Estratégia de segurança marítima europeia : porquê e para quê? / Alexandre Reis Rodrigues

O artigo elenca os aspetos que caraterizam o contexto da segurança marítima e que determinam e justificam o desenvolvimento de uma estratégia de segurança marítima europeia. O autor analisa os interesses europeus a defender no espaço marítimo, próximo ou distante, com base na presença de fluxos de tráfego comercial por via marítima, vitais ao desenvolvimento e sustentabilidade da economia europeia, reflete sobre a criação de um espaço militar de defesa e sobre o papel da União Europeia enquanto ator global. Conclui com um exame da cooperação entre a UE e a NATO, e o papel que esta ocupará na estratégia marítima europeia

Caracterização química do grão de ervilha proteaginosa

Seminário realizado na Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Castelo Branco, no âmbito do Projecto 0186_AGROCELE_3_EO objectivo deste trabalho foi determinar a matéria seca (MS), cinzas, matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB), gordura bruta (GB), açúcares totais, amidos e estimar, a partir da composição química, a EM ruminantes, EM suínos, EM aves, ED coelhos e ED cavalos de cada uma de 10 cultivares mais produtivas obtidas num ensaio com 20 cultivares de ervilha proteaginosa (Pisum sativum) realizado na ESACB (Novembro de 2009 a Junho de 2010) (Projecto 0186_AGROCELE_3_E). As análises químicas foram realizadas no Laboratório de Nutrição e Alimentação Animal da ESACB. Para cada cultivar obtiveram-se 4 resultados que foram tratados estatisticamente (média, desvio padrão, ANOVA, teste Duncan). Os resultados obtidos (% na MS) permitem-nos afirmar o seguinte: as 10 variedades de ervilha proteaginosa estudadas constituem importante fonte de energia disponível (glúcidos citoplásmicos) com elevadas percentagens de açúcares solúveis (7,95% ISARD a 9,42% ENDURO) (P0,05), EM suínos (13,57 MJ/kg MS CORRENT a 14,71 MJ/kg MS ALHAMBRA) (P>0,05); EM aves (11,96 MJ/kg MS ENDURO a 12,45 MJ/kg MS AUDIT) (P>0,05), ED cavalos (13,73 MJ/kg MS CORRENT a 14,37 MJ/kg MS ALHAMBRA) (P>0,05) nas diferentes cultivares e apresentam ligeiras diferenças na ED coelho (12,99 MJ/kg MS CORRENT a 13,03 MJ/kg MS ALHAMBRA) (P<0,05). Conclui-se que a ervilha proteaginosa é um excelente alimento para ruminantes e monogástricos, podendo ser fornecida simples ou incluída em alimentos concentrados; é excelente como suplemento energético e proteico uma vez que associa, no mesmo grão, elevados níveis de PB e de amido; apresenta um valor energético relativamente elevado; devido ao baixo teor de GB é um alimento muito interessante para ruminantes e para dietas light de animais de companhia; dependendo do preço de mercado pode vir a substituir, total ou parcialmente, o milho (como fonte de glúcidos facilmente fermentescíveis) e a soja (como principal fonte de proteína).Instituto Tecnológico Agrário de Castilla y León y Instituto Politécnico de Castelo Branco/Escola Superior Agrári

Nutritional Assessment of Different Field Pea Genotypes (Pisum sativum L.)

The aim of this study was to determine the dry matter (DM), ash, organic matter (OM), crude protein (CP), ether extract (EE), crude fiber (CF), total sugars, starches and estimate the metabolizable energy (ME), in ruminants, pigs, poultry, horses and pets (dogs and cats) and digestible energy (DE) in rabbits from the 10 most productive field pea genotypes (Pisum sativum) obtained in a trial with 4 X 20 different genotypes (Project 0186_AGROCELE_3_E). The results (% DM - genotype) allowed us to state the following: all the 10 field pea genotypes grain were an important source of energy (cytoplasmic carbohydrates) with high percentages of soluble sugars (7.95% ISARD to 9.42% ENDURO) (P < 0.05) and starch (38.63% LIVIA to 45.00% AUDIT) (P < 0.05), low CF content (5.99% ISARD to 7.90% CARTOUCHE) (P < 0 05), high CP (22.8% ENDURO to 26.1% CORRENT) (P < 0.05), low levels of EE (0.69% LIVIA to 1.62% CHEROKEE) (P<0.05), ideal level of ME ruminants (11.844 MJ/kg DM - CHEROKEE to 11.883 MJ/kg DM - CORRENT) (P < 0.05), ME pigs (14.683 MJ/kg DM - ISARD to 13.885 MJ/kg DM - CARTOUCHE) (P < 0.05), ME poultry (11.540 MJ/kg DM - LIVIA to 12.868 MJ/kg DM - AUDIT) (P < 0.05), ME horse (11.392 MJ/kg DM - CORRENT to 11.979 MJ/kg DM - AUDIT) (P < 0.05), ME pets (13.116 MJ/kg DM – CORRENT to 13.498 MJ/kg DM - ISARD) (P < 0.05) and DE rabbits (12.977 MJ/kg DM – CARTOUCHE to 13.044 MJ/kg DM - ISARD) (P < 0.05). We concluded that all 10-field pea genotypes are an excellent feedstuff for ruminants and non-ruminants animal and it could be supplied plain or included in concentrate feed because it is an excellent protein and energy supplement. It combines in the same grain high levels of crude protein and starch. Due to the low fat content is a very interesting pulse for pets’ light diets.CERNAS - Supported by National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology under the project PEst-OE/AGR/UI0681/201

Investigating the impact of beam and target parameters in particle imaging

Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Radiação em Diagnóstico e Terapia) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Estima-se que o cancro é a segunda principal causa de morte a nível mundial sendo responsável por aproximadamente 9.6 milhões de mortes em 2018, globalmente correspondendo a 1 em cada 6 mortes98. Cirurgia, radioterapia e quimioterapia estão incluídas como alguns dos vários regimes de tratamento adequados dependendo do tipo de cancro, sendo, portanto, o seu correto diagnóstico um factor de elevada importância. Radioterapia externa é definida como o tratamento que consiste na administração de diferentes tipos de radiação ionizante como o raio-X, raios Gamma, protões ou partículas com carga, utilizados como fim a destruição das células tumorais. Este processo consiste no efeito direto provocado pela radiação na estrutura do DNA, mais especificamente na dupla hélice, provocando uma ativação de sensores de destruição no DNA de modo a causar necrose, apoptose ou produzir um efeito na mitose de forma a deformar as características normais do neoplasma94. Exisre também um efeito indireto de destruição através das espécies reativas de oxigénio produzidas pela radiólise de água. A radiação absorvida pelas células, medida em unidades Gray (Gy) é definida como a quantidade de energia depositada pela radiação ionizante numa massa de volume de tecido, sendo que o dano celular é tanto maior quanto maior for a radiação absorvida85. As partículas carregadas possuem distribuições de profundidade-dose diferentes quando comparadas com fotões. A grande maioria da sua energia é depositada nos milímetros finais da sua trajetória, quando a sua velocidade diminui, sendo este factor o que forma o pico de Bragg, definido como um pico de dose estreito e localizado. O alcance desta mesma partícula no material é observado na posição de paragem do pico de Bragg91. Procedendo ao ajustamento da energia das partículas carregadas é possível depositar com alta precisão as doses pré-prescritas no corpo do doente, levando a que haja um rácio alto de deposição de dose no volume alvo quando comparado com tecido saudável. A errada localização do pico de Bragg pode resultar tanto em overdose dos tecidos saudáveis como em subdosagem do alvo. Portanto, um desafio importante na radioterapia consiste em determinar a energia incidente necessária da partícula de modo a permitir uma alta ionização num lugar específico do corpo humano. Em terapia externa de fotões e protões, anteriormente ao tratamento, uma tomografia computorizada de planeamento é adquirido, onde as estruturas são delineadas de modo a providenciar um mapa de densidade eletrónica que mais tarde é traduzida para valores de poder de paragem71. A prática clínica corrente consiste em adquirir os valores de poder de paragem no doente procedendo à conversão de unidades Hounsfield de uma tomografia computorizada de planeamento para poder de paragem relativo. O poder de paragem relativo é definido como o poder de paragem de um material comparado com o poder de paragem da água43. Esta conversão consiste na correspondência entre valores das unidades Hounsfield e poderes de paragem relativos a partir de uma curva de calibração91. Contudo, não existe uma relação física entre o coeficiente de atenuação mássica do fotão, medido pela tomografia computorizada de planeamento, e os valores de poder de paragem relativos o que leva a incertezas associadas a este método de conversão. Estas incertezas têm um grande impacto no alcance atingido pelas partículas calculado no scan de tomografia computorizada do doente e variam na ordem dos 3%. Portanto, margens de segurança são adicionadas à dose administrada ao doente que rodeia o volume alvo planeado de modo a assegurar um volume total clínico do alvo. Como esperado, devido a estas margens de segurança, um volume significativo de volume de tecido saudável irá também receber dose. Radiografia e tomografia de partículas são ferramentas utilizadas para o planeamento de tratamento e verificação em terapia de partículas de maneira a permitir a visualização da parte do corpo que está a passar pelo scan. A maior vantagem associada à imagiologia de transmissão de partículas quando comparada com a estimação dos valores de poder de paragem relativos com raio-X, é a maior precisão desta estimação devido às medidas efetuadas à espessura equivalente de água percorrida pelos protões ou iões leves após percorrer o doente. Sendo que os valores de espessura equivalente da água estão relacionados com a valores integrados de poder de paragem relativos, os mesmos poderão ser obtidos, em três dimensões, através da reconstrução da tomografia computorizada das projeções medidas dos valores de espessura equivalentes de água71. Portanto, imagiologia de partículas permite a estimação direta de valores relativos de poder de paragem através de tomografia computorizada de partículas. Não obstante, a dispersão múltipla de Coulomb, definido como processos de dispersão de Rutherford sofridos por uma partilha aquando da sua viagem na matéria, limita a qualidade de imagem devido à defleção angular e deslocamento lateral das partículas. Estas dispersões dificultam a predição da localização e ângulo da partícula a uma dada profundidade. De modo a melhorar a resolução espacial, é necessário identificar a posição e direção da partícula antes e depois do objeto assim como medir a sua energia residual individual recorrendo a sistemas de detetores. O detetor utilizado para esta investigação da tese está mais profundamente explicado na secção 4.2. Os algoritmos Most Likely Path (MLP) (“Trajeto mais provável”) e Cubic Spline Path (“Trajetória de linha cúbica”) foram propostos em imagiologia de partículas com objetivo de melhorar o problema associado à dispersão múltipla de Coulomb. Recorrendo aos algoritmos mencionados, o objetivo principal desta tese é, portanto, a investigação da qualidade de imagem de radiografia em função da energia inicial do feixe de partículas. Uma vez que a dispersão múltipla de Coulomb afeta a precisão do algoritmo MLP afetando, portanto, a resolução espacial, tem sido proposto por vários estudos21,32,42,69,88 o uso de iões de hélio como partículas geradoras de imagem devido ao reduzido efeito associado de múltipla dispersão de Coulomb. Além do mais, quando comparados com protões, os iões de hélio possuem menos dispersão de alcance o que significa que têm menos ruído associado à imagem com o mesmo número de partículas por pixel32. Juntando estas vantagens associadas e ainda mais o facto de que os iões de hélio sofrem menos fragmentação quando comparados com partículas pesadas, fez com que estas fossem as partículas escolhidas para imagiologia como estudo para esta tese. O estudo de Amato et al. (2020)5 demonstra que o uso de energias mais altas para o feixe de partículas provoca uma redução da dispersão múltipla de Coulomb levando a um aumento da resolução espacial. Contudo, um aumento de dispersão de alcance da partícula leva a que haja um maior nível de ruído na imagem. No mesmo estudo, apenas objetos homogéneos são estudados e no caso dos objetos heterogéneos a dispersão múltipla de Coulomb aumenta significativamente o ruído de imagem25. Consequentemente, sendo que ainda é desconhecido o comportamento da qualidade de imagem aquando do aumento da energia do feixe para casos reais de doentes, o objetivo principal desta tese é a investigação da qualidade de imagem de radiografia de iões de hélio em função da energia inicial do feixe de partículas, tanto para fantomas homogéneos como para heterogéneos. Um protótipo de detetor68 foi utilizado para simular, com simulações Monte Carlo no software de simulações TOPAS, as radiografias de hélio e, seguindo o estudo de Amato et al. (2020)5, um material degradador de energia (cobre) foi adicionado entre o dispositivo rastreador traseiro e o detetor de energia de modo a compensar os alcances mais elevados associados a maiores energias do feixe. Nesta tese, um fantoma homogéneo de água com três cubos de alumínio inseridos foi estudado assim como um fantoma de uma cabeça pediátrica34 de modo a estudar casos mais realistas. As reconstruções de imagem foram realizadas recorrendo ao algoritmo desenvolvido por Collins-Fekete et al. (2016)19 e a qualidade de imagem foi analisada para resolução espacial, rácio entre contraste e ruído e o ruído por pixel em relação à dose absorvida. Os resultados desta investigação, com o intervalo de energias do feixe utilizado (200-325 MeV/u), envolveram uma melhoria total de 46% de resolução espacial com o aumento da energia do feixe de partículas, exceto para o caso de 325 MeV/u que não segue a tendência. Em relação ao rácio entre contraste e ruído, ocorreu uma diminuição de 42% à medida que a energia do feixe de partículas aumentava. Concluindo, existe uma melhoria qualitativa e quantitativa em termos de resolução espacial nas radiografias de iões de hélio associada ao aumento das energias do feixe de partículas com a adição de um degradador de energia.Cancer is known to kill an estimate of 9.6 million people in 201898. Therefore, it is urgent to ameliorate the associated treatment, specifically radiotherapy. Particle therapy is a form of cancer radiotherapy exploiting the highly localized dose deposit of charged particles, the Bragg peak, for advanced sparing of healthy tissue. However, the highly conformal dose deposit also presents a great challenge as misplacement of the Bragg peak can result in severe overdosage of healthy tissue/underdosage of the target. Precise particle therapy hence requires advanced image guidance methods. This thesis focuses on particle imaging for image guidance in particle therapy. A precise relative stopping power map of the patient constitutes a vital part for accurate particle therapy. Charged particle imaging can determine the stopping power both tomographically with particle computed tomography (pCT), or combining prior knowledge from particle radiography and X-ray CT. In terms of image quality improvement, image reconstruction becomes challenging for particle imaging owing to the existence of Multiple Coulomb Scattering (MCS) limiting image resolution (worse spatial resolution) and leading to increased image noise20. In order to improve the image quality, therefore, most likely path (MLP) reconstruction algorithms are performed, to ameliorate the problem of MCS. Tracking detectors of individual particles before and after the patient are required to use MLP algorithms. Moreover, an energy/range detector is also necessary to measure the particles’ residual energy/range after the patient and to ensure RSP accuracy. Both heavier particles and higher beam energies reduce the effect of multiple Coulomb scattering, leading to a better path estimation. It is also noted, that for lighter ions, fixing the initial range maximizes the physical dose deposition to the patient while minimizing the image quality91. In this thesis, therefore the image quality of helium ion imaging with a recent prototype detector system is evaluated as function of the beam energy in detailed Monte Carlo simulations. With this research project, factors, such as beam and target parameters, involved in increasing image quality were studied in particle imaging taking into account detector design. The idea was to investigate how to improve upon a state-of-the-art prototype scanner, allowing for higher beam energies. This will be accomplished by adding an adequate energy degrader to the detector, between the rear tracker and the energy/range detector. This degrader had its main aim to compensate for the longer range associated with more energetic ions. The main goal was to investigate the image quality as a function of initial energy behave, assuming a realistic detector model in the simulation. Helium ion beams at six different energy levels available at a clinical ion beam therapy facility (200 MeV/u to 325 MeV/u) were used to image two different phantoms: a water phantom with three aluminum cubes inside and an anthropomorphic pediatric head phantom. Monte Carlo simulations were performed using the TOPAS simulation toolkit. For path estimation, the Cubic Spline Path (CSP) was employed, which is a computationally efficient variate of the MLP. To reconstruct helium ion radiographic images the Maximum Likelihood Method used. This algorithm yields highly accurate radiographs without the need of prior knowledge. Further, the image quality was analyzed through the contrast-to-noise-ratio (CNR), per-pixel-noise and the Modulation Transfer Function (MTF), considering the absorbed dose. The results of this investigation, considering the beam energy interval, involve a total spatial resolution improvement of 46% measured with increasing beam energy, except for the 325 MeV/u case which does not fit the trend. In relation to CNR analysis, a decrease of 42% was found as the beam energy increases. In conclusion, there is a quantitatively and qualitatively improvement in terms of spatial resolution in helium-beam radiography with increasing beam energies with the addition of an energy degrader

Evaluation of proteaginous Pisum sativum L. cultivars in the region of Castelo Branco

Evaluation of proteaginous Pisum sativum L. cultivars in the region of Castelo Branco Carlos M. G. Reis(1)* and Paulo Rodrigues(1) 1 Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Castelo Branco. *[email protected] The pea crop (Pisum sativum L.) is a convenient source of plant protein for animal feeding, an area where there is a production deficit in European Union. After obtaining new cultivars through plant breeding it is important to evaluate their agronomic performance in different regions. This study aimed to evaluate the agronomic performance of 20 cultivars of proteaginous Pisum sativum L., listed in the Community Catalogue of varieties of agricultural plant species, in the region of Castelo Branco, Portugal. A field trial was implanted in Escola Superior Agrária de Castelo Branco. Sowing took place on November 2009 in plots with 12.0 m2 in a randomized complete block design with four replications. A density of 110 plants per m2 was used. Some parameters related to plant growth and yield were studied, such as seed yield (kg/ha), seed moisture content (%), weight of 1000 seeds (g), number of days to flowering, number of days to harvest, lodged plants (%), dehiscence (%), plant height (cm), dry matter weight, biological weight, number of plants per m2, number of seeds per m2, height of first pod (cm), number of pods per plant, number of seeds per pod and seed number per plant. The seed protein content was also studied but only for the 10 highest yielding cultivars. The statistical analysis was performed using PASW Statistics 18 software. Analysis of variance (ANOVA) for significance level p=0.05 and the mean comparison by Duncan test application were conducted. For some yield components we calculated the Pearson correlation coefficient. The cultivars studied showed significant differences in all quantitative traits studied. With regard seed yield, there were values greater than 6,000 kg/ha for 10 cultivars (Cartouche, Enduro, Arthur, Audit, Corrent, Alhambra, Cherokee, Isard, Livia and Gregor) and 16 cultivars showed productions above 4,000 kg/ha. However, these results cannot be dissociated from the precipitation values recorded, well above the normal for the region. Among the best cultivars, Enduro and Cartouche are those with the lowest percentage of lodged plants. The cultivars Arthur, Corrent, Cherokee, Livia, Pixel, Ideal, Guifilo, Guifredo, Lumina and Grisel, showed a strong tendency to lodging. In general there is a positive correlation between seed yield and other quantitative variables, except the weight of 1000 seeds. The positive correlations were highest to the number of seeds per m2 (0.847), biological weight (0.787) and harvest index (0.857). The seed protein content was similar for the cultivars studied. Although the results of seed yield are very interesting, it is necessary to conduct additional trials to evaluate the agronomic performance of pea cultivars in order to obtain more consistent results. However, the results allow us to elect a group of cultivars with high seed yield and apparently good adaptability to the region of Castelo Branco

Identification and characterization of new players involved in the centriole maintenance program

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O centrossoma é, em células animais, o principal centro organizador de microtúbulos (COMT). Em interfase regula a mobilidade, adesão e polaridade celulares, enquanto que em mitose participa na formação e organização do fuso mitótico. Cada centrossoma é composto por dois centríolos. Os centríolos são estruturas cilíndricas formadas por nove microtúbulos (organizados em singletos, dupletos ou tripletos) dispostos de forma radial em redor de uma estrutura central (a cartwheel). Um dos centríolos do par é denominado de centríolo-mãe, enquanto que o outro, ortogonalmente disposto em relação ao primeiro é denominado de centríolo-filho. Um centríolo tem aproximadamente 200nm de largura e pode possuir entre 200 a 500nm de comprimento, dependendo do tipo de célula. Em conjunto ambos os centríolos recrutam e participam na organização de uma matriz proteica densa - o material pericentriolar – que os rodeia e é responsável pela nucleação de microtúbulos. Finalmente, em fases específicas de diferenciação, os centríolos associam-se à membrana celular para formar a corpo basal, a partir do qual crescerá o cílio ou flagelo da célula. A simetria radial dos centríolos é extremamente conservada nos diferentes ramos da árvore filogenética, porém a estrutura centriolar pode variar ligeiramente de espécie para espécie. Em Humanos os centríolos são compostos por nove tripletos de microtúbulos, ao passo que os centríolos em Drosophila melanogaster são formados por nove dupletos de microtúbulos. Em algumas espécies os centríolos-mãe possuem apêndices distais e sub-distais que permitem a ligação do centríolo à membrana celular e a ancoragem de microtúbulos, respetivamente. O número de centríolos presente nas células é altamente controlado, e a sua duplicação é regulada tanto temporalmente - em coordenação com a replicação do DNA - como espacialmente - apenas um centríolo-filho se forma junto a cada centríolo-mãe por cada novo ciclo celular. Dependendo da fase do ciclo celular em que se encontra, a maioria das células tem um (fase G1) a dois centrossomas (fase S, G2 e M) (dois a quatro centríolos). Alterações no número de centríolos estão associadas a diversas doenças como o cancro, microcefalia ou ciliopatias. Diferentes estudos demonstram que os centrossomas são resistentes a tratamentos de despolimerização de microtúbulos. Consequentemente, estes organelos são descritos como estruturas altamente estáveis; no entanto, várias observações têm demonstrado que os centrossomas não são estruturas intrinsecamente estáveis como inicialmente se pensava. Em diversos sistemas celulares estes organelos podem ser eliminados ou inativados, como na gametogénese feminina ou em células diferenciadas, respetivamente. A eliminação de centrossomas durante a oogénese é comum na maioria dos metazoários, equinodermes e molúsculos. Porém, enquanto que no caso dos metazoários a eliminação dos centrossomas ocorre antes das divisões meióticas, em equinodermes e molúsculos estas estruturas só desaparecem durante as divisões meióticas. A eliminação dos centrossomas durante a gametogénese feminina implica que o embrião dependa do centríolo fornecido pelo esperma para que ocorram as primeiras divisões celulares no embrião, após a fertilização. A eliminação de centrossomas na oogénese é um processo biológico muito importante e o conhecimento dos mecanismos que o regulam é ainda muito escaço. Um estudo publicado recentemente pelo nosso grupo desvendou um mecanismo de regulação da eliminação de centrossomas durante a oogénese em Drosophila. Em Drosophila a oogénese inicia-se no germário com a divisão assimétrica de uma célula estaminal que dá origem a uma nova célula estaminal e um cistoblasto. O cistoblasto sofre quatro divisões consecutivas com citocinese incompleta formando um grande cisto composto por dezasseis células em que apenas uma dará origem ao oócito, sendo que as restantes são denominadas de nurse cells. Nesta fase, os centrossomas das nurse cells agrupam-se e migram para o oócito, formando um grande COMT que se desintegra ao longo da oogénese, e que portanto, não participa na formação do fuso meiótico. No referido estudo observou-se que durante a oogénese a cinase Polo (Polo like kinase em humanos) é deslocalizada do centrosoma. Sendo a Polo responsável pelo recrutamento do material pericentriolar, também este é perdido durante o processo. Consistentemente, a remoção da Polo dos centríolos do oócito, leva à perda prematura de centrossomas durante a oogénese, ao passo que a expressão ectópica desta proteína com a sua localização forçada nos centríolos do oócito, leva à retenção de centrossomas até à fase de divisão meiótica, com acumulação de proteínas do material perientriolar. Esta retenção anormal de centrossomas nos óocitos levou à falha do desenvolvimento embrionário após a fertilização. Os resultados obtidos neste estudo e reproduzidos com sucesso em células de Drosophila, sugerem que as proteínas que formam o material pericentriolar, auxiliadas pela Polo, funcionam como um escudo protetor à volta dos centríolos impedindo a sua destabilização, o que pressupõe a existência de um mecanismo de manutenção da estabilidade dos centríolos. Em situações em que os centrossomas são eliminados, como nos oócitos, este mecanismo de estabilização é desativado: a Polo e as proteínas do material pericentriolar deixam de ser acumuladas no centrossoma, levando à sua destabilização e consequente eliminação. De forma semelhante ao que acontece na oogénese em Drosophila, em células diferenciadas - como o músculo esquelético, neurónios ou células epiteliais - a inativação dos centrossomas também parece ser realizada através da remoção das proteínas do material percientriolar, sugerindo que o mecanismo de estabilidade de centrossomas não é exclusivo para a oogénese, mas sim universal. Paralelamente, o mecanismo que permite a estabilização dos centrossomas mediado pelas proteínas do material pericentriolar e pela Polo permanece pouco claro. As proteínas do material pericentriolar poderão funcionar como um escudo que impede: (1) o acesso de proteínas que possam destabilizar os centríolos; ou (2) a saída de proteínas que contribuem para a estabilidade dos centríolos. De forma a identificar proteínas envolvidas no mecanismo de estabilização dos centríolos foi realizado um rastreio (screen) por RNA de interferência (RNAi) em células de Drosophila melanogaster bloqueadas na fase S durante oito dias. O bloqueio nas células em fase S impede o funcionamento do ciclo de duplicação de centríolos permitindo desacoplar estabilidade e biogénese centrossomal. Desta forma, o numero de centríolos é mantido constante, o que permite tirar vantagem para analisar o efeito (d)estabilizador das diferentes proteínas testadas. As células foram transfectadas com RNAi’s específicos para diferentes proteínas (proteínas candidatas) que foram descritas como fazendo parte da estrutura do centrossoma. Foram depletadas proteínas do material pericentriolar, proteínas centriolares como as da cartwheel, da parede centriolar e da zona distal do centríolo (cap) e ainda a Polo like kinase 4 (Plk4), a principal reguladora da biogénese dos centrossomas. O efeito que a remoção destas proteínas provocou na estabilidade dos centrossomas foi analisado através do número de centríolos por célula utilizando ensaios de imunofluorescência, no qual os centrossomas foram detetados utilizando anticorpos específicos para diferentes proteínas de diferentes partes/módulos do centrossoma. Os resultados obtidos foram comparados com um controlo (mCherry RNAi) e sempre que o número de centríolos era reduzido comparativamente ao controlo foi considerado que a proteína era importante para a estabilização do centrossoma. Os nossos estudos sugerem que os módulos que contribuem significativamente para a estabilidade dos centrosomas incluem proteínas do material pericentriolar, da parede centriolar e da cartwheel. Por outro lado, as proteínas da cap e Plk4 não parecem apresentar um papel relevante na estabilidade do centrossoma. De todas as proteínas candidatas testadas, a proteína da parede centriolar Ana1 revelou um dos fenótipos de perda de centríolos mais forte. Assim, prosseguimos com o estudo desta proteína in vivo. Simultaneamente, expressámos ectopicamente a Polo e depletámos a Ana1 nos centrossomas de óocitos de Drosophila. Observámos uma redução na manutenção dos centríolos em estádios avançados da oogénese sugerindo que a Ana1 apresenta um papel extremamente importante na estabilidade dos mesmos. Em conjunto, este estudo demonstra a importância das proteínas do material pericentriolar, da cartwheel e da parede centriolar para a manutenção e estabilização do centrossoma. Foi ainda possível identificar uma proteína que poderá ter um papel preponderante no mecanismo de estabilização dos centríolos. Contudo, é necessário investigar qual o papel dos diferentes módulos do centrossoma (o material pericentriolar, a cartwheel e a parede centriolar) na sua estabilização e compreender se estes têm funções específicas ou redundantes. É igualmente importante perceber qual o papel da Ana1 no mecanismo de estabilização dos centríolos, assim como a sua relação com a Polo e com as proteínas do material pericentriolar. Apenas o conhecimento detalhado do mecanismo que confere estabilidade aos centrossomas nos permitirá atuar sobre este mecanismo quando desregulado em doenças como o cancro.Organelle inheritance and its persistence is essential not only upon cell division, but also differentiation, fertilization and disease. Amongst those, a structure that always raised much interest is the centrosome. The centrosome is the primary microtubule-organizing centre (MTOC) in animal cells, regulating cell shape and polarity in interphase, and spindle pole organization during mitosis. The centrosome is formed by two orthogonally arranged centrioles that are surrounded by a matrix of proteins called the pericentriolar material (PCM), which is essential for microtubule (MT) nucleation. Control of centriole number and function is very important, and dysfunction of these organelles is associated with a variety of human diseases. Despite being resistant to MT depolymerization and instability, centrosomes are eliminated from the oocytes from most metazoan species and can be inactivated in differentiated cells, suggesting that centrosomes are not intrinsically stable. It is not completely understood how centrosomes are eliminated or inactivated. However, a recent study in Drosophila melanogaster proved the existence of a centriole maintenance program. This program ensures centriole stability through PCM maintenance, which protects the centrosome, and is mediated by Polo kinase. To allow centriole elimination in the oocyte, this program is “shut down”. Perturbing this program prevents centriole loss and leads to female sterility. In order to identify new players involved in the centriole maintenance program, we performed a RNAi screen in Drosophila cultured cells. We chose candidate proteins that were described as components of the different modules of the centrosome and depleted them in S-phase arrested cells. We showed that while removal of some of the modules of the centrosome strongly destabilize the centrosome, others do not have a major effect in centrosome destabilization. Out of all the candidate proteins tested, the centriolar wall protein Ana1 showed the strongest effect on centrosome destabilization. We show that depletion of Ana1 in Drosophila oogenesis impairs PCM accumulation mediated by Polo, suggesting that this protein has a key role in the centriole maintenance program. Together, these results allowed us to identify the principal structural features that contribute to centrosome stability and also brought us new insights into the centriole maintenance program. However, further studies are needed to understand how this program is regulated which is important not only for successful sexual reproduction, but also for centriole life span and its impact on different tissues in homeostasis and disease, shaping the cytoskeleton

Compact SMB chromatography for binary separation

A thesis submitted for the degree of Doctor of PhilosophyThis thesis consists essentially of theoretical and experimental developments in the field of continuous chromatography using small-scale units. Continuous chromatographic separation processes based on the Simulated Moving Bed (SMB) technology were first patented and applied in 1961 for a large number of separations in the petrochemical industry and later for sugar separation. However, in the last two decades,due to the patent expiration, the process has been gaining great interest in the separation/purification of products in fine chemical and pharmaceutical industries. The conventional SMB comprises several identical columns which are serially connected in either a closed- or open-loop configuration. In order to simulate the movement of a solid bed in opposite direction to the fluid, the positions of the input and output streams are shifted downstream by one column, at fixed intervals, in the direction of fluid flow. With the development of new and efficient equipment and stationary phases, several new schemes of operating that differ from the conventional one have emerged. These include new concepts such as Varicol, ModiCon and PowerFeed processes, which rely on the periodic modulation of certain process parameters during the switching interval to enhance the efficiency of the separation. These advances are pushing the trend for units with a small number of columns, since the overall setup is more economical. However, when these newly schemes are applied in practice the process becomes more complex, because of the increased degrees of freedom that must be optimized. It is also less robust and more difficult to operate because it is more demanding on hardware. This additional complexity requires highly versatile SMB equipment, advanced optimization tools and robust control procedures. Experimental tools to experimentally reproduce the periodic state of multicolumn countercurrent chromatography with just one column are developed; they are economic and fast methods of experimentally exploring different column configurations and cyclic operation policies,ideally suited for applied research studies but may also be useful in the early stages of development, optimization, and validation of a new chromatographic separation. The feasibility of the proposed single-column system is experimentally demonstrated for several different column configurations, which include both synchronous and asynchronous port switchings and flow modulated schemes. Following the potentialities of these new operating schemes, a novel SMB system for binary separation that employs only two-columns is developed. The designed two-column process uses both the port switching and the flow rates modulation procedure. The process is very versatile since the cycle itself is optimized and adapted to the difficulty of the separation and process specifications. Furthermore, a simplified extension of the two-column setup which relies on a minimum pump number configuration and on a uniform flowrate scheme is built-up; additionally a further development on these simplified setup is applied which effectively enhances the process with only the cost of a small increase on the setup equipment. Potentialities of this new unit are illustrated comparing it to setups using the same amount of stationary phase.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT/MCTES

Nova abordagem para a prestação de serviços de consultoria de tecnologias de informação na Novabase

Tese de mestrado integrado. Engenharia Industrial e Gestão. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 201