Identification of a novel human polyomavirus in organs of the gastrointestinal tract

Peer reviewedPublisher PD

Untersuchungen zur genetischen und serologischen Prävalenz eines neuen humanen Polyomavirus

Polyomaviren sind weltweit verbreitet und wurden bei einer Vielzahl von Tierarten sowie beim Men-schen nachgewiesen. Durch Anwendung der PCR und anderer Nukleinsäure-basierter Nachweisverfah-ren wurden bis heute neun humane Polyomaviren identifiziert. Diese Entdeckung neuer humaner Polyomaviren, insbesondere in den letzten Jahren, wirft die Frage nach den Auswirkungen von Polyomavirus-Infektionen beim Menschen auf. Im Februar 2011 wurde am Robert-Koch-Institut in der Arbeitsgruppe von Dr. Bernhard Ehlers ein neu-es humanes Polyomavirus entdeckt, welches die vorläufige, bisher unpublizierte Bezeichnung „Huma-nes Polyomavirus 10 (HPyV10)“ erhielt. Das gesamte Genom des Virus wurde bereits vollständig sequenziert und der VP1-kodierende Leserahmen identifiziert. Derzeit liegen noch keine Informationen über ein pathogenes Potential dieses Virus vor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Seroepidemiologie des HPyV10 untersucht. Hierzu wur-den Seren von gesunden erwachsenen Blutspendern und Kindern auf das Vorhandensein von spezifi-schen IgG mit Reaktivität gegen HPyV10 getestet. Positive Befunde wurden als Hinweis auf eine durchgemachte oder bestehende Infektion gewertet. Desweiteren wurden DNA-Extrakte aus humanen Organen auf die Präsenz von Nukleinsäuren des HPyV10 untersucht. Zur Untersuchung der Seroepidemiologie des HPyV10 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA entwi-ckelt, welcher gegen das VP1-Kapsidprotein des HPyV10 gerichtete IgG im Humanserum detektiert. Als Positiv- bzw. Negativkontrolle im ELISA wurden das VP1-Protein des humanen BK-Polyomavirus (BKPyV) und des aviären Budgerigar Fledgling Disease Virus (BFDPyV) mitgeführt. Die Häufigkeit der Seroreaktivität gegen HPyV10-VP1 bei gesunden Blutspendern (n=297) ergab eine Prävalenz von 23,6%. Die höchste Seroprävalenz mit 33% sowie die höchste Seroreaktivität gegen HPyV10 mit OD450=0,4 (durchschnittliche Seroreaktivität: OD450=0,21) wurden in der Altersklasse der 51 bis 60-Jährigen nachgewiesen. In 17,2% der untersuchten Kinderseren (n=99) wurden ebenfalls IgG mit Spezi-fität gegen HPyV10 detektiert. Diese Ergebnisse zeigen einerseits, dass die Infektion mit HPyV10 schon im Kindesalter erfolgt und andererseits, dass auch gesunde Erwachsene infiziert sind – ähnlich wie bei den bereits bekannten humanen Polyomaviren. Eine Geschlechtspräferenz für HPyV10-Infektionen konnte nicht festgestellt werden. Für den Nachweis von Genomkopien des HPyV10 wurde eine spezifische RT-PCR entwickelt, welche die Amplifikation von 139 bp-großen Produkten des Virus und deren Quantifizierung bis zu einer Kopienzahl von n=5 ermöglicht. Nach Optimierung der Parameter, welche Einfluss auf die Signalintensität nehmen, wurde eine Primerkonzentration von 400 nM, eine Sondenkonzentration von 150 nM, eine MgCl2-Konzentration von 6 mM und einer Annealingtemperatur von 59°C für die Amplifikation der HPyV10-DNA verwendet. Im Anschluss wurden mit dieser RT-PCR Leber- (n=80), Lymphknoten- (n=19) und Milzproben (n=11) von Organtransplantierten und Tumorpatienten getestet. Fünf der Leberproben waren bereits durch die frühere Anwendung konventioneller PCR-Techniken als HPyV10-positiv charakterisiert worden. Mit der hochsensitiven RT-PCR konnten in diesen fünf Proben sowie in acht zusätzlichen Leberproben zwi-schen bis zu 133 Genomkopien des HPyV10 detektiert werden. In den Lymphknoten- und Milzproben war der Nachweis negativ. In den vorliegenden Untersuchungen wurde gefunden, dass gesunde Blutspender eine Seroreaktivität gegen HPyV10 besitzen. Gegenstand weiterer Forschung könnte nun sein, Seren immungeschwächter Personen auf die Häufigkeit und Stärke spezifischer serologischer Reaktionen gegen HPyV10 zu unter-suchen und damit Hinweise auf eine mögliche Pathogenität des Virus zu erhalten. Außerdem könnten zukünftig weitere ausgewählte Patientengruppen mit Hilfe der RT-PCR auf Präsenz des HPyV10 getes-tet werden, um Hinweise auf einen möglichen Krankheitswert zu erhalten. Falls dem HPyV10 pathoge-ne Eigenschaften zugeordnet werden können, wird die weitere Charakterisierung des HPyV10 ein Mei-lenstein auf dem Weg zur Entwicklung einer gezielten Infektionsprophylaxe und Therapie sein

Antigen delivery via hydrophilic PEG-b-PAGE-b-PLGA nanoparticles boosts vaccination induced T cell immunity.

Here, we evaluate the use of hydrophilic PEG-b-PAGE-b-PLGA (PPP) for the preparation of antigen loaded nanoparticles (NPs) as a platform for prophylactic vaccination. To investigate the suitability of PPP-NPs for antigen delivery, we used the double emulsion evaporation technique to prepare NPs of different sizes, antigen-loading efficiencies and -release kinetics for the model antigen Ovalbumin (OVA). Prior to applying the PPP-NPs in biological in vitro or in vivo models, all materials were tested for absence of cytotoxicity and endotoxins. While the uptake of NPs in antigen presenting cells was size but not polymer dependent, the efficiency of cross presentation of NP-associated antigen on MHC I molecules for CD8 T cell activation depended on the polymer type. T cell activation by antigen-presenting cells was significantly increased in vitro if antigen was delivered via PPP NPs compared to PLGA NPs or soluble OVA, although antigen content was the same in all tested formulations. Subcutaneous application of PPP-OVA-NPs even without adjuvants led to generation of potent CD8 T cell-mediated OVA-specific cytotoxicity in vivo that was more pronounced than after application of OVA alone or PLGA-OVA-NPs. Our data suggest that PPP-NPs can serve as platform for antigen-delivery in future vaccination formulations. Although PPP-NPs already bear intrinsic adjuvant-function, the complementation with TLR ligands loaded inside NPs may further strengthen the immune response to a point, where it might be possible to use it as a therapeutic vaccine to break immune tolerance in chronic disease states

Modifizierbare Nanopartikel für die lokale Abgabe von Proteinwirkstoffen für eine verbesserte Impfung

The oral route of vaccination is besides nasal, vaginal or rectal route, one of the most interesting mucosal vaccination routes. Usually a vaccine as live but attenuated, inactivated or even dead pathogen is administered subcutaneously or intramuscularly via injection, to develop immunity to a pathogen. Alternatively, also purified proteins can be used for vaccination. The aim of oral or mucosal vaccination is to achieve a cheap and save mass immunization, with avoidance of needle based systems, no need of clinical environment and lower production cost. Disadvantages that have to be overcome are potential degradation of the vaccine and probably inefficient uptake through the intestinal wall, resulting in low immune responses. The present work evaluates the protection of a protein based vaccine by nanoparticles and delivery through the gastrointestinal tract as a perspective for oral vaccination. The results presented in this thesis show a successful encapsulation and therefore protection of the model protein ovalbumin with the basic polymer poly(D,L-lactide-co-glycolide acid) (PLGA) and further developed PLGA derivatives. These derivatives were found to increase the protein encapsulation up to 50% and release of the protein from nanoparticles from 50 to 100% compared to pure PLGA particles. Furthermore, the polymers introduce passive and active drug targeting properties to PLGA. In in vitro and also in vivo mice studies an improved efficiency of vaccination could be proven. This was shown by a significant increased T cell activation, with higher interleukin 2 production. Furthermore, a new and reproducible method for a size-adjustable production of nanoparticles was investigated to study a size-dependent uptake of NPs during vaccination. This technology is a semi-automated system for an operator independent, scalable and size adjustable NP synthesis. By varying certain process parameters the system is able to produce nanoparticles in a size range of 150 to 600 nm with a narrow size distribution.Die orale Vakzinierungsroute ist neben der nasalen, vaginalen oder rektalen Route, eine der interessantesten, mukosalen Vakzinierungsrouten. In der Regel wird ein Vakzin lebend, aber abgeschwächt, inaktiviert oder abgetötet subkutan oder intramuskulär verabreicht, um eine Immunität gegen einen Krankheitserreger zu entwickeln. Alternativ können auch gereinigte Proteine für eine Vakzinierung verwendet werden. Das Ziel der oralen, beziehungsweise mukosalen Vakzinierung, ist das Erreichen einer kostengünstigen und sicheren Massenvakzinierung, unter Vermeidung von Nadel basierten Systemen und ohne Notwendigkeit einer klinischen Umgebung. Nachteile, die überwunden werden müssen, sind der potenzielle Abbau des Vakzins und ineffiziente Aufnahme durch die Darmwand, mit daraus resultierenden niedrigen Immunantworten. Die vorliegende Arbeit bewertet den Schutz eines Vakzins durch Nanopartikel (NP) und Transport durch den Gastrointestinaltrakt als Perspektive für die orale Vakzinierung. Die Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche Verkapselung und damit Schutz des Modellproteins Ovalbumin mit dem Polymer Polylactid-co-Glycolid (PLGA) und weiteren PLGA-Derivaten. Für diese Derivate wurde eine erhöhte Proteinverkapselung von bis zu 50% und eine erhöhte Freisetzungs-rate aus den NP von bis zu 50 bis 100% im Vergleich zu reinen PLGA-Teilchen gefunden. Weiterhin werden mit diesen Polymeren passive und aktive Drug-Targeting-Eigenschaften in das Polymer PLGA eingeführt. In vitro, als auch in vivo-Studien an Mäusen konnten eine verbesserte Effizienz der Vakzinierung nachweisen. Dies wurde durch eine signifikant höhere T-Zell-Aktivierung, mit einer gesteigerten Interleukin 2-Produktion gezeigt. Außerdem wurde ein neues und reproduzierbares Verfahren für die Herstellung von NP unterschiedlicher Größe untersucht, um eine größenabhängige Aufnahme von NP während der Vakzinierung zu untersuchen. Diese Technologie ist ein halbautomatisches System für eine Bediener-unabhängige, skalierbare und NP-Synthese mit einstellbarer Größe. Durch das Variieren bestimmter Verfahrensparameter konnte gezeigt werden, dass das System in der Lage ist, NP in einem Größenbereich von 150 bis 600 nm mit einer engen Größenverteilung herzustellen

Semi-automated nanoprecipitation-system--an option for operator independent, scalable and size adjustable nanoparticle synthesis.

The preparation of nano-sized carrier systems increasingly moved into focus of pharmaceutical research and industry in the past decades. Besides the drug load and properties of the selected polymer/lipid, the size of such particles is one of the most important parameters regarding their use as efficient drug delivery systems. However, the preparation of nanoparticles with different sizes in a controlled manner is challenging, especially in terms of reproducibility and scale-up possibility. To overcome these hurdles we developed a system relying on nanoprecipitation, which meets all these requirements of an operator independent, scalable and size-adjustable nanoparticle synthesis-the Semi-Automated Nanoprecipitation-System. This system enables the adaption of the particle size to specific needs based on the process parameters-injection rate, flow rate and polymer concentration-identified within this study. The basic set-up is composed of a syringe pump and a gear pump for a precise control of the flow and injection speed of the system. Furthermore, a home-made tube-straightener guarantees a curvature-free injection point. Thus it could be shown that the production of poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles from 150 to 600 nm with a narrow size distribution in a controlled semi-automatic manner is possible

Development of an advanced primary human in vitro model of the small intestine

Intestinal in vitro models are valuable tools in drug discovery and infection research. Despite several advantages, the standard cell line-based Transwell® models based for example on colonic epithelial Caco-2 cells, lack the cellular complexity and transport activity associated with native small intestinal tissue. An additional experimental set-back arises from the most commonly used synthetic membranes, on which the cells are routinely cultured. These can lead to an additional barrier activity during in vitro testing. To overcome these limitations, we developed an alternative primary human small intestinal tissue model. This novel approach combines previously established gut organoid technology with a natural extracellular matrix (ECM) based on porcine small intestinal scaffold (SIS). Intestinal crypts from healthy human small intestine were expanded as gut organoids and seeded as single cells on SIS in a standardized Transwell-like setting. After only 7 days on the ECM scaffold, the primary cells formed an epithelial barrier while a subpopulation differentiated into intestinal specific cell types such as mucus-producing goblet cells or hormone-secreting enteroendocrine cells. Furthermore, we tested the influence of subepithelial fibroblasts and dynamic culture conditions on epithelial barrier function. The barrier integrity was stabilized by coculture in the presence of gut-derived fibroblasts. Compared to static or dynamic culture on an orbital shaker, dynamic culture in a defined perfusion bioreactor had an additional significant impact on epithelial cell differentiation, indicated by high prismatic cell morphology and upregulation of CYP3A4 enzyme and Mdr1 transporter activity. In summary, more physiological tissue models as presented in our study might be useful tools in preclinical research and development

Impact of PEG and PEG-b-PAGE modified PLGA on nanoparticle formation, protein loading and release.

The effect of modifying the well-established pharmaceutical polymer PLGA by different PEG-containing block-copolymers on the preparation of ovalbumin (OVA) loaded PLGA nanoparticles (NPs) was studied. The used polymers contained poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polyethylene glycol (PEG) and poly(allyl glycidyl ether) (PAGE) as building blocks. The double emulsion technique yielded spherical NPs in the size range from 170 to 220nm (PDI<0.15) for all the differently modified polymers, allowing to directly compare protein loading of and release. PEGylation is usually believed to increase the hydrophilic character of produced particles, favoring encapsulation of hydrophilic substances. However, in this study simple PEGylation of PLGA had only a slight effect on protein release. In contrast, incorporating a PAGE block between the PEG and PLGA units, also eventually enabling active targeting introducing a reactive group, led to a significantly higher loading (+25%) and release rate (+100%), compared to PLGA and PEG-b-PLGA NPs