Physiopathologie des malformations du développement cortical associées à des mutations du gène tubuline b3

D une organisation très complexe, le cortex résulte de différents processus coordonnés qui comprennent la neurogenèse, la migration et la différenciation neuronales. L altération d un ou plusieurs de ces processus peut entrainer chez l homme l apparition de malformations du développement cortical (MDC).L identification de mutations chez des patients présentant des MDC dans les gènes DCX et LIS1 codant des protéines s associant directement ou indirectement aux microtubules a montré le rôle primordial du cytosquelette dans le développement cortical. Ce constat fut renforcé par la découverte de mutations dans des gènes codant des sous-unités tubulines elles-mêmes (TUBA1A, TUBB2B et TUBB5), unités structurelles et fonctionnelles des microtubules.Notre étude apporte des contributions à cette observation importante. En effet, nous avons tout d abord identifié l'existence de six mutations faux-sens dans le gène TUBB3, chez douze patients, incluant un cas fœtal. Les mutations ont été trouvées principalement à l'état hétérozygote et peuvent être de novo ou transmises selon un mode autosomique dominant. Tous les patients ont en commun des anomalies complexes du développement du cortex, évocatrices de polymicrogyries frontales ou de désorganisations et simplifications gyrales en combinaison avec des anomalies du corps calleux et de la capsule interne des ganglions de la base ainsi qu'une hypoplasie du pont et du cervelet. La deuxième partie de ce travail s intéresse à l effet de la perte d expression de la tubuline b3 et des mutations responsables de MDC sur les processus de la migration radiaire des neurones pyramidaux par une approche d électroporation in utero chez la souris. L inactivation de Tubb3 entraine un défaut de migration drastique : la majorité des cellules électroporées sont présentes dans la zone sous ventriculaire et la zone intermédiaire. Des explorations montrent une diminution du nombre de cellules multipolaires présentant des processus multiples et bien élongés, et une augmentation du nombre de cellules rondes ne présentant pas ou peu de processus. Ces résultats laissent penser que la diminution de Tubb3 entraine des défauts du contrôle des étapes de multipolarisation et rebipolarisation des neurones pyramidaux lors de la migration radiale. Nous avons également mis en évidence une augmentation de la population de progéniteurs intermédiaires électroporés avec l ARNsh anti-Tubb3. Cette augmentation est accompagnée d une forte diminution de leur division cellulaire. Ce résultat soulève de nombreuses questions sur le rôle potentiel de Tubb3 dans cette population. Enfin, nous avons pu constater que l arrêt de migration observé peut être sauvé par une surexpression du transcrit de TUBB3 alors que les tubulines TUBB1, TUBB2B et TUBB4A sont dans l incapacité de restaurer pleinement la migration radiaire des neurones sous exprimant Tubb3. Ces observations tendent à étayer l hypothèse selon laquelle les sous unités tubulines possèdent des spécificités fonctionnelles.Dans l ensemble, nos travaux montrent donc que des mutations de TUBB3 sont liées à des formes de MDC et que Tubb3 joue un rôle important dans la migration des neurones pyramidaux chez la souris, notamment par le contrôle des changements morphologiques qui interviennent dans la phase multipolaire. Enfin, nous apportons une nouvelle proposition d interdépendance entre l arrêt de migration neuronale et la division des progéniteurs neuronaux dans le développement cortical.Over the last years, the critical role of the cytoskeletal network in the proper cortical development has been established. The importance of microtubules was further emphasized with the association of mutations in gene encoding for alpha-tubulin (TUBA1A, TUBA8), beta-tubulin (TUBB2B) in malformations of cortical development (MCD) including lissencephalies and polymicrogyria (Keays 2007, Poirier 2007, Jaglin 2009, Abdollahi 2009) and TUBB5 in microcephaly with cortical gyration abnormalities. We report the implication of TUBB3 missense mutations in polymicrogyria and cortical simplifications in 6 different families including a foetal case harboring a severe micerolissencephaly.We investigated the properties of MT network in patients' fibroblasts and revealed that MCD-related mutations can alter the resistance of microtubules to depolymerisation. These results led us to hypothesise that either microtubule dynamics or their interactions with various MT interacting proteins could be differently affected by TUBB3 variations, thus resulting in distinct alteration of downstream processes and therefore explaining the phenotypic diversity of the TUBB3-related spectrum. In a second time, we investigate further the association between TUBB3 mutations and MCDs by analyzing the consequences of Tubb3 knockdown on cortical development in mice. Using the in utero electroporation approach, we demonstrate that Tubb3 knockdown leads to delayed bipolar morphology and radial migration with evidence suggesting that the neuronal arrest is a transient phenomenon overcome after birth. Silenced blocked cells display a round shape and decreased number of processes and a delay in the acquisition of the bipolar morphology. Also, more Tbr2 positive cells are observed, although less cells express the proliferation marker Ki67, suggesting that Tubb3 inactivation might have an indirect effect on intermediate progenitor proliferation. Furthermore, we show by rescue experiments the non interchangeability of other beta-tubulins which are unable to rescue the phenotype. Our study highlights the critical and specific role of Tubb3 on the stereotyped morphological changes and polarization processes that are required for initiating radial migration to the cortical plate.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

De novo TUBB2B mutation causes fetal akinesia deformation sequence with microlissencephaly: an unusual presentation of tubulinopathy

International audienceTubulinopathies are increasingly emerging major causes underlying complex cerebral malformations, particularly in case of microlissencephaly often associated with hypoplastic or absent corticospinal tracts. Fetal akinesia deformation sequence (FADS) refers to a clinically and genetically heterogeneous group of disorders with congenital malformations related to impaired fetal movement. We report on an early foetal case with FADS and microlissencephaly due to TUBB2B mutation. Neuropathological examination disclosed virtually absent cortical lamination, foci of neuronal overmigration into the leptomeningeal spaces, corpus callosum agenesis, cerebellar and brainstem hypoplasia and extremely severe hypoplasia of the spinal cord with no anterior and posterior horns and almost no motoneurons. At the cellular level, the p.Cys239Phe TUBB2B mutant leads to tubulin heterodimerization impairment, decreased ability to incorporate into the cytoskeleton, microtubule dynamics alteration, with an accelerated rate of depolymerization. To our knowledge, this is the first case of microlissencephaly to be reported presenting with a so severe and early form of FADS, highlighting the importance of tubulin mutation screening in the context of FADS with microlissencephaly

Mutations in TUBG1, DYNC1H1, KIF5C and KIF2A cause malformations of cortical development and microcephaly.

International audienceThe genetic causes of malformations of cortical development (MCD) remain largely unknown. Here we report the discovery of multiple pathogenic missense mutations in TUBG1, DYNC1H1 and KIF2A, as well as a single germline mosaic mutation in KIF5C, in subjects with MCD. We found a frequent recurrence of mutations in DYNC1H1, implying that this gene is a major locus for unexplained MCD. We further show that the mutations in KIF5C, KIF2A and DYNC1H1 affect ATP hydrolysis, productive protein folding and microtubule binding, respectively. In addition, we show that suppression of mouse Tubg1 expression in vivo interferes with proper neuronal migration, whereas expression of altered γ-tubulin proteins in Saccharomyces cerevisiae disrupts normal microtubule behavior. Our data reinforce the importance of centrosomal and microtubule-related proteins in cortical development and strongly suggest that microtubule-dependent mitotic and postmitotic processes are major contributors to the pathogenesis of MCD

Physiopathologie des malformations du développement cortical associées à des mutations du gène tubuline β3

Over the last years, the critical role of the cytoskeletal network in the proper cortical development has been established. The importance of microtubules was further emphasized with the association of mutations in gene encoding for alpha-tubulin (TUBA1A, TUBA8), beta-tubulin (TUBB2B) in malformations of cortical development (MCD) including lissencephalies and polymicrogyria (Keays 2007, Poirier 2007, Jaglin 2009, Abdollahi 2009) and TUBB5 in microcephaly with cortical gyration abnormalities. We report the implication of TUBB3 missense mutations in polymicrogyria and cortical simplifications in 6 different families including a foetal case harboring a severe micerolissencephaly.We investigated the properties of MT network in patients' fibroblasts and revealed that MCD-related mutations can alter the resistance of microtubules to depolymerisation. These results led us to hypothesise that either microtubule dynamics or their interactions with various MT interacting proteins could be differently affected by TUBB3 variations, thus resulting in distinct alteration of downstream processes and therefore explaining the phenotypic diversity of the TUBB3-related spectrum. In a second time, we investigate further the association between TUBB3 mutations and MCDs by analyzing the consequences of Tubb3 knockdown on cortical development in mice. Using the in utero electroporation approach, we demonstrate that Tubb3 knockdown leads to delayed bipolar morphology and radial migration with evidence suggesting that the neuronal arrest is a transient phenomenon overcome after birth. Silenced blocked cells display a round shape and decreased number of processes and a delay in the acquisition of the bipolar morphology. Also, more Tbr2 positive cells are observed, although less cells express the proliferation marker Ki67, suggesting that Tubb3 inactivation might have an indirect effect on intermediate progenitor proliferation. Furthermore, we show by rescue experiments the non interchangeability of other beta-tubulins which are unable to rescue the phenotype. Our study highlights the critical and specific role of Tubb3 on the stereotyped morphological changes and polarization processes that are required for initiating radial migration to the cortical plate.D’une organisation très complexe, le cortex résulte de différents processus coordonnés qui comprennent la neurogenèse, la migration et la différenciation neuronales. L’altération d’un ou plusieurs de ces processus peut entrainer chez l’homme l’apparition de malformations du développement cortical (MDC).L’identification de mutations chez des patients présentant des MDC dans les gènes DCX et LIS1 codant des protéines s’associant directement ou indirectement aux microtubules a montré le rôle primordial du cytosquelette dans le développement cortical. Ce constat fut renforcé par la découverte de mutations dans des gènes codant des sous-unités tubulines elles-mêmes (TUBA1A, TUBB2B et TUBB5), unités structurelles et fonctionnelles des microtubules.Notre étude apporte des contributions à cette observation importante. En effet, nous avons tout d’abord identifié l'existence de six mutations faux-sens dans le gène TUBB3, chez douze patients, incluant un cas fœtal. Les mutations ont été trouvées principalement à l'état hétérozygote et peuvent être de novo ou transmises selon un mode autosomique dominant. Tous les patients ont en commun des anomalies complexes du développement du cortex, évocatrices de polymicrogyries frontales ou de désorganisations et simplifications gyrales en combinaison avec des anomalies du corps calleux et de la capsule interne des ganglions de la base ainsi qu'une hypoplasie du pont et du cervelet. La deuxième partie de ce travail s’intéresse à l’effet de la perte d’expression de la tubuline β3 et des mutations responsables de MDC sur les processus de la migration radiaire des neurones pyramidaux par une approche d’électroporation in utero chez la souris. L’inactivation de Tubb3 entraine un défaut de migration drastique : la majorité des cellules électroporées sont présentes dans la zone sous ventriculaire et la zone intermédiaire. Des explorations montrent une diminution du nombre de cellules multipolaires présentant des processus multiples et bien élongés, et une augmentation du nombre de cellules rondes ne présentant pas ou peu de processus. Ces résultats laissent penser que la diminution de Tubb3 entraine des défauts du contrôle des étapes de multipolarisation et rebipolarisation des neurones pyramidaux lors de la migration radiale. Nous avons également mis en évidence une augmentation de la population de progéniteurs intermédiaires électroporés avec l’ARNsh anti-Tubb3. Cette augmentation est accompagnée d’une forte diminution de leur division cellulaire. Ce résultat soulève de nombreuses questions sur le rôle potentiel de Tubb3 dans cette population. Enfin, nous avons pu constater que l’arrêt de migration observé peut être sauvé par une surexpression du transcrit de TUBB3 alors que les tubulines TUBB1, TUBB2B et TUBB4A sont dans l’incapacité de restaurer pleinement la migration radiaire des neurones sous exprimant Tubb3. Ces observations tendent à étayer l’hypothèse selon laquelle les sous unités tubulines possèdent des spécificités fonctionnelles.Dans l’ensemble, nos travaux montrent donc que des mutations de TUBB3 sont liées à des formes de MDC et que Tubb3 joue un rôle important dans la migration des neurones pyramidaux chez la souris, notamment par le contrôle des changements morphologiques qui interviennent dans la phase multipolaire. Enfin, nous apportons une nouvelle proposition d’interdépendance entre l’arrêt de migration neuronale et la division des progéniteurs neuronaux dans le développement cortical

Physiopathologic exploration of malformation of cortical development due to mutation in TUBB3

D’une organisation très complexe, le cortex résulte de différents processus coordonnés qui comprennent la neurogenèse, la migration et la différenciation neuronales. L’altération d’un ou plusieurs de ces processus peut entrainer chez l’homme l’apparition de malformations du développement cortical (MDC).L’identification de mutations chez des patients présentant des MDC dans les gènes DCX et LIS1 codant des protéines s’associant directement ou indirectement aux microtubules a montré le rôle primordial du cytosquelette dans le développement cortical. Ce constat fut renforcé par la découverte de mutations dans des gènes codant des sous-unités tubulines elles-mêmes (TUBA1A, TUBB2B et TUBB5), unités structurelles et fonctionnelles des microtubules.Notre étude apporte des contributions à cette observation importante. En effet, nous avons tout d’abord identifié l'existence de six mutations faux-sens dans le gène TUBB3, chez douze patients, incluant un cas fœtal. Les mutations ont été trouvées principalement à l'état hétérozygote et peuvent être de novo ou transmises selon un mode autosomique dominant. Tous les patients ont en commun des anomalies complexes du développement du cortex, évocatrices de polymicrogyries frontales ou de désorganisations et simplifications gyrales en combinaison avec des anomalies du corps calleux et de la capsule interne des ganglions de la base ainsi qu'une hypoplasie du pont et du cervelet. La deuxième partie de ce travail s’intéresse à l’effet de la perte d’expression de la tubuline β3 et des mutations responsables de MDC sur les processus de la migration radiaire des neurones pyramidaux par une approche d’électroporation in utero chez la souris. L’inactivation de Tubb3 entraine un défaut de migration drastique : la majorité des cellules électroporées sont présentes dans la zone sous ventriculaire et la zone intermédiaire. Des explorations montrent une diminution du nombre de cellules multipolaires présentant des processus multiples et bien élongés, et une augmentation du nombre de cellules rondes ne présentant pas ou peu de processus. Ces résultats laissent penser que la diminution de Tubb3 entraine des défauts du contrôle des étapes de multipolarisation et rebipolarisation des neurones pyramidaux lors de la migration radiale. Nous avons également mis en évidence une augmentation de la population de progéniteurs intermédiaires électroporés avec l’ARNsh anti-Tubb3. Cette augmentation est accompagnée d’une forte diminution de leur division cellulaire. Ce résultat soulève de nombreuses questions sur le rôle potentiel de Tubb3 dans cette population. Enfin, nous avons pu constater que l’arrêt de migration observé peut être sauvé par une surexpression du transcrit de TUBB3 alors que les tubulines TUBB1, TUBB2B et TUBB4A sont dans l’incapacité de restaurer pleinement la migration radiaire des neurones sous exprimant Tubb3. Ces observations tendent à étayer l’hypothèse selon laquelle les sous unités tubulines possèdent des spécificités fonctionnelles.Dans l’ensemble, nos travaux montrent donc que des mutations de TUBB3 sont liées à des formes de MDC et que Tubb3 joue un rôle important dans la migration des neurones pyramidaux chez la souris, notamment par le contrôle des changements morphologiques qui interviennent dans la phase multipolaire. Enfin, nous apportons une nouvelle proposition d’interdépendance entre l’arrêt de migration neuronale et la division des progéniteurs neuronaux dans le développement cortical.Over the last years, the critical role of the cytoskeletal network in the proper cortical development has been established. The importance of microtubules was further emphasized with the association of mutations in gene encoding for alpha-tubulin (TUBA1A, TUBA8), beta-tubulin (TUBB2B) in malformations of cortical development (MCD) including lissencephalies and polymicrogyria (Keays 2007, Poirier 2007, Jaglin 2009, Abdollahi 2009) and TUBB5 in microcephaly with cortical gyration abnormalities. We report the implication of TUBB3 missense mutations in polymicrogyria and cortical simplifications in 6 different families including a foetal case harboring a severe micerolissencephaly.We investigated the properties of MT network in patients' fibroblasts and revealed that MCD-related mutations can alter the resistance of microtubules to depolymerisation. These results led us to hypothesise that either microtubule dynamics or their interactions with various MT interacting proteins could be differently affected by TUBB3 variations, thus resulting in distinct alteration of downstream processes and therefore explaining the phenotypic diversity of the TUBB3-related spectrum. In a second time, we investigate further the association between TUBB3 mutations and MCDs by analyzing the consequences of Tubb3 knockdown on cortical development in mice. Using the in utero electroporation approach, we demonstrate that Tubb3 knockdown leads to delayed bipolar morphology and radial migration with evidence suggesting that the neuronal arrest is a transient phenomenon overcome after birth. Silenced blocked cells display a round shape and decreased number of processes and a delay in the acquisition of the bipolar morphology. Also, more Tbr2 positive cells are observed, although less cells express the proliferation marker Ki67, suggesting that Tubb3 inactivation might have an indirect effect on intermediate progenitor proliferation. Furthermore, we show by rescue experiments the non interchangeability of other beta-tubulins which are unable to rescue the phenotype. Our study highlights the critical and specific role of Tubb3 on the stereotyped morphological changes and polarization processes that are required for initiating radial migration to the cortical plate

Single-cell transcriptomics of the early developing mouse cerebral cortex disentangles the spatial and temporal components of neuronal fate acquisition

In the developing cerebral cortex, how progenitors that seemingly display limited diversity end up in producing a vast array of neurons remains a puzzling question. The prevailing model that recently emerged suggests that temporal maturation of these progenitors is a key driver in the diversification of the neuronal output. However, temporal constrains are unlikely to account for all diversity across cortical regions, especially in the ventral and lateral domains where neuronal types significantly differ from their dorsal neocortical counterparts born at the same time. In this study, we implemented single-cell RNAseq to sample the diversity of progenitors and neurons along the dorso-ventral axis of the early developing pallium. We first identified neuronal types, mapped them on the tissue and performed genetic tracing to determine their origin. By characterising progenitor diversity, we disentangled the gene expression modules underlying temporal vs spatial regulations of neuronal specification. Finally, we reconstructed the developmental trajectories followed by ventral and dorsal pallial neurons to identify gene waves specific of each lineage. Our data suggest a model by which discrete neuronal fate acquisition from a continuous gradient of progenitors results from the superimposition of spatial information and temporal maturation

A novel frame shift mutation in the PQBP1 gene identified in a Tunisian family with X-linked mental retardation

International audienc

The intellectual disability protein Oligophrenin1 controls astrocyte morphology and migration: Structural and migratory alterations in astrocytes deficient for OPHN1 via the ROCK pathway

International audienceAstrocytes are involved in several aspects of neuronal development and properties which are altered in intellectual disability (ID). Oligophrenin-1 is a RhoGAP protein implicated in actin cytoskeleton regulation, and whose mutations are associated with X-linked ID. Oligophrenin-1 is expressed in neurons, where its functions have been widely reported at the synapse, as well as in glial cells. However, its roles in astrocytes are still largely unexplored. Using in vitro and in vivo models of oligophrenin1 disruption in astrocytes, we found that oligophrenin1 regulates at the molecular level the RhoA/ROCK/MLC2 pathway in astroglial cells. We also showed at the cellular level that oligophrenin1 modulates astrocyte morphology and migration both in vitro and in vivo, and is involved in glial scar formation. Altogether, these data suggest that oligophrenin1 deficiency alters not only neuronal but also astrocytic functions, which might contribute to the development of ID

Neuropathological phenotype of a distinct form of lissencephaly associated with mutations in TUBA1A

International audienceLissencephalies are congenital malformations responsible for epilepsy and mental retardation in children. A number of distinct lissencephaly syndromes have been characterized, according to the aspect and the topography of the cortical malformation, the involvement of other cerebral structures and the identified genetic defect. A mutation in TUBA1A, coding for alpha 1 tubulin, was recently identified in a mutant mouse associated with a behavioural disorder and a disturbance of the laminar cytoarchitectony of the isocortex and the hippocampus. Mutations of TUBA1A were subsequently found in children with mental retardation and brain malformations showing a wide spectrum of severities. Here we describe four fetuses with TUBA1A mutations and a prenatal diagnosis of major cerebral dysgeneses leading to a termination of pregnancy due to the severity of the prognosis. The study of these fetuses at 23, 25, 26 and 35 gestational weeks shows that mutations of TUBA1A are associated with a neuropathological phenotypic spectrum which consistently encompasses five brain structures, including the neocortex, hippocampus, corpus callosum, cerebellum and brainstem. Less constantly, abnormalities were also identified in basal ganglia, olfactory bulbs and germinal zones. At the microscopical level, migration abnormalities are suggested by abnormal cortical and hippocampal lamination, and heterotopic neurons in the cortex, cerebellum and brainstem. There are also numerous neuronal differentiation defects, such as the presence of immature, randomly oriented neurons and abnormal axon tracts and fascicles. Thus, the TUBA1A phenotype is distinct from LIS1, DCX, RELN and ARX lissencephalies. Compared with the phenotypes of children mutated for TUBA1A, these prenatally diagnosed fetal cases occur at the severe end of the TUBA1A lissencephaly spectrum. This study emphasizes the importance of neuropathological examinations in cases of lissencephaly for improving our knowledge of the distinct pathogenetic and pathophysiological mechanisms

Branching and nucleokinesis defects in migrating interneurons derived from doublecortin knockout mice

International audienceType I lissencephaly results from mutations in the doublecortin (DCX) and LIS1 genes. We generated Dcx knockout mice to further understand the pathophysiological mechanisms associated with this cortical malformation. Dcx is expressed in migrating interneurons in developing human and mouse brains. Video microscopy analyses of such tangentially migrating neuron populations derived from the medial ganglionic eminence show defects in migratory dynamics. Specifically, the formation and division of growth cones, leading to the production of new branches, are more frequent in knockout cells, although branches are less stable. Dcx-deficient cells thus migrate in a disorganized manner, extending and retracting short branches and making less long-distant movements of the nucleus. Despite these differences, migratory speeds and distances remain similar to wild-type cells. These novel data thus highlight a role for Dcx, a microtubule-associated protein enriched at the leading edge in the branching and nucleokinesis of migrating interneurons