Derivation of hepatocyte like cells form human pluripotent stem cells

Ihmisen alkion kantasolut (hESC) ja ihmisen uudelleen ohjelmoidut monikykyiset kantasolut (hiPSC), yhteiseltä nimeltään ihmisen monikykyiset kantasolut (hPSC), pystyvät jakaantumaan rajattomasti solumaljalla sekä erilaistumaan kaikiksi aikuisen ihmisen solutyypeiksi. hPSC:t ovat ainutlaatuinen solulähde ihmisen kehitysbiologian tutkimukseen, tautimallinnukseen sekä regeneratiivisen lääketieteen käyttöön. hiPSC:t saattavat tulevaisuudessa mahdollistaa autologiset solusiirteet sekä tautispesifisten solujen, kuten geneettisestä maksasairaudesta kärsivien ihmisten hepatosyyttien tuotannon. Maksasairaudet ovat johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti ja ainoa hoitomuoto vakaviin maksasairauksiin on elinsiirto. Maksa on ihmisen aineenvaihdunnan keskus ja päävastuussa lääkeainemetaboliasta. Tämän vuoksi on erityisen tärkeää löytää uusia, parempia maksasolumalleja tautien patologiamekanismien tutkimiseen, lääkeaineiden kehittelyyn sekä uusien lääkeaineiden myrkyllisyyden arviointiin. Hepatosyyttejä onkin jo onnistuneesti erilaistettu hPSC:sta, mutta nykyiset menetelmät eivät pysty tuottamaan täysin toiminnallisia soluja. hPSC:n erilaitumista in vitro ohjataan stimuloimalla soluja sytokiineilla ja kasvutekijöillä, joiden tiedetään ohjaavan solujen erilaistumista myös in vivo. Tämän väitöskirjatyön ensimmäinen tavoite oli tutkia eri hPSC linjojen erilaistumispotentiaalia hepatosyyteiksi. Toinen tavoite oli tutkia miten Aktiviini/Nodal ja Wnt signaalien aktivoinnin kesto maksaerilaistuksen ensimmäisessä vaiheessa, definitiivisen endodermin (DE) erilaistuksessa, vaikuttaa DE solujen maksa- ja haima- erilaistuspotentiaaliin. Viimeisenä tavoitteena oli selvittää miten eri soluväliaineen proteiinit, kuten laminiinit, ja erilaiset kolmiulotteiset (3D) soluviljely-ympäristöt vaikuttavat hPSC:n hepatosyytti- erilaistukseen. Kaikki tutkimuksessa käytetyt hESC ja hiPSC linjat erilaistuivat hepatosyyteiksi. Tuloksemme kuitenkin osoittivat, että ne hiPSC linjat, jotka ovat uudelleenohjelmoitu genomiin integroituvilla retroviruksilla, omaavat potentiaalin transgeenien uudelleenaktivoitumiseen, mikä estää kyseisten linjojen mahdollisen kliinisen käytön. Lisäksi yksi retroviruksilla perustettu linja osoitti jatkuvaa transgeenista KLF4 ilmentymistä, mikä selkeästi häiritsi kyseisen linjan erilaistumista. Näistä syistä hiPSC linjojen teossa on siirrytty käyttämään pääasiassa menetelmiä, joissa transgeenit eivät integroidu solun genomiin. DE solut ovat yhteinen esisoluaste sekä haima- että maksasoluille. DE soluja voidaan erilaistaa hESC ja hiPSC linojoista aktivoimalla Aktiviini/Nodal sekä Wnt signaalireittejä. Tuloksemme osoittavat, että lyhytkestoinen Wnt signaalin aktivoiminen DE erilaistuksen aikana on suosiollista haimaerilaistukselle, kun pidempi Wnt aktivointi puolestaan tehostaa hepatosyyttien erilaistumista. Wnt aktivaatio myös tuki DE solujen pitkäaikaista viljelyä. Terveessä aikuisessa maksassa hepatosyytit eivät jakaannu, mutta kehityksen aikana epäkypsät hepatosyytit, heptaoblastit, jakaantuvat kiivaasti. Lisäksi aikuisessa maksassa hepatosyytit ovat hyvin heterogeenisiä ja hepatosyyttien toiminnallisuus riippuu solujen sijainnista maksassa. Hepatosyyttien toimintaa ohjaavat sekä signaalimolekyylit että soluväliaineen proteiinikoostumus. Tuloksemme osoittivat, että laboratoriossamme valmistettu laminiinirikas soluviljelyvalmiste, JAR-matrix, tuki hPSC linjojen erilaistumista hepatoblasteiksi. Lisäksi geeni-ilmentymisanalyysit osoittivat, että eri 3D soluviljely-ympäristöt tukivat eri maksageenien ilmentymistä; proteiinirikas Matrigeeli edesauttoi Albumiinin ilmentymistä ja solujen albumiinin eritystä, kun taas ainoastaan fysikaalinen 3D tuki edesauttoi metaboliaentsyymeitä koodaavin geenien ilmentymistä. Tuloksemme osoittavat, että soluja ympäröivät proteiinit että 3D- ympäristö säätelevät maksasolujen toiminnallisuutta. Tämä väitöstyö tarjoaa arvokasta biologista ja teknistä tietoa, joiden avulla maksasolujen erilaistusta hPSC linjoista voidaan tulevaisuudessa tehostaa.Human embryonic (hESC) and induced (hiPSC) pluripotent stem cells, collectively termed human pluripotent stem cells (hPSC), represent an unlimited cell source of self-renewing cells for studying human developmental biology, for disease modeling and for regenerative medicine due to their capacity to differentiate in all cell types in human body. hiPSCs may in the future enable generation of large quantities of autologous, patient derived disease-specific cells, such as parenchymal liver cells, hepatocytes. In addition to disease modeling, these cells would be valuable tools for drug discovery. Liver diseases are a leading cause of death worldwide and to date the only treatment for end stage liver disease is organ transplantation. Human liver is the metabolic center of the body and takes care of most of the xenobiotic metabolism and drug detoxification. Therefore, especially academic research and pharmacological industry is in urgent need for valid liver cell models for understanding disease pathogenesis, for drug discovery and toxicity evaluation. Successful hepatocyte differentiation from hPSCs has been described, however, so far described differentiation methods are unable to produce fully functional hepatocytes from hPSCs. The first aim of this thesis work was to evaluate variability in hepatic differentiation capacity of different hPSC lines. The second aim was to elucidate the role of Acitivin/Nodal and Wnt signaling during endoderm differentiation and to study how these signals are affecting on the capability of definitive endoderm (DE) cell to differentiate in hepatocytes and pancreatic cells. The last aim was to study the effect of specific extracellular matrix (ECM) proteins, laminins, and various 3D culture environments on hepatic differentiation from hPSCs. All hESCs and hiPSCs differentiated into hepatocyte like cells (HLC), however, the results revealed transgene reactivation and residual transgene expression in those hiPSC lines which were derived with genome integrating retrovirus-based method. Residual transgene expression hampered the cell differentiation troughout our study. Additionally, reactivation of transgenes increases the risk of tumor formation and thus hinders the clinical use of hiPSC lines generated with genome integrating method. Today, the field has moved essentially into integration free methods, such as Sendai-viral and episomal vector based systems, for hiPSC production. DE cells are precursors for both hepatic and pancreatic cells. DE-cells can be differentiated from hPSCs by activating Activin/Nodal and canonical Wnt signaling pathways. We showed that a short Wnt signaling activation in the beginning of DE differentiation is crucial for proper pancreas differentiation while longer Wnt activation favored hepatocyte differentiation. In addition, we showed that mixed hPSC/DE-cell population could be maintained in long-term cultures by activating Wnt signaling pathway. Mature hepatocytes are not proliferating in the healthy liver while fetal hepatoblasts are constantly dividing. We showed that our lab-made laminin rich ECM, JAR-matrix, is supporting the differentiation of hPSC into hepatic progenitor cells, hepatoblasts. Hence, JAR-matrix could be potential ECM preparation for hepatoblasts expansion. Two of the tested 3D approaches supported hPSC-derived HLCs viability and proliferation. ECM protein rich 3D environment enhanced Albumin secretion and Albumin gene expression in HLCs, whereas HLC aggregates in 3D environment without ECM proteins showed increased expression of metabolic genes. Our findings illustrated the importance of the cell culture environment for cellular identity of HLCs. Taken together, this thesis work provides valuable biological and technical information for the optimization of hepatocyte differentiation from hPSCs

Pulp mill sludges as a solution for reducing the risk of mineral nitrogen leaching from agriculture

Nitrogen (N) from agricultural systems contributes to the eutrophication of waterbodies through leaching. Incorporating organic material with a high carbon-to-nitrogen (C/N) ratio, such as mixed pulp mill sludges (PMSs), into the soil in autumn could reduce the amount of leachable N. This study tested the potential of composted and lime-stabilised mixed PMSs (CPMS and LPMS) in reducing the concentration of mineral N in the soil, and thus the risk of N leaching from arable land in the boreal region using a two-year field experiment. To better understand the mechanisms of the PMSs for influencing mineral N concentration in soil, the impact of PMSs with different quality on the reactions of N in the soil was investigated in a laboratory incubation study. In the field experiment, nitrate-N (NO3--N) concentration was lower with PMSs compared to mineral fertilisation and the control during the first autumn and the following spring after PMS application. The undersowing of Italian ryegrass reduced the NO3--N concentration in the soil during the first autumn. In the incubation experiment, PMSs reduced the soil ammonium-N (NH4+-N) concentration at the beginning of the experiment and the soil NO3--N concentration throughout the experiment compared to a mineral fertiliser treatment and an organic fertiliser. Increased soil respiration in PMS-treated soils indicated increase in microbial activity, and thus immobilisation of soil NO3--N and NH4+-N due to PMSs addition. These results suggest that PMSs have the potential to reduce N leaching from agricultural soils. However, the immobilisation of N must be considered when planning the nutrient requirements of the following crops

A Novel Feeder-Free Culture System for Human Pluripotent Stem Cell Culture and Induced Pluripotent Stem Cell Derivation

Peer reviewe

Intestinal Commitment and Maturation of Human Pluripotent Stem Cells Is Independent of Exogenous FGF4 and R-spondin1

Wnt/beta-catenin signaling plays a central role in guiding the differentiation of the posterior parts of the primitive gut tube into intestinal structures in vivo and some studies suggest that FGF4 is another crucial factor for intestinal development. The aim of this study was to define the effects of Wnt and FGF4 on intestinal commitment in vitro by establishing conditions for differentiation of human pluripotent stem cells (hPSC) into posterior endoderm (hindgut) and further to self-renewing intestinal-like organoids. The most prominent induction of the well-established intestinal marker gene CDX2 was achieved when hPSC-derived definitive endoderm cells were treated with Wnt agonist molecule CHIR99021 during differentiation to hindgut. FGF4 was found to be dispensable during intestinal commitment, but it had an early role in repressing development towards the hepatic lineage. When hindgut stage cells were further cultured in 3D, they formed self-renewing organoid structures containing all major intestinal cell types even without exogenous R-spondin1 (RSPO1), a crucial factor for the culture of epithelial organoids derived from adult intestine. This may be explained by the presence of a mesenchymal compartment in the hPSC-derived organoids. Addition of WNT3A increased the expression of the Paneth cell marker Lysozyme in hPSC-derived organoid cultures, whereas FGF4 inhibited both the formation and maturation of intestinal-like organoids. Similar hindgut and organoid cultures were established from human induced pluripotent stem cells, implying that this approach can be used to create patient-specific intestinal tissue models for disease modeling in vitro.Peer reviewe

Novel Hemizygous IL2RG p.(Pro58Ser) Mutation Impairs IL-2 Receptor Complex Expression on Lymphocytes Causing X-Linked Combined Immunodeficiency

Hypomorphic IL2RG mutations may lead to milder phenotypes than X-SCID, named variably as atypical X-SCID or X-CID. We report an 11-year-old boy with a novel c. 172C>T;p.(Pro58Ser) mutation in IL2RG, presenting with atypical X-SCID phenotype. We also review the growing number of hypomorphic IL2RG mutations causing atypical X-SCID. We studied the patient's clinical phenotype, B, T, NK, and dendritic cell phenotypes, IL2RG and CD25 cell surface expression, and IL-2 target gene expression, STAT tyrosine phosphorylation, PBMC proliferation, and blast formation in response to IL-2 stimulation, as well as protein-protein interactions of the mutated IL2RG by BioID proximity labeling. The patient suffered from recurrent upper and lower respiratory tract infections, bronchiectasis, and reactive arthritis. His total lymphocyte counts have remained normal despite skewed T and B cells subpopulations, with very low numbers of plasmacytoid dendritic cells. Surface expression of IL2RG was reduced on his lymphocytes. This led to impaired STAT tyrosine phosphorylation in response to IL-2 and IL-21, reduced expression of IL-2 target genes in patient CD4+ T cells, and reduced cell proliferation in response to IL-2 stimulation. BioID proximity labeling showed aberrant interactions between mutated IL2RG and ER/Golgi proteins causing mislocalization of the mutated IL2RG to the ER/Golgi interface. In conclusion, IL2RG p.(Pro58Ser) causes X-CID. Failure of IL2RG plasma membrane targeting may lead to atypical X-SCID. We further identified another carrier of this mutation from newborn SCID screening, lost to closer scrutiny.Peer reviewe

Selective MicroRNA-Offset RNA Expression in Human Embryonic Stem Cells

Small RNA molecules, including microRNAs (miRNAs), play critical roles in regulating pluri-potency, proliferation and differentiation of embryonic stem cells. miRNA-offset RNAs (moRNAs) are similar in length to miRNAs, align to miRNA precursor (pre-miRNA) loci and are therefore believed to derive from processing of the pre-miRNA hairpin sequence. Recent next generation sequencing (NGS) studies have reported the presence of moRNAs in human neurons and cancer cells and in several tissues in mouse, including pluripotent stem cells. In order to gain additional knowledge about human moRNAs and their putative development-related expression, we applied NGS of small RNAs in human embryonic stem cells (hESCs) and fibroblasts. We found that certain moRNA isoforms are notably expressed in hESCs from loci coding for stem cell-selective or cancer-related miRNA clusters. In contrast, we observed only sparse moRNAs in fibroblasts. Consistent with earlier findings, most of the observed moRNAs derived from conserved loci and their expression did not appear to correlate with the expression of the adjacent miRNAs. We provide here the first report of moRNAs in hESCs, and their expression profile in comparison to fibroblasts. Moreover, we expand the repertoire of hESC miRNAs. These findings provide an expansion on the known repertoire of small non-coding RNA contents in hESCs.Peer reviewe

Ratkaisuja Suomen ruokastrategiaan. FOOD-ohjelman tietopaketti päättäjille

202

Sähköinen rekrytointi haastaa perinteisemmät rekrytointimenetelmät : Case Rauman kaupunki

Opinnäytetyössä tutkittiin sekä hakijoiden että työnantajien kokemuksia sähköisestä rekrytoinnista. Kohdeorganisaationa tutkimuksessa oli Rauman kaupunki ja sen kesätyöntekijät. Tutkittu sähköinen rekrytointijärjestelmä oli Uranus Konsultointi Oy:n tuottama LAURA -rekrytointijärjestelmä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää miten Rauman kaupungin kesätyöntekijät ja rekrytoijat ovat ottaneet vastaan tämän uuden yleistymässä olevan rekrytointimuodon, sähköisen rekrytoinnin. Tarkoituksena oli myös tulosten perusteella laatia kehittämisehdotuksia LAURA -järjestelmää käyttäville tahoille. Tutkimuksen teoriaosassa käsiteltiin rekrytointiprosessi yleisellä tasolla sekä esiteltiin tarkemmin tavallisimpia rekrytointikanavia. Lisäksi syvennyttiin sähköiseen rekrytointiin sekä sähköisiin rekrytointijärjestelmiin. Empiirisessä osassa tutkimusaineisto kerättiin niin, että Rauman kaupungin kesätyöntekijät vastasivat kvantitatiiviseen kyselyyn. Tämän lisäksi Rauman kaupungin osastojen rekrytoinneista vastaavat henkilöt osallistuivat avoimeen haastattelutilaisuuteen yhtenä ryhmänä. Lisäksi viidelle ulkopuoliselle LAURA-rekrytointijärjestelmää käyttävälle kunnalle lähetettiin sähköpostitse avoin kysely. Tutkimus osoitti, että sähköinen rekrytointi nähdään helppona ja nopeana muotona hakea töitä, mutta se ei kuitenkaan korvaa kokonaan perinteisempiä muotoja. Sähköistä rekrytointia ei vielä koeta täysin luotettavana tapana hakea töitä eikä sähköisen hakulomakkeen nähdä antavan tarpeeksi tilaa hakijan persoonallisuudelle.The thesis examined the experiences of jobseekers and employers in electronic recruiting. The target organisation was the city of Rauma and its summer workers. The examined electronic recruiting system is a system called LAURA which is produced by Uranus Konsultointi Ltd. The aim of the examination was to investigate how the summer workers and the recruiters of the city of Rauma have received the new electronic recruiting form, which has become commonly used. The aim was also to create development proposals based on the results to the people who use LAURA -system. In the theory part of the study the recruiting process was commonly examined and the most ordinary recruiting channels were introduced more closely. In addition, the electronic recruiting and the electronic recruiting systems were examined more extensively. In the empirical study, the material was collected via mostly quantitative questionnaire of the summer workers of Rauma city. Also the workers of Rauma city responsible for the recruitments in different departments were interviewed in a group. Furthermore an open questionnaire was sent to five other municipalities which use LAURA -recruiting system. The study indicates that the electronic recruiting is seen as an easy and a quick way to apply for a job. However, it still does not replace the more ordinary recruiting channels. The electronic recruiting is not experienced completely reliable in applying a job. Furthermore it is considered not to give room for a personality

Isovanhemmat lapsiperheen tukena : katsaus kirjallisuuteen

Opinnäytetyön tarkoituksena oli tehdä kirjallisuuskatsaus aiheesta isovanhemmat lapsiperheen tukena. Työmme tavoitteena oli selvittää, millaisia rooleja isovanhemmilla on lapsenlapsen elämässä ja kuinka isovanhemman läsnäolo vaikuttaa lapsenlapseen. Kirjallisuuskatsauksen avulla haimme vastauksia valitsemiimme tutkimuskysymyksiin. Pyrimme työllämme lisäämään tietoutta hoitoalan ammattilaisille isovanhempi-lapsenlapsi -suhteesta ja isovanhempien osallisuudesta lapsiperheen elämässä, sekä heidän positiivisista vaikutuksista lapsenlapsen kasvuun ja kehitykseen. Opinnäytetyö toteutettiin osana Metropolia Ammattikorkeakoulun ja Vauva Suomi ry:n hanketta. Opinnäytetyö tehtiin kuvailevan kirjallisuuskatsauksena menetelmällä. Tiedonhakuun käytimme useita eri tietokantoja, joista työmme kannalta hyödyllisimmät olivat PubMed, Social Care Online, Volter, Science Direct ja ERIC. Rajasimme aineiston siten, että julkaisuvuodet olivat 2007–2017 ja aineisto oli suomen- tai englanninkielinen. Lisäksi tutkimusartikkeleiden vähäisen löytymisen vuoksi materiaaliksi hyväksyttiin myös yhteenvetoja ja käsikirjoituksia tutkimuksista sekä erinäisiä raportteja. Aineisto analysoitiin sisällönanalyysiä käyttäen. Kirjallisuuskatsauksen tuloksina selvisi, että isovanhempien roolit lapsenlapsen elämässä liittyivät suvun ja perheen identiteetin luomiseen, fyysisen ja konkreettisen sekä henkisen ja sosiaalisen tuen antoon. Isovanhemman läsnäololla on monenlaisia vaikutuksia lapsenlapsen elämään, kuten tämän kognitiiviseen kehitykseen ja käyttäytymiseen sekä henkiseen hyvinvointiin ja sosiaaliseen käyttäytymiseen liittyviä vaikutuksia. Isovanhempien roolia ja heidän läsnäolon vaikutuksia lapsenlapseen tulisi tutkia enemmän, jotta tietoisuus isovanhempien hyödyllisyydestä lapsiperheiden tukena lisääntyisi. Isovanhempien sekä perheiden kannalta olisi edunmukaista, että isovanhempia pystyttäisiin ottamaan enemmän mukaan lastenlasten ja perheiden elämään ja hyödyntämään heidän olemassaoloaan arjen keskellä. Tietoisuuden lisääntyessä hoitohenkilökunta osaisi ottaa paremmin huomioon perhekeskeisen työotteen: kannustaa perheitä ottamaan isovanhempia enemmän perheen arkeen mukaan ja huomioida lapsen hoitotyössä myös isovanhempien osallisuuden.The aim of this thesis was to conduct a literature review about grandparents’ support for families with children. Our objective was to investigate what kind of roles do grandparents have in their grandchildren’s lives and how do their presence impact on their grandchild. We used literature review to answer these research questions. With this thesis we strive to increase the knowledge of healthcare professionals about the grandparent-grandchild –relationship, the impact of grandparents’ involvement in the lives of families with children, and also about the positive influence that they have on their grandchild’s growth and development. This thesis was carried out as part of the Metropolia University of Applied Sciences and Vauva Suomi project. The method of choice for this thesis was a descriptive literature review. We used several different databases to gather information, but the most useful ones were PubMed, Social Care Online, Volter, Science Direct and ERIC. We limited our research material between publishing years of 2007-2017, and used material published only either in Finnish or in English. In addition, because there was only a limited amount of literature found about the topic of interest, we also accepted research summaries, manuscripts and particular scientific reports. Material was analyzed by using content analysis. As a results of the literature review were found that the roles of grandparents in their grandchild’s life were discovered to be connected with the development of the family’s identity, and with fundamental physical, emotional and social support. The presence of a grandparent has many kind of effects in a grandchild’s life. These include impacts on the child’s cognitive development and behavior, and also on their emotional well-being and social behaviour. In order to increase the awareness of grandparents as a support network in the lives of families with children, their role and the effect of the grandparents’ presence in their grandchildren’s lives should be investigated more. It would be beneficial for both sides, families and grandparents, if the grandparents could participate more to the everyday life of their grandchildren and the whole family. Once the knowledge about this topic increases, healthcare professionals can implement a more family-oriented work method, and encourage families to invite grandparents to take part in their daily life and to utilise grandparent’s participation in their childcare