A study on the biochemical, functional and technological properties of enterococci

Enterococci are among the most significant, interesting and at the same time controversial groups of lactic acid bacteria. The purpose of the present work was to determine various biochemical and functional properties of enterococci, and to evaluate them through their in situ use in food fermentations. In a first step, a total of 172 strains belonging to different species (mainly E. faecium, E.faecalis and E. durans), and isolated from various sources (food, veterinary and human) were screened for biochemical properties relevant to their technological performance in fermented foods. Moreover, bacteriocin production against spoilage and pathogenic bacteria as well as some basic, potential pathogenic traits, such as antibiotic resistance, biogenic amines production and haemolytic activity were also considered. Strains exhibited low milk acidifying ability and low extracellular proteolytic activity. Their peptidase activities were low and mainly specific against glycine-proline- and glutamate-4-nitroanilide. In contrast,their lipolytic and esterolytic activities were relatively higher. The post-electrophoretic detection of esterase activities showed that the esterolytic system of enterococci was rather complex. It was also observed that most of the strains were able to metabolize citrate in a great extent. Finally, the majority of the strains were found to exhibit antimicrobial activity, were susceptible against vancomycin and teicoplanin, non-haemolytic and were able to produce only tyramine.The biochemical properties and potential pathogenic traits were correlated in respect to origin and species. E. faecalis and to a lesser extent E. faecium strains together with food origin strains were generally more active. Based on the overall results, a strain was selected for further, detailed examination. This strain, ACA-DC 1681 (FAIR-E 198), belongs to theACA-DC Collection of the Laboratory of Dairy Research (Agricultural University of Athens), was isolated from Feta cheese, and identified as Enterococcus faecium. In particular, citrate metabolism by E. faecium ACA-DC 1681 was thoroughly examined, and, in addition, for comparison reasons by E. faecalis FAIR-E 229. Various synthetic media were used, containing citrate either in the presence of glucose or as the sole carbon source. Co-metabolism of citrate and glucose was observed for E. faecium, but this was not the case for E. faecalis. However, for both strains increasing initial citrate concentrations added to MRS broth enhanced both biomass yield and glucose consumption. Both enterococcal strains were able to use citrate for growth and energy production, when this was used as the sole carbon source, producing acetate as the main end product. Citrate consumption was higher in the case of E. faecalis, and as a consequence higher amounts of acetate and formate were produced. However, when citrate was used as sole carbon source for E. faecium growth, formate production was favored in the absence of oxygen. It was suggested that enterococcal strains have the metabolic potential to catabolize citrate and therefore actively contribute tothe flavor development of fermented dairy products. Moreover, bacteriocin production by E. faecium ACA-DC 1681 strain was studied in batch fermentations using either synthetic media, or under conditions simulating Feta cheese preparation. Maximum enterocin activity and specific growth rate was obtained in MRS broth at 37°C with controlled pH 6.5. The enterocin was produced throughout the growth phase of the microorganism, showing primary metabolite kinetics with a peak activity during the midexponential phase. The use of skimmed milk as substrate revealed low enterocin activity. When fermentations were performed in skimmed milk in the presence of rennet, CaCl2, and a mixed starter culture, no enterocin activity was observed, although the examined strain grew well under the above conditions. Results obtained underline the frequently under estimated finding that in vitro production by novel bacteriocinogenic starter or co-cultures is no guarantee for in situ efficiency. It was concluded that the complex food environment thoroughly interferes with bacteriocin production levels. Finally, Feta cheese was prepared using as adjunct starter culture E. faecium ACA-DC1681, E. faecium FAIR-E 243 and their combination. Both E. faecium strains enhanced the growth of the classical starter cultures, non-starter lactic acid bacteria (NSLAB), micrococci and coliforms. Physicochemical characteristics, such as pH, moisture, ash, salt in moisture and fat in dry matter were not influenced by the addition of the E. faecium strains. The most pronounced effect was observed in the case of proteolysis. Both E. faecium strains, either as sole adjunct starter or in combination, increased the proteolytic index and the free aminogroups' concentration, and enhanced degradation of as1- and β-caseins in comparison to thecontrol. Furthermore, the RP-HPLC peptide profiles of the water soluble nitrogen (WSN )fractions were significantly affected by the addition of enterococci. The main volatile compounds produced were ethanol, acetate, acetone, acetaldehyde, acetoni and diacetyl, with highest amounts determined for ethanol, followed by acetate. E. faecium strains positively influenced both citrate consumption and the organoleptic characteristics (taste, aroma, colorand structure) of the full-ripened cheeses, as well as the overall sensory profile. It was also observed that no bacteriocin was produced throughout ripening, under the real Feta cheesemaking conditions. Despite the controversial character of Enterococcus genus, taking into account the desirable biochemical and technological properties of enterococci, as well as their potential pathogenicity, it would be possible to be successfully used as adjunct cultures in the manufacture of fermented, dairy products.Οι εντερόκοκκοι αποτελούν μια από τις πιο ενδιαφέρουσες, σημαντικές, αλλάταυτόχρονα και μια από τις πλέον αμφισβητούμενες ομάδες οξυγαλακτικών βακτηρίων. Η παρούσα εργασία είχε ως σκοπό τη μελέτη διαφόρων βιοχημικών και λειτουργικών ιδιοτήτων των εντεροκόκκων, και την αξιολόγηση τους μέσω της in situ εφαρμογής τους κατά την παρασκευή ζυμώσιμων προϊόντων. Αρχικά, ένα σύνολο 172 στελεχών εντεροκόκκων, που ανήκαν στα πιο γνωστά είδη (Ε. faecium, Ε. faecalis και Ε. durons) και είχαν απομονωθεί από διαφορετικές πηγές (τρόφιμα, ζώα και ανθρώπους), εξετάστηκαν ως προς διάφορες βιοχημικές ιδιότητες που σχετίζονται με την τεχνολογική τους εφαρμογή για την παρασκευή ζυμώσιμων προϊόντων. Επίσης, ελήφθησαν υπόψη η παραγωγή βακτηριοσινών, και ορισμένοι βασικοί χαρακτήρες παθογένειας, όπως είναι η ανθεκτικότητα έναντι αντιβιοτικών, η παραγωγή βιογενών αμινών και η αιμόλυση. Η πλειοψηφία των στελεχών είχαν χαμηλή ικανότητα οξύνισης στο γάλα, και χαμηλή πρωτεολυτική δραστικότητα. Τα στελέχη παρουσίασαν επίσης χαμηλή πεπτιδολυτική δραστικότητα, αλλά με εξειδίκευση κυρίως έναντι του 4-νιτροανιλιδίου του γλουταμινικού οξέος και της γλυκυλο-προλίνης. Αντίθετα, η λιπολυτική και εστερολυτική δραστικότητα των περισσοτέρων στελεχών ήταν σχετικά μεγαλύτερη. Η ανίχνευση εστερασών με ασυνεχή ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου έδειξε ότι το εστερολυτικό σύστημα των εντεροκόκκων είναι αρκετά πολύπλοκο. Παρατηρήθηκε ακόμα ότι η πλειοψηφία ων στελεχών είχε την ικανότητα καταβολισμού του κιτρικού οξέος σε αρκετά υψηλό βαθμό. Τέλος, τα περισσότερα στελέχη παρουσίασαν αντιμικροβιακή δράση, ευαισθησία έναντι αντιβιοτικών, παρήγαγαν μόνο τυραμίνη και ήταν μη αιμολυτικά. Οι βιοχημικές ιδιότητες καθώς επίσης και οι πιθανοί παράγοντες παθογένειας συσχετίστηκαν, τόσο ως προς την προέλευση όσο και ως προς το είδος των στελεχών. Τα περισσότερο δραστικά στελέχη ανήκαν στο είδος Ε. faecalis, και κατά δεύτερο λόγο στο είδος Ε. faecium, ή είχαν απομονωθεί από τρόφιμα. Με βάση τα συνολικά αποτελέσματα επιλέχθηκε τελικά ένα στέλεχος, το οποίο μελετήθηκε εκτενέστερα κατά τη διάρκεια των επόμενων πειραμάτων. Αυτό ήταν το στέλεχος ACA-DC 1681 (FAIR-E 198), που ανήκει στη Συλλογή ACA-DC του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών), είχε απομονωθεί από Φέτα και ταυτοποιήθηκε ως Enterococcus faecium. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε αναλυτικότερα ο τρόπος μεταβολισμού του κιτρικού οξέος από το στέλεχος E. faecium ACA-DC 1681, και για λόγους σύγκρισης και από το Ε. faecalis FAIR-E 229. Χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά υποστρώματα που περιείχαν κιτρικό οξύ είτε ως μόνη πηγή άνθρακα είτε σε συνδυασμό με γλυκόζη. Στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecium έλαβε χώρα ταυτόχρονος μεταβολισμός του κιτρικού οξέος και της γλυκόζης, ενώ κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε για το στέλεχος Ε. faecalis. Ωστόσο, και για τα δύο στελέχη αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις κιτρικού οξέος σε MRS broth ενίσχυσαν την παραγωγή βιομάζας και την κατανάλωση γλυκόζης. Διαπιστώθηκε ότι και τα δύο στελέχη μπορούν να χρησιμοποιήσουν το κιτρικό οξύ για ανάπτυξη και παραγωγή ενέργειας, όταν αυτό αποτελεί την μοναδική πηγή άνθρακα, παράγοντας οξικό οξύ ως το κύριο τελικό προϊόν. Η κατανάλωση του κιτρικού οξέος ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecalis, και συνεπώς παράχθηκε περισσότερο οξικό και μυρμηγκικό οξύ. Εν τούτοις, όταν το κιτρικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως μόνη πηγή άνθρακα στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecium,παρατηρήθηκε σημαντικά μεγαλύτερη παραγωγή μυρμηγκικού οξέος υπό αναερόβιες συνθήκες. Αυτά τα πειράματα αποκαλύπτουν ότι οι εντερόκοκκοι διαθέτουν το μεταβολικό δυναμικό για να αφομοιώσουν το κιτρικό οξύ και συνεπώς να συνεισφέρουν ενεργά στην ανάπτυξη του αρώματος των ζυμώσιμων προϊόντων. Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων συνθηκών ανάπτυξης στην ενεργότητα της εντεροσίνης που παράγεται από το στέλεχος Ε. faecium AC Α-DC 1681. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπό συνθήκες που προσομοίωναν, ως ένα βαθμό, αυτές που επικρατούν κατά την παρασκευή της Φέτας. Η μέγιστη ενεργότητα καθώς και ο μεγαλύτερος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης παρατηρήθηκαν ύστερα από ανάπτυξη του στελέχους σε MRS broth, στους 37°C και σε pH 6.5. Η βακτηριοσίνη ανιχνεύτηκε καθ' όλη τη διάρκεια ανάπτυξης, παρουσιάζοντας μέγιστη ενεργότητα στο μέσο της εκθετικής φάσης. Όταν τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε γάλα παρουσία ρεννίνης, CaCl2 και εναρκτήριων καλλιεργειών, αν και το στέλεχος είχε την ικανότητα να αναπτυχθεί καλά, τελικά ανιχνεύτηκε ελάχιστη ή μηδενική ενεργότητα. Τα πειράματα αυτά αποκαλύπτουν την ανάγκη μεγιστοποίησης της ποσότητας της βιοδιαθέσιμης βακτηριοσίνης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης των τροφίμων, επιλέγοντας εναρκτήριες καλλιέργειες, οι οποίες έχουν το δυναμικό παραγωγής βακτηριοσινών σε υψηλά ποσοστά, και οι οποίες προσαρμόζονται εύκολα και γρήγορα στο περιβάλλον του τροφίμου. Στην τελευταία φάση, χρησιμοποιήθηκαν το στέλεχος Ε. faecium AC Α-DC 1681, το στέλεχος Ε. faecium FAIR-Ε 243 και ο συνδυασμός τους, ως συμπληρωματικές εναρκτήριες καλλιέργειες για την παρασκευή Φέτας. Βρέθηκε ότι η προσθήκη των εντεροκόκκων ευνόησε την ανάπτυξη των εναρκτήριων καλλιεργειών, των NSLAB, των μικρόκοκκων και των κολοβακτηριδίων. Η προσθήκη των στελεχών Ε. faecium επηρέασε ελάχιστα τα περισσότερα από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της Φέτας, όπως το pH, την υγρασία, την τέφρα, το συντελεστής άλατος, και το λίπος επί ξηρού. Ωστόσο, οι μεγαλύτερες μεταβολές παρατηρήθηκαν σε σχέση με την πρωτεόλυση, αφού η χρήση των εντεροκόκκων είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του συντελεστή ωρίμανσης και τη μεγαλύτερη υδρόλυση των as1-και β-καζεϊνών. Επίσης, επέφερε διαφοροποίηση στα χρωματογραφήματα της RP-HPLC σε σχέση με το τυφλό. Επιπλέον, ενίσχυσε την κατανάλωση του κιτρικού οξέος και είχε σημαντικά θετική (γεύση, άρωμα, χρώμα και δομή). Τέλος, δεν ανιχνεύτηκε αντιμικροβιακή δράση από τους εντερόκοκκους υπό τις πραγματικές πια συνθήκες παρασκευής και ωρίμανσης της Φέτας. Παρ' όλο που το γένος των εντεροκόκκων αποτελεί μια αμφισβητούμενη ομάδα μικροοργανισμών, αν ληφθούν υπόψη τόσο όλα εκείνα τα επιθυμητά βιοχημικά και τεχνολογικά χαρακτηριστικά τους, όσο και οι πιθανοί χαρακτήρες παθογένειας, θα ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία, μαζί με άλλες οξυγαλακτικές καλλιέργειες, για την παρασκευή ζυμώσιμων, γαλακτοκομικών προϊόντων