Three-Dimensional Reconstruction of Foot in the Weightbearing Position From Biplanar Radiographs: Evaluation of Accuracy and Reliability

The initial assessment and postoperative monitoring of patients with various abnormalities of the foot in clinical routine practice is primarily based on the analysis of radiographs taken in the weightbearing position. Conventional x-ray imaging, however, only provides a 2-dimensional projection of 3-dimensional (3D) bony structures, and the clinical parameters assessed from these images can be affected by projection biases. In the present work, we addressed this issue by proposing an accurate 3D reconstruction method of the foot in the weightbearing position from low-dose biplanar radiographs with clinical index measurement assessment for clinical routine practice. The accuracy of the proposed reconstruction method was evaluated for both shape and clinical indexes by comparing 3D reconstructions of 6 cadaveric adult feet from computed tomographic images and from biplanar radiographs. For the reproducibility study, 3D reconstructions from the biplanar radiographs of the foot of 6 able-bodied subjects were considered, with 2 observers repeating each measurement of anatomic landmarks 3 times. Baseline assessment of important 3D clinical parameters was performed on 17 subjects (34 feet; mean age 27.7, range 20 to 52 years). The average point to surface distance between the 3D stereoradiographic reconstruction and the computed tomographic scan-based reconstruction was 1 mm (range 0mm to 6mm). The selected radiographic landmarks were highly reproducible (95% confidence interval <2.0 mm). The greatest interindividual variability for the clinical parameters was observed for the twisting angle (mean 87°, range 73° to 100°). Such an approach opens the way for routine 3D quantitative analysis of the foot in the weightbearing position.The authors thank the ParisTech BiomecAM chair program on subject-specific musculoskeletal modeling, and in particular COVEA and Société Générale. The authors also thank Audrey Arts, Roxane Huet, and Thomas Joubert for their kind technical assistance

Abnormal splicing switch of DMD's penultimate exon compromises muscle fibre maintenance in myotonic dystrophy

International audienceMyotonic Dystrophy type 1 (DM1) is a dominant neuromuscular disease caused by nuclear-retained RNAs containing expanded CUG repeats. These toxic RNAs alter the activities of RNA splicing factors resulting in alternative splicing misregulation and muscular dysfunction. Here we show that the abnormal splicing of DMD exon 78 found in dystrophic muscles of DM1 patients is due to the functional loss of MBNL1 and leads to the re-expression of an embryonic dystrophin in place of the adult isoform. Forced expression of embryonic dystrophin in zebrafish using an exon-skipping approach severely impairs the mobility and muscle architecture. Moreover, reproducing Dmd exon 78 missplicing switch in mice induces muscle fibre remodelling and ultrastructural abnormalities including ringed fibres, sarcoplasmic masses or Z-band disorganization, which are characteristic features of dystrophic DM1 skeletal muscles. Thus, we propose that splicing misregulation of DMD exon 78 compromises muscle fibre maintenance and contributes to the progressive dystrophic process in DM

Study of collagen VI during the zebrafish muscle development : implications for COLVI-related myopathies

Les muscles sont des structures très organisées qui nous permettent d’effectuer un grand nombre de fonctions. Ils sont constitués de cellules musculaires mais aussi de tissus conjonctifs qui comprennent à la fois des cellules et la matrice extracellulaire. Les interactions entre les cellules musculaires et le tissu conjonctif sont cruciales pour la physiologie du muscle. Le collagène VI (COLVI) est une molécule hétérotrimérique ubiquitaire située dans les tissus conjonctifs, qui est impliquée dans un grand nombre de processus biologiques. Les trimères de COLVI sont composés de 2 chaines dites “courtes” et d’une chaine “longue”. Chez les mammifères, il existe à ce jour, 6 chaines COLVI (deux courtes (α1-2(VI) et 4 chaines longues (α3-6(VI)). Peu de choses sont encore connues à propos de l’assemblage des chaines les plus récemment décrites α4-6(VI) avec les chaines courtes ainsi qu’une la potentielle compensation entre les différentes chaines longues. De plus, chez l’homme, un déficit en α1-3(VI) du fait de mutations dans les gènes correspondants COL6A1-3 conduit à un spectre de maladies neuromusculaires appelées myopathies liées au COLVI. Pendant ma thèse, je me suis intéressée au COLVI durant le développement du poisson-zèbre, un modèle pertinent pour l’étude de maladies neuromusculaires. Dans la première partie de mon travail, j’ai identifié 2 orthologues des chaines α4-6(VI) chez le poisson-zèbre grâce à des études bio-informatiques. Du fait de leur plus grande homologie avec la chaine α4(VI) murine, nous les avons nommés col6a4a et col6a4b. Pour mieux comprendre les rôles des protéines correspondantes, j’ai créé des embryons de poissons-zèbres déficients en COLVI en utilisant l’approche transitoire par oligo morpholino antisens (MOs). Nous avons dessiné des MOs ciblant des sites d’épissage des pré-messagers col6a2, col6a4a et col6a4b, provoquant un saut d’exon et conduisant à un stop prématuré (PTC). J’ai observé une forte diminution des transcrits ciblés. Tous les embryons injectés (morphants) ont présenté des phénotypes morphologiques macroscopiques qui ont conduit à des défauts fonctionnels. Ces phénotypes ont été confirmés au niveau ultra-structural par microscopie électronique. Toutefois, l’analyse de la croissance des motoneurones a permis de mettre en évidence des différences entre ces morphants. Par la suite, j’ai voulu créer deux types de lignées transgéniques, pour pouvoir à la fois étudier le déficit en COLVI à plus long terme (grâce à l’utilisation de Zinc Finger Nucleases) et tester des approches de cribles pharmacologiques (lignée transgénique col6a2 contenant un PTC, fusionné à la GFP). J’ai effectué les clonages nécessaires à l’obtention des différentes constructions, et ces dernières ont été testées in vitro pour validation, lorsque cela était possible. Malheureusement, du fait des forts taux de mortalité in vivo dans les deux cas, nous avons dû nous résoudre à arrêter ces projets. En parallèle, ma connaissance du modèle poisson-zèbre m’a donné l’opportunité, dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de Denis Furling, d’aborder une autre problématique. Ce groupe, qui travaille sur la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), s’est intéressé à la réexpression d’une isoforme fœtale de la dystrophine retrouvée chez les patients DM1 et à sa possible implication dans la pathologie. L’isoforme fœtale diffère de la forme adulte notamment par l’exclusion de l’exon 78, conduisant à un changement de cadre de lecture et un changement dans la partie 3’ de l’ARN de la dystrophine. Nous avons montré que le maintien de l’isoforme fœtale de la dystrophine était délétère pendant le développement du poisson-zèbre, puisque ces embryons ont présenté un phénotype macroscopique dépendant de la dose de MO injectée ainsi que des troubles de la mobilité.Muscles are highly organized structures that allow us to perform many functions. They are made from muscular cells but also surrounding tissues that comprise both cells and extracellular matrix. The interactions between them are crucial for the muscle physiology. Collagen VI (COLVI) is a heterotrimeric protein, ubiquitously expressed in connective tissues. It plays multiple biological roles in the maintenance of structural integrity, cellular adhesion, migration and survival. COLVI trimers are formed by the assembly of 2 “short” chains and 1 “long” chain. To date, six COLVI chains are recognized in mammalians with 2 short (α1-2(VI)) and 3 long (α3-6(VI)) chains. Little is known regarding the possible assembly of the newly characterized α4-6(VI) polypeptides with the short chains, and a putative functional compensation between the different long chains. Furthermore, in humans, deficiency in α1-3(VI) due to mutations in the COL6A1-3 genes causes a heterogeneous group of neuromuscular disorders collectively termed COLVI-myopathies. During my Ph.D, I got interested in COLVI during the development of zebrafish, a relevant model of neuromuscular disorders. In the first part of my work, I identified 2 orthologs of the α4-6(VI) chains in zebrafish thanks to bio-informatics studies. In light of their stronger homology with the mammalian α4(VI) chain, we named the genes encoding the novel chains col6a4a and col6a4b. To further unveil the roles of the corresponding proteins, we created COLVI deficient zebrafish embryos using a morpholino antisense oligonucleotides approach (MO) . We chose to design MOs that block splicing of col6a2, col6a4a and col6a4b, thereby creating premature termination codons. As expected, the targeted transcripts levels were drastically reduced, likely due to degradation by the nonsense mediated RNA decay. All morphant embryos presented macroscopic and morphologic phenotypes that overall resulted in functional muscle defects: altered muscle structure detected by birefringence analysis and impaired motility upon touch-evoked escape test. These alterations were confirmed at the ultra-structural level by electron microscopy. Nevertheless, some phenotypical specificities were uncovered between the different col6a2, col6a4a and col6a4b morphants, with the discovery of axon outgrowth defects. In a second part, we wanted to create stable zebrafish lines to study COLVI deficiency at later stages using Zinc Finger Nucleases (ZFN) and to be able to carry out pharmacological screenings with a transgenic line containing col6a2 with a premature codon (PTC) fused to the GFP. I performed clonings to obtain the different constructs. When possible, constructs were tested in vitro. Unfortunately, due to high mortality in vivo in both cases, we had to interrupt these projects. In parallel, my knowledge of the zebrafish model gave me the opportunity to be part of another project, in collaboration with the team of Denis Furling..

Synthesis of novel fluorocarbon-therapeutic peptide conjugates to increase the metabolic stability of GPCRs ligands : application to apeline and spexin, mechanism study and biological evaluation

Les peptides présentent un fort potentiel thérapeutique. En revanche, leur faible stabilité dans l’organismerend leur étude et leu r développement difficiles. Afin d’améliorer la stabilité plasmatique de peptides, il aété développé au laboratoire une nouvelle stratégie qui consiste en l’introduction d’une chainefluorocarbonée dans la séquence d’un peptide. Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié lesmécanismes conduisant à cette augmentation de stabilité dans le cas de l’apeline, un peptide possédant unintérêt potentiel pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cette stratégie de stabilisation aégalement été appliquée à la spexine, peptide ayant des propriétés analgésiques intéressantes. Ainsi, desétudes de relations structure-activité autour de ces peptides ont permis de montrer l’importance de lalongueur et de la nature de la chaine fluorocarbonée. Ce travail a également permis de concevoir de nouveauxdérivés biocompatibles à fort potentiel thérapeutique. Nous avons également développé une stratégieoriginale de synthèse des fluoro-peptides en solution par une réaction de bioconjugaison.Peptide are macromolecules presenting a high therapeutic potential. The main limitation for their study anddevelopment as therapeutics is their low plasma stability. In order to increase therapeutic peptides’ stability,a novel strategy based on the incorporation of a fluorocarbon chain into the peptide’s sequence has beendeveloped in the laboratory. During this thesis, we studied the mechanism leading to this stability on a modelpeptide involved in cardiovascular diseases: apeline-17. This method has also been applied to spexine, apromising peptide in pain regulation. Structure-activity relationship studies on those two peptides showed theimportance of the fluorocarbon chain length and its nature. These studies allowed the development of newbiocompatible fluoro-peptides showing a high therapeutic potential. We also developed an original solutionphase fluoro-peptide synthesis strategy using a bioconjugation reaction fluoro-peptide synthesis strategy

Synthesis of novel fluorocarbon-therapeutic peptide conjugates to increase the metabolic stability of GPCRs ligands : application to apeline and spexin, mechanism study and biological evaluation

Les peptides présentent un fort potentiel thérapeutique. En revanche, leur faible stabilité dans l’organismerend leur étude et leu r développement difficiles. Afin d’améliorer la stabilité plasmatique de peptides, il aété développé au laboratoire une nouvelle stratégie qui consiste en l’introduction d’une chainefluorocarbonée dans la séquence d’un peptide. Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié lesmécanismes conduisant à cette augmentation de stabilité dans le cas de l’apeline, un peptide possédant unintérêt potentiel pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cette stratégie de stabilisation aégalement été appliquée à la spexine, peptide ayant des propriétés analgésiques intéressantes. Ainsi, desétudes de relations structure-activité autour de ces peptides ont permis de montrer l’importance de lalongueur et de la nature de la chaine fluorocarbonée. Ce travail a également permis de concevoir de nouveauxdérivés biocompatibles à fort potentiel thérapeutique. Nous avons également développé une stratégieoriginale de synthèse des fluoro-peptides en solution par une réaction de bioconjugaison.Peptide are macromolecules presenting a high therapeutic potential. The main limitation for their study anddevelopment as therapeutics is their low plasma stability. In order to increase therapeutic peptides’ stability,a novel strategy based on the incorporation of a fluorocarbon chain into the peptide’s sequence has beendeveloped in the laboratory. During this thesis, we studied the mechanism leading to this stability on a modelpeptide involved in cardiovascular diseases: apeline-17. This method has also been applied to spexine, apromising peptide in pain regulation. Structure-activity relationship studies on those two peptides showed theimportance of the fluorocarbon chain length and its nature. These studies allowed the development of newbiocompatible fluoro-peptides showing a high therapeutic potential. We also developed an original solutionphase fluoro-peptide synthesis strategy using a bioconjugation reaction fluoro-peptide synthesis strategy

HRP-labeled debris are presynaptically derived.

<p>Composite confocal images correspond to 6 h APF pupae. <b>A-C</b>, The anti-HRP labeled puncta (grey, blue in the merge) colocalized with anti-FASII (red) (arrowheads). <b>D-F</b>, <i>UAS-mCD8-GFP</i> (green) was driven in motor neurons with <i>OK6-GAL4</i>. Most of the anti-HRP labeled debris (red) were GFP-positive (arrowheads). <b>G-I</b>, The anti-HRP labeled puncta (grey, blue in the merge) colocalized with CSP (red) (arrowheads). Note the pink color in the merge marked by arrowheads in C and I. <b>J-L</b>, The HRP-positive puncta (grey, blue in the merge) did not co-localize with D-GluRIIC (red), (arrow in J and L). The inset in L shows a high magnification (2×). Bars, 20 µm. Genotypes: (A-C, G-L) <i>MHC-mGFP-Shaker</i>, (D-F) <i>OK6-GAL4/2×UAS-mGFP.</i></p

<em>Drosophila</em> Motor Neuron Retraction during Metamorphosis Is Mediated by Inputs from TGF-β/BMP Signaling and Orphan Nuclear Receptors

<div><p>Larval motor neurons remodel during <em>Drosophila</em> neuro-muscular junction dismantling at metamorphosis. In this study, we describe the motor neuron retraction as opposed to degeneration based on the early disappearance of β-Spectrin and the continuing presence of Tubulin. By blocking cell dynamics with a dominant-negative form of Dynamin, we show that phagocytes have a key role in this process. Importantly, we show the presence of peripheral glial cells close to the neuro-muscular junction that retracts before the motor neuron. We show also that in muscle, expression of <em>EcR-B1</em> encoding the steroid hormone receptor required for postsynaptic dismantling, is under the control of the <em>ftz-f1/Hr39</em> orphan nuclear receptor pathway but not the TGF-β signaling pathway. In the motor neuron, activation of <em>EcR-B1</em> expression by the two parallel pathways (TGF-β signaling and nuclear receptor) triggers axon retraction. We propose that a signal from a TGF-β family ligand is produced by the dismantling muscle (postsynapse compartment) and received by the motor neuron (presynaptic compartment) resulting in motor neuron retraction. The requirement of the two pathways in the motor neuron provides a molecular explanation for the instructive role of the postsynapse degradation on motor neuron retraction. This mechanism insures the temporality of the two processes and prevents motor neuron pruning before postsynaptic degradation.</p> </div