Phylogeny of Mycoplasma bovis isolates from Hungary based on multi locus sequence typing and multiple-locus variable-number tandem repeat analysis

BACKGROUND: Mycoplasma bovis is an important pathogen causing pneumonia, mastitis and arthritis in cattle worldwide. As this agent is primarily transmitted by direct contact and spread through animal movements, efficient genotyping systems are essential for the monitoring of the disease and for epidemiological investigations. The aim of this study was to compare and evaluate the multi locus sequence typing (MLST) and the multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA) through the genetic characterization of M. bovis isolates from Hungary. RESULTS: Thirty one Hungarian M. bovis isolates grouped into two clades by MLST. Two strains had the same sequence type (ST) as reference strain PG45, while the other twenty nine Hungarian isolates formed a novel clade comprising five subclades. Isolates originating from the same herds had the same STs except for one case. The same isolates formed two main clades and several subclades and branches by MLVA. One clade contained the reference strain PG45 and three isolates, while the other main clade comprised the rest of the strains. Within-herd strain divergence was also detected by MLVA. Little congruence was found between the results of the two typing systems. CONCLUSIONS: MLST is generally considered an intermediate scale typing method and it was found to be discriminatory among the Hungarian M. bovis isolates. MLVA proved to be an appropriate fine scale typing tool for M. bovis as this method was able to distinguish closely related strains isolated from the same farm. We recommend the combined use of the two methods for the genotyping of M. bovis isolates. Strains have to be characterized first by MLST followed by the fine scale typing of identical STs with MLVA

Molecular and epidemiological characterization of thermophilic Campylobacter species

Az emberekben előforduló, bakteriális eredetű hasmenések leggyakoribb okozói a termofil campylobacterek Magyarországon és szerte a világon. Ugyanakkor kevés adattal rendelkezünk e zoonotikus kórokozók előfordulásáról a hazai állatállományokban. Munkánk célja volt, hogy egy komplex, átfogó képet kapjunk a magyarországi haszonállatok Campylobacter-fertőzöttségéről, fajonkénti eloszlásáról, és a fertőzést okozó Campylobacter-fajok molekuláris biológiai jellemzőiről. A fő élelmiszer-alapanyagként szolgáló állatfajokból (szarvasmarhából, sertésből és baromfi fajokból) vágóhidakon két év (2008-2009) alatt gyűjtött 1110 bélmintát vizsgáltunk meg. Vizsgáltuk a Campylobacter-fajok kimutathatóságát tenyésztéssel és PCR módszerekkel, fenotípusos sajátságaikat és genetikai jellemzőit. Megvizsgáltuk az egyes fajok további tipizálhatóságát flaA SVR szekvenálással, PFGE-vel, MLST-vel. A monitoring vizsgálatok megkönnyítésére kifejlesztettünk egy real-time PCR módszert a C. jejuni és a C. coli azonosítására. A két rendszert úgy optimalizáltuk, hogy azok azonos hőmérsékleti profillal fussanak, így nem multiplex formában, de egy gépben egyszerre 45 mintát tudtunk vizsgálni. A rendszer EvaGreen fluoreszcens jelölőfestékkel működik, és a két faj az olvadási görbék alapján különíthető el. Összehasonlítottuk a hagyományos fenotípusos tulajdonságok vizsgálata alapján végzett fajmeghatározásokat a PCR-rel kapott eredményekkel, és azt tapasztaltuk, hogy több esetben, amikor a biokémiai tulajdonságok alapján bizonytalan eredményt kaptunk, vagy a fajt nem sikerült azonosítani, a PCR gyors és megbízható eredményt adott. A vizsgálatok eredményeként megállapítottuk, hogy a magyarországi haszonállatok közül a brojlercsirke- és sertésállományok Campylobacter-fertőzöttsége magas, 60,1% illetve 43,3%, míg a szarvasmarhák Campylobacter-hordozása nem jellemző (6,7%). A brojlercsirke-állományok fertőzöttségéért a C. jejuni és C. coli fele-fele arányban felelős, sertésállományokban pedig a C. coli dominál. Figyelemre méltó, hogy a pozitív sertésekből viszonylag magas százalékban (20,7%) izoláltunk C. lanienae-t, amelynek gyakorisága megelőzi a C. jejuni előfordulását sertésben. Ezt a fajt először egészséges emberekből tenyésztették ki, majd sertésből és szarvasmarhából is izolálták. Nekünk szarvasmarhából nem sikerült kimutatni. Az izolált törzsek antibiotikum-rezisztenciáját leveshígításos módszerrel vizsgáltuk és a MIC értékeket mikrotiter lemezekről olvastuk le. Megállapítottuk, hogy jelentős az enrofloxacin/ciprofloxacin és nalidixsav rezisztencia, különösen a brojlercsirkéből származó C. jejuni-ban (73,3%) és C. coli-ban (77,2%). Az eritromicin (p=0,043) és tetraciklin (p=1,865e-14) rezisztencia magasabb a C. coli-ban (9,7% és 74,1%), mint a C. jejuni-ban (3,1% és 36,6%), ezáltal sertésekben gyakoribb. A magas fluorokinolon rezisztencia veszélyezteti az esetleges humán gyógykezelés hatékonyságát, mivel azok elsődlegesen alkalmazott szerek. A kórokozók járványtanának, a fertőzések terjedése dinamikájának megértéséhez elengedhetetlen a mikrobák összehasonlítása, tipizálása. Összesen 73 C. jejuni és C. coli törzset tipizáltunk az flaA gén SVR szekvenálásával. 47 különböző típust határoztunk meg, amelyek közül 35 csak egyszer fordult elő. A leggyakoribb allél típus az A66 és A21 volt. A filogenetikai elemzések során baktériumfaj vagy állatfaj szerinti csoportosulás nem volt megfigyelhető a törzsfán. PFGE módszerrel 122 törzset vizsgáltunk meg. Az izolátumok 66%-a egyedi mintázatot mutatott a SmaI enzimmel való hasítás után. 42 izolátumot, amelyek 18 SmaI-klasztert alkottak, tovább vizsgáltunk KpnI enzimmel. Ezek közül 24 izolátum 10 KpnI-klasztert alkotott. 7 KpnI-klaszterben járványügyi kapcsolatot találtunk az izolátumok között. Stabil C. jejuni és C. coli klónokat találtunk, amelyek jelentősége a humán megbetegedésekben további vizsgálatokat igényel. Magyarországon először tipizáltunk MLST módszerrel különböző állatfajokból származó Campylobacter törzseket. Egy szarvasmarhából izolált C. jejuni és egy sertésből izolált C. coli törzs MLST profilját határoztuk meg. Magyarországon elsőként izoláltunk C. lanienae-t. A két év alatt 43 izolátumot gyűjtöttünk, amely a faj átfogó vizsgálatát tette lehetővé. A részleges 16S rRNS gén szekvenciák vizsgálata során eddig le nem írt változatokat találtunk a Vc2 és Vc6-os variábilis régiókban. A filogenetikai vizsgálatok a C. jejuni-hoz hasonló genetikai változatosságról tanúskodtak. Vizsgálataink arra utalnak, hogy a sertésből és szarvasmarhából származó törzsek mind fenotípusosan, mind genotípusosan elkülönülnek egymástól. Elsőként tipizáltunk C. lanienae törzseket PFGE módszerrel, és a kipróbált három különböző enzim közül a SmaI enzim bizonyult a leghatékonyabbnak. Habár zoonotikus jelentősége ennek a fajnak még nem ismert, munkánk rámutat országos elterjedtségére sertésállományainkban, és egy tipizálási lehetőségről számolunk be egy esetleges epidemiológiai vizsgálathoz. A C. lanienae törzsek a sertésekben előforduló C. coli törzsekhez hasonlóan magas tetraciklin rezisztenciát mutattak (60,9%), és eritromicin–enrofloxacin rezisztens, illetve multirezisztens törzseket is találtunk. Takarmányozási kísérletekben vizsgáltuk különböző takarmány-kiegészítők Campylobacter ellenes hatását, de az eredmények alapján nem csökkentették az állatok Campylobacter-fertőzöttségét

Multidrug-resistant E. coli and coliforms in confiscated foods of non-Shengen origin

Multidrug resistance (MDR) in Enterobacteriaceae is an increasing worldwide concern. The import of contaminated food may represent a food safety risk by the spread of pathogenic- and/or MDR bacteria and their determinants for antimicrobial resistance. As part of an EU collaborative research project (PROMISE), our studies aimed to identify and analyse pathogens like Salmonella spp., Campylobacter spp. and verotoxigenic E. coli (VTEC), and isolation of MDR E. coli from food samples from non-Schengen countries confiscated at Hungarian borders was also attempted. Detection of Salmonella, Campylobacter and VTEC bacteria was performed according to the appropriate ISO standards (ISO 6579:2002/Salmonella, ISO 10272-1:2006/Campylobacter and ISO 16654:2001/VTEC-O157). For the isolation of non-O157 VTEC strains the Ridascreen® method was also used. E. coli colonies were isolated by their phenotype on Chromocult Coliform selective agar plates (Merck) and their identity was confirmed by PCR based on the presence of lacZ and uidA genes. For the detection of MDR of E. coli a pre-selection was used: the isolates were tested for their resistance to ampicillin, cefotaxime and tetracycline, and those demonstrating resistance for at least one of these three antibiotics were tested by disc diffusion for 18 antimicrobials with clinical relevance. The interpretation was performed according to the CLSI recommendations, and isolates with intermediate resistance were considered as sensitive. Resistance phenotype was confirmed by the presence of the respective antimicrobial resistance genes by PCR. The integron content of the isolates was also identified. A total of 207 confiscated food samples were tested in this study. All of them proved to be negative for Salmonella and VTEC bacteria, and in one sample from raw chicken carcass Campylobacter jejuni was identified. From the 207 samples, 833 coliform bacteria were isolated (5-10 representatives/sample) according to the methods described above. There were 87 samples negative for the presence of coliforms. From the total of 833 coliform isolates 257 (31%) fulfilled the pre-selection criteria for MDR, and were subjected to the determination of the resistance phenotype. Among them 13 isolates showed resistance to at least three different antimicrobial classes thus were designated as MDR. They represented 11 different food samples: 4 porcine, 2 bovine, 2 chicken, 1 rabbit, 1 duck and 1 of sheep origin. In addition to the above 13 MDR isolates, 10 other isolates merits further analyses, being resistant to β-lactams and/or aminoglycosides. Class 1 integrons (1.0 – 1.5 kb) were found in 9 of the 13 MDR isolates, and majority of them showed an atypical structure lacking the sul1 gene from their conserved segments 3’CS. Identification and detailed characterization of genes underlying above resistances mechanisms is in progress, and results will be analysed in comparison with those of international and our earlier national studies on antimicrobial resistance genotypes

Figure1

Mycoplasma bovis MLST phylogenetic tre

Antibiotic susceptibility profiles of Mycoplasma bovis strains isolated from cattle in Hungary, Central Europe (extended secondary publication)

Summary Background and Objectives: Mycoplasma bovis is a worldwide pathogen, causative agent of pneumonia, mastitis, arthritis, and a variety of other symptoms in cattle. The economic losses due to mycoplasma pneumonia could be reduced by antibiotic treatment. Materials and Methods: Minimal inhibitory concentration (MIC) values of 35 M. bovis strains collected from different parts of Hungary were determined by the microbroth dilution method to fifteen antibiotics. Results and Discussion: Strains with high MIC values were found in the case of all applied antibiotics with the exception of pleuromutilins. Our results confirm the observations of increasing MIC values to antibiotics commonly used in the therapy of Mycoplasma infections, primarily to tetracyclines and macrolides. The growth of many M. bovis strains was not inhibited by gentamicin, spectinomycin, florfenicol or lincomycin. Our results emphasize the necessity of systematic testing for antibiotic susceptibility of M. bovis in this geographic region. The most effective antibiotics tested in vitro were fluoroquinolones and pleuromutilins (not registered for cattle) for M. bovis strains in Hungary. However, current antimicrobial usage policies have to be taken into account to avoid further antibiotic resistance development and to reserve fluoroquinolones for the treatment of severe infections which have responded poorly to other classes of antimicrobials

Figure3

Mycoplasma bovis MLST and MLVA phylogenetic tree

Mycoplasma bovis MLST concatanate alignment

Mycoplasma bovis MLST concatenate alignmen

MLVA data

MLVA dat