have summarized the current knowledge about this relatively young scientific field. Furthermore, we discuss the relevant future perspectives of this promising area of stem cell research focusing on the next important questions, which need to be answered

A Novel Heterocyclic Compound CE-104 Enhances Spatial Working Memory in the Radial Arm Maze in Rats and Modulates the Dopaminergic System

Various psychostimulants targeting monoamine neurotransmitter transporters (MAT) have been shown to rescue cognition in patients with neurological disorders and improve cognitive abilities in healthy subjects at low doses. Here, we examined the effects upon cognition of a chemically synthetized novel MAT inhibiting compound 2-(benzhydrylsulfinylmethyl)-4-methylthiazole (named as CE-104). The efficacy of CE-104 in blocking MAT (DAT – dopamine transporter, SERT – serotonin transporter and NET – norepinephrine transporter) was determined using in vitro neurotransmitter uptake assay. The effect of the drug at low doses (1 and 10mg/kg) on spatial memory was studied in male rats in the radial arm maze (RAM). Furthermore, the dopamine receptor and transporter complex levels of frontal cortex (FC) tissue of trained and untrained animals treated either with the drug or vehicle were quantified on blue native PAGE (BN-PAGE). The drug inhibited dopamine (IC50: 27.88µM) and norepinephrine uptake (IC50: 160.40µM), but had a negligible effect on SERT. In the RAM, both drug-dose groups improved spatial working memory during the performance phase of RAM as compared to vehicle. BN-PAGE western blot quantification of dopamine receptor and transporter complexes revealed that D1, D2, D3 and DAT complexes were modulated due to training and by drug effects. The drug’s ability to block DAT and its influence on dopamine transporter and receptor complex levels in the FC is proposed as a possible mechanism for the observed learning and memory enhancement in the RAM

Effect of Modafinil and its related compounds on learning and memory and in synaptic plasticity

Hintergrund: Kognitionsförderde Substanzen fördern kognitive Fähigkeiten auf der Lern- und Gedächtnisebene. In Abhängigkeit von ihrer chemischen Struktur zielen die Substanzen auf unterschiedliche zelluläre molekulare Mechanismen und können daher unterschiedliche Effekte auf Lernen und Gedächtnis induzieren. Die Mehrzahl dieser Substanzen induzieren eine Erhöhung der Dopaminkonzentration in verschiedenen Gehirngebieten, allerdings auf unterschiedlichen Wegen; durch die Erhöhung des Freisetzung von Dopamin oder durch die Blockade des Dopamintransporters, beide Wege führen zu erhöhter Stimulation der Dopaminrezeptoren. Es wurde bereits gezeigt, daß eine Erhöhung des Dopaminspiegels in bestimmten Hirngebieten die gewünschten Effekte auf die Gedächtnisleistungen bewirken. Modafinil ist eine dieser Substanzen, die ursprünglich zur Therapie von Schlafstörungen wie Narkolepsie oder Schlafapnoe klinisch eingesetzt wurde. In Tiermodellen wurde allerdings gezeigt, daß es auch Gedächntnis- und Lernfördernde Wirkungen in gesunden Subjekten hat. Ziel: Ziel der Untersuchen war die Testung dieser Effekte von Modafinil und strukturell ähnlicher Komponenten in unterschiedlichen Gedächntnistestparadigmen, die räumliches Referenz- und Arbeitsgedächtnis und aversives Lernen einschließen, in Ratten durch Applikation physiologisch relevanter Dosierungen. Zusätzlich wurden deren Effekte auf die hippokampale Langzeitpotenzierung im Gyrus dentatus in vivo untersucht. Methoden: Junge, 12-14 Wochen alte, Sprague-Dawley Ratten wurden für die Untersuchungen verwendet. Die Substanzen wurden jeweils frisch angesetzt, gelöst in Dimethyl sulfoxid (DMSO) und intraperitoneal (i.p.) vor dem Beginn der Experimente appliziert. In allen Untersuchungen wurden physiologisch relevante Dosierungen von 1 mg und/oder 10 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Modafinil- oder Vehikelbehandelte Ratten wurden in einem aversiven Lernparadigma, bestehend aus einem klassischen Furchtkonditionierungstest (FC) und einem operanten Konditionierungstest (Zweiwegvermeidungslernen in einer Shuttle box. In einem räumlichen Arbeitsgedächtnistest (belohnungsunterstütztem Alternierungstest im T-maze) wurden die Effekte von Modafinil verglichen mit denen von Levodopa (einer Vorstufe von Dopamin). Das R-Enantiomer von Modafinil wurde in einem räumlichen Langzeitgedächtnistest (Holeboard) und auf Effekte auf die synaptische Plastizität im Gyrus dentatus der hippokampalen Formation durch in vivo elektrophysiologische Methoden getestet. Mögliche Nebenwirkungen auf das Verhalten wurden in einer neurotoxikologischen Testbatterie erfasst. CE-104, eine neu synthetisierte struktuell ähnliche Komponente von Modafinil wurde in einem räumlichen Gedächtnistest (Radial arm maze) getestet. Die Bindungskapazitäten der Substanzen an verschieden Neurotransmittertransportern wurden durch den Einsatz von in vitro Wiederaufnahmeassays und die Effekte auf präsynaptische Ausschüttungskapazitäten durch den Einsatz von Neurotransmitterauschüttungsassays getestet. Ergebnisse: Es wurden unterschiedliche, aufgabenabhängige Effekte von Modafinil gefunden. Im FC-test zeigten modafinilbehandelte im Vergleich zu Kontrollratten eine dosisabhängige Erhöhung des Furchtgedächtnisses, angezeigt durch kontextabhängiges erhöhtes "freezing". Das reizabhängige Furchtgedächtnis war zwischen beiden Gruppen ähnlich. In der operanten Konditionierung induzierte Modafinil eine signifikante Verringerung der Vermeidungsreaktionen im Vergleich zu Kontrolltieren. Die Anzahl der Fluchtreaktionen zwischen beiden Gruppen unterschied sich nicht. Levodopa jedoch nicht Modafinil erhöhte signifikant das räumliche Arbeitsgedächtnis in der frühen Testphase. Beide Substanzen induzierten dosisabhängige Unterschiede im Arbeitsgedächtnis mit signifikant besseren Arbeitsgedächtnisleistungen der mit Modafinil niedrigdosiert Ratten im Vergleich zu hochdosiert behandelten Ratten. Im Gegensatz hierzu zeigten die mit Levodopa hochdosiert behandelten Ratten bessere Arbeitsgedächtnisleistungen als die niedrigdosiert behandelten Ratten. Interessanterweise zeigten sich diese Unterschiede bei beiden Substanzen nur am dritten Tag der Testung. In der späteren Testphase verschwanden diese Unterschiede ebenso wie die zu Kontrolltieren. CE-104 in beiden Dosierungen verbesserte das räumliche Arbeitsgedächtnis im Radial-arm-maze im Vergleich zu Kontrolltieren. R-Modafinil in beiden Doseriungen verbesserte das räumliches Lernen und das Langzeitgedächtnis im Holeboardtest im Vergleich zu DMSO behandelten Ratten, im Vergleich zu Kochsalzlösung (0.9 %) behandelten Ratten ergaben sich jedoch keine Unterschiede. Ratten die mit Kochsalzlösung behandelt wurden zeigten ein besseres Langzeitgedächtnis als DMSO behandelte Ratten. Vergleichbare Effekte auf die synaptische Plastizität im Gyrus dentatus wurden gefunden. R-Modafinil konnte die beeinträchtigende Wirkung von DMSO auf die Langzeitpotenzierung aufheben, zeigte allerdings keinen Unterschied in der Langzeitpotenzierung zu Ratten die mit Kochsalzlösung behandelt wurden. R-Modafinil induzierte keine Unterschiede in der neurotoxischen Testbatterie im Vergleich zu DMSO behandelten Ratten. R-Modafinil induziert ähnliche Effekte auf die synaptische Plastizität im Hippokampus und auf hippokampusabhängige Lern- und Gedächtnisleistungen. Diese Ergebnisse unterstützen die Sichtweise, daß langzeitpotenzierungsähnliche Mechanismen ein Faktor für die kognitionserhöhende Wirkung dieser Substanzen auf räumliche Gedächtnisspuren darstellt. Schlußfolgerung: Die hier vorgestellten Ergebnisse erweitern das Verständnis der lern- und gedächntnisregulierenden Mechanismen von Modafinil und strukturell modafinilähnlicher Substanzen und möglicherweise das von kognitionsverstärkenden Substanzen im Allgemeinen Modafinil, werden, neben dem Nutzen als Medikament zu Behandlung von Narkolepsie, auch Effekte zur Verbesserung kognitiver Prozesse zugeschrieben. Das Ziel der vorliegenden Studien war es, die wenigen hierzu vorliegenden Studien zu erweitern und zu ergänzen. An jungen, männlichen Ratten wurden Effekte von Modafinil auf räumliche und aversive Gedächtnisleistungen und auf die hippokampale Langzeitpotenzierung (LTP), ein zelluläres Modell der Gedächtnisformierung, geprüft. In einem Furchtkonditionierungstest (FC-test) zeigten modafinilbehandelte im Vergleich zu Kontrollratten eine dosisabhängige Erhöhung des kontextabhängigen, jedoch nicht des signalabhängigen Gedächtnisses. In einer operanten Konditionierung induzierte Modafinil eine signifikante Verringerung der Vermeidungsreaktionen im Vergleich zu Kontrolltieren. Die Anzahl der Fluchtreaktionen zwischen beiden Gruppen unterschied sich nicht. In einem räumlichen Arbeitsgedächtnistest (belohnungsunterstütztem Alternierungstest im T-maze) wurden die Effekte von Modafinil verglichen mit denen von Levodopa (einer Vorstufe von Dopamin). Levodopa, jedoch nicht Modafinil, verbesserte das Arbeitsgedächtnis während der frühen Trainingsphase gegenüber Kontrolltieren. Das Enantiomer R-Modafinil verbesserte das räumliche Lernen und das Langzeitgedächtnis im Holeboardtest im Vergleich zu DMSO behandelten Ratten, jedoch nicht im Vergleich zu Kochsalzlösung behandelten Ratten, die ein besseres Langzeitgedächtnis als DMSO behandelte Ratten aufwiesen. In ähnlicher Weise konnte R-Modafinil, die durch DMSO induzierte Beeinträchtigung der hippokampalen LTP aufheben, induzierte jedoch keinen Unterschied in der synaptischen Plastizität im Vergleich zu kochsalzbehandelten Ratten Die hier vorgestellten Ergebnisse erweitern das Verständnis der lern- und gedächntnisregulierenden Mechanismen von Modafinil und strukturell modafinilähnlicher Substanzen und möglicherweise das von kognitionsverstärkenden Substanzen im Allgemeinen.Background: Cognitive enhancers are a specific class of psychoactive drugs known to induce positive effects on the performance of cognition-related functions in experimental animals as well as in humans. Depending on the properties of their chemical structures, different compounds can have different molecular targets in cell, consequently, also very different effects on the cognitive function, as for example, on learning and memory. Most of these compounds work by aiding the release of neurotransmitter and hence increasing the levels of dopamine in the brain; by acting as agonists of dopamine receptors or by blocking the dopamine transporter. It has been shown that the increase in dopamine in certain brain regions has favorable effects on memory. Modafinil is one of such compounds, originally approved for clinical use to treat sleep disorders like narcolepsy, sleep apnea etc. Research in animal models shows that it also has potential to improve memory and cognitive function of healthy subjects. Aim: Using the rat as experimental animal model and physiologically relevant dosages, we here tested the effects of Modafinil and some structurally related compounds on spatial memory, working memory and aversive learning paradigms, as well as their effects on dentate gyrus Long term potentiation (DG-LTP) in vivo. Methods: Young Sprague dawley rat strain of age 12-14 week old were used for the experiments. The drug was freshly dissolved in a vehicle (Dimethyl sulfoxide, DMSO) and were administered through i.p. injection before the start of the experiment. For all the experiments, physiologically relevant doses of 1 and/or 10mg/kg bodyweight were used. Modafinil/vehicle treated animals were tested in aversive learning paradigms; classical fear conditioning (FC) and in operant conditioning (Two-way avoidance learning (TWA), shuttle box). In a working memory paradigm (rewarded alternation test using T-maze), Modafinil's effect was compared with Levodopa (a precursor of dopamine). Its enantiomer R-Modafinil was tested in a spatial long term memory paradigm; hole board test and its effect on synaptic plasticity in dentate gyrus using in vivo electrophysiology technique. Its side effects were assessed with an array of neurotoxicity tests. CE-104 is a derivative of Modafinil was tested in Radial arm maze (RAM). The compound's ability to bind to neurotransmitter transporter was accessed using in vitro neurotransmitter reuptake assay and its ability to aid the release of neurotransmitter from presynaptic terminal was studied using neurotransmitter release assay. Results: We found a differential, task-dependent effect of modafinil. In the FC paradigm modafinil treated rats showed a dose-dependent enhancement of fear memory compared to vehicle treated rats, indicated by increased context-related freezing. Cue related fear memory remained unaffected. In the TWA paradigm modafinil induced a significant decrease of avoidance responses compared to vehicle treated animals, while the number of escape reactions during the acquisition of the TWA task remained unaffected. Levodopa but not modafinil increased working memory performance during early training significantly at day 3 when compared to vehicle controls. Both drugs induced dose dependent differences in working memory with significantly better performance at low doses compared to high doses for modafinil, in contrast to Levodopa where high dose treated rats performed better than low dose rats. Strikingly, these effects appeared only at day 3 for both drugs, followed by a decline in behavioral performance. CE-104 in RAM, both 1 and 10 mg/kg body weight drug-dose groups improved spatial working memory during the performance phase of RAM as compared to vehicle. R-Modafinil at both doses significantly enhanced spatial reference memory during the last training session and during memory retrieval compared to DMSO vehicle but not when compared to saline treated rats. Similarly R-Modafinil rescues DG-LTP from impairing effects of DMSO with no difference in synaptic transmission when compared to saline treated rats. DMSO reduced memory performance and LTP magnitude when compared to saline treated groups. We found no effect of R-Modafinil in the neurotoxicity tests. R-modafinil treatment induces similar effects in LTP and memory performance. Thus, our result supports the notion that LTP-like synaptic plasticity processes could be one of the factors contributing to the cognitive enhancing effects of spatial memory traces. Conclusion: These findings expand the knowledge in the regulation of cognitive abilities by modafinil and its related compounds and may contribute to the understanding of the mechanism of effects of cognitive enhancers Modafinil is a wake promoting drug was originally approved for clinical use to treat sleep related disorders but has been used off-trade as cognitive enhancers. There has been only little work done to assess its potential as cognitive enhancers. Hence we intend to extend the research and tested Modafinil at physiologically relevant doses in various spatial and aversive learning memory paradigms as well as in synaptic plasticity in young rats. We found a differential, task-dependent effect of modafinil. In the classical fear conditioning paradigm, modafinil treated rats showed a dose-dependent enhancement of context-related freezing whereas the cue-related freezing remained unaffected. In the Two-way avoidance learning paradigm modafinil induced a significant decrease of avoidance responses compared to vehicle treated animals, while the number of escape reactions during the acquisition phase remained unaffected. Modafinils effect was compared with Levodopa (a precursor of dopamine) in T-maze. Levodopa but not modafinil increased working memory performance during early training significantly at day 3 when compared to vehicle controls. In holeboard test, R-Modafinil significantly enhanced spatial reference memory during memory retrieval phase compared to its vehicle (dimethyl sulfoxide, DMSO) vehicle but not when compared to saline treated rats. Similarly R-Modafinil rescues dentate gyrus LTP from impairing effects of DMSO with no difference in synaptic transmission when compared to saline treated rats. DMSO reduced memory performance and LTP magnitude when compared to saline treated groups. These findings expand the knowledge in the regulation of cognitive abilities by modafinil and may contribute to the understanding of the mechanism of effects of cognitive enhancers.submitted by Bharanidharan ShanmugasundaramAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZusammenfassung in deutscher SpracheUniversität für Bodenkultur Wien, Dissertation, 2017OeBB(VLID)193077

R-Modafinil exerts weak effects on spatial memory acquisition and dentate gyrus synaptic plasticity

<div><p>Modafinil is a wake promoting drug approved for clinical use and also has cognitive enhancing properties. Its enantiomer R-Modafinil (R-MO) is not well studied in regard to cognitive enhancing properties. Hence we studied its effect in a spatial memory paradigm and its possible effects on dentate gyrus long-term potentiation (DG-LTP). Clinically relevant doses of R-MO, vehicle dimethyl sulfoxide (DMSO) or saline were administered for three days during the hole-board test and in <i>in vivo</i> DG-LTP. Synaptic levels of dopamine receptors D1R, D2R, dopamine transporter (DAT), and its phosphorylated form (ph-DAT) in DG tissue 4 h after LTP induction were quantified by western blot analysis. Monoamine reuptake and release assays were performed by using transfected HEK-293 cells. Possible neurotoxic side effects on general behaviour were also studied. R-MO at both doses significantly enhanced spatial reference memory during the last training session and during memory retrieval compared to DMSO vehicle but not when compared to saline treated rats. Similarly, R-MO rescues DG-LTP from impairing effects of DMSO. DMSO reduced memory performance and LTP magnitude when compared to saline treated groups. The synaptic DR1 levels in R-MO groups were significantly decreased compared to DMSO group but were comparable with saline treated animals. We found no effect of R-MO in neurotoxicity tests. Thus, our results support the notion that LTP-like synaptic plasticity processes could be one of the factors contributing to the cognitive enhancing effects of spatial memory traces. D1R may play an important regulatory role in these processes.</p></div

Effect of treatment on field potential measurements in DG: Stimulation with weak tetanus.

<p>Data was analyzed with two-way repeated measure ANOVA. Multiple comparison with Dunnett t (2-sided) test reveals difference between groups in fEPSP (A) and in PSA (B) measurements. * dmso vs 10 mg RMO (p<0.05), # saline vs dmso (p<0.05). Graphs shows mean ± SD. (C) Electrophysiological fEPSP (left panel) and PSA (right panel) analogue traces of baseline and 3h post LTP induction are given for DMSO, RMO and saline. (D) Analogue traces of PSA and fEPSP with marks of points of measurement.</p

Spatial learning and memory in the Hole-board.

<p>The performance was significantly better with improved RMI during day 2 and during retrieval (trial 10) on day 3 of the hole-board testing (A). (B) detailed data presentation for trial 10. Lower panels show the mean ± SEM and the upper panels the individual data points. Two-way repeated measure ANOVA for day 1 & 2 and univariate ANOVA on day 3 were used. * p < 0.05, DMSO vs R-MO 1 & 10 mg/kg. # p < 0.05, DMSO vs saline.</p

Monoamine neurotransmitter reuptake inhibition and release assay.

<p>(A) Inhibition of [³H]DA, [³H]MPP⁺ and [³H]5-HT reuptake by increasing concentrations of R-modafinil in HEK293 cells stably expressing human isoforms of DAT, NET and SERT. Experiments were performed as described in the methods section. Unspecific uptake was determined by using 10 μM mazindole for HEK-DAT and HEK- NET and 10 μM paroxetine for HEK-SERT. The percentage of maximum uptake was determined by using 1% DMSO in KHB. Graph shows mean values ± SD. (B) The release assay was performed in HEK-DAT cells. Cells were grown on PDL-coated coverslips, treated with 0,05 μM [³H]MPP⁺ at 37°C for 20 min and washed with KHB for 40 min in superfusion chambers. First three time points (baseline) and next four points were recorded without any compounds and with 10 μM Monensin, respectively. Final five points were with either 10 μM R modafinil or 10 μM D-amphetamine. Non-linear regression analysis was carried out. Values are presented as mean ± SD.</p

Experimental design of the hole-board and LTP experiments.

<p>For <i>in vivo</i> LTP and paired pulse facilitation test, treatment frequency and procedure was designed that matches with the hole-board test protocol. The term ‘treatment’ implies that the animals either administered with R-MO or DMSO or saline 30 min before the start of the actual experiment.</p