Calcium-dependent regulation of the cell cycle via a novel MAPK–NF-κB pathway in Swiss 3T3 cells

Nuclear factor kappa B (NF-κB) has been implicated in the regulation of cell proliferation and transformation. We investigated the role of the serum-induced intracellular calcium increase in the NF-κB–dependent cell cycle progression in Swiss 3T3 fibroblasts. Noninvasive photoactivation of a calcium chelator (Diazo-2) was used to specifically disrupt the transient rise in calcium induced by serum stimulation of starved Swiss 3T3 cells. The serum-induced intracellular calcium peak was essential for subsequent NF-κB activation (measured by real-time imaging of the dynamic p65 and IκBα fluorescent fusion proteins), cyclin D1 (CD1) promoter-directed transcription (measured by real-time luminescence imaging of CD1 promoter-directed firefly luciferase activity), and progression to cell division. We further showed that the serum-induced mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation is calcium dependent. Inhibition of the MAPK- but not the PtdIns3K-dependent pathway inhibited NF-κB signaling, and further, CD1 transcription and cell cycle progression. These data suggest that a serum-dependent calcium signal regulates the cell cycle via a MAPK–NF-κB pathway in Swiss 3T3 cells

Novel ZNF414 activity characterized by integrative analysis of ChIP-exo, ATAC-seq and RNA-seq data

Transcription factor binding to DNA is a central mechanism regulating gene expression. Thus, thorough characterization of this process is essential for understanding cellular biology in both health and disease. We combined data from three sequencing-based methods to unravel the DNA binding function of the novel ZNF414 protein in cells representing two tumor types. ChIP-exo served to map protein binding sites, ATAC-seq allowed identification of open chromatin, and RNA-seq examined the transcriptome. We show that ZNF414 is a DNAbinding protein that both induces and represses gene expression. This transcriptional response has an impact on cellular processes related to proliferation and other malignancy-associated functions, such as cell migration and DNA repair. Approximately 20% of the differentially expressed genes harbored ZNF414 binding sites in their promoters in accessible chromatin, likely representing direct targets of ZNF414. De novo motif discovery revealed several putative ZNF414 binding sequences, one of which was validated using EMSA. In conclusion, this study illustrates a highly efficient integrative approach for the characterization of the DNA binding and transcriptional activity of transcription factors.Peer reviewe

Maailman halutuinta maitoa Suomesta - Lypsykarjatalouden tutkimuksen strategia 2018 - 2025

201

Human Dna2 is a nuclear and mitochondrial DNA maintenance protein

Dna2 is a highly conserved helicase/nuclease that in yeast participates in Okazaki fragment processing, DNA repair, and telomere maintenance. Here, we investigated the biological function of human Dna2 (hDna2). Immunofluorescence and biochemical fractionation studies demonstrated that hDna2 was present in both the nucleus and the mitochondria. Analysis of mitochondrial hDna2 revealed that it colocalized with a subfraction of DNA-containing mitochondrial nucleoids in unperturbed cells. Upon the expression of disease-associated mutant forms of the mitochondrial Twinkle helicase which induce DNA replication pausing/stalling, hDna2 accumulated within nucleoids. RNA interference-mediated depletion of hDna2 led to a modest decrease in mitochondrial DNA replication intermediates and inefficient repair of damaged mitochondrial DNA. Importantly, hDna2 depletion also resulted in the appearance of aneuploid cells and the formation of internuclear chromatin bridges, indicating that nuclear hDna2 plays a role in genomic DNA stability. Together, our data indicate that hDna2 is similar to its yeast counterpart and is a new addition to the growing list of proteins that participate in both nuclear and mitochondrial DNA maintenance

Maailman halutuinta maitoa Suomesta : Suomen lypsykarjatalouden tutkimuksen strategia 2018–2025

Suomen maatalouselinkeinon selkeä kilpailuvaltti sekä ruokaturvan ja huoltovarmuuden tae ovat puhdas pohjoinen maaseutu ja sen vastuullinen hyödyntäminen. Elintarviketuotannon toimialoista maitosektori on keskeisin sekä taloudellisesti että työllisyysvaikutuksiltaan. Pysyäkseen kilpailukykyisenä jatkuvasti kovenevassa kansainvälisessä kilpailussa Suomen maitosektori tarvitsee huippuluokan tutkimustietoa sekä uusia innovaatioita ja ratkaisuja toiminnan resurssiviisaaseen kehittämiseen. Maitosektori voi selviytyä maatalouteen kohdistuvista ympäristöpaineista ja rakennemuutoksesta ainoastaan tutkimuksen ja innovaatioiden kautta. Niiden avulla voidaan myös optimoida niukkenevien resurssien käyttöä. Maitosektorin kehittämisessä voidaan onnistua lisäämällä voimakkaasti kansallista yhteistyötä tutkimussektorin ja lypsykarjatalouden sidosryhmien välillä. Entistä vahvemmalla yhteistyöllä suomalaisen lypsykarjatalouden toimijat pysyvät kilpailukykyisinä ja alan tutkimus kiinnostavana kansainvälisessä kilpailussa. Alan tutkimuksen ja sen sidosryhmien yhteistyönä on luotu lähivuosille yhteinen tutkimusstrategia tutkimuksen suuntaamiseksi tavoitteenaan Suomen lypsykarjatalouden kansallisen ja kansainvälisen kilpailukyvyn vahvistaminen. Tämän avulla pyritään parantamaan kotimaisen ruoantuotannon ja maatalouden elinvoimaisuutta, jotka ovat Suomen huoltovarmuuden oleellisia perusedellytyksiä. Strategian pääpaino on lypsykarjatalouden biologisessa tutkimuksessa, mutta sen piiriin kuuluvat myös maitosektorin tuotantoteknologia- talous- ja yhteiskuntatutkimus, maatalouden yritystalouden tutkimus sekä elintarvike- ja kuluttajatutkimus. Strategia on tehty ohjaamaan erityisesti lypsykarjatalouden tutkimusta tekeviä ja rahoittavia tahoja, mutta sen vaikutukset ulottuvat koko maitosektoriin ja yhteiskuntaan paremmin suunnatun ja tehokkaammin toteutetun lypsykarjatalouden tutkimuksen kautta. Lypsykarjatutkimuksen tuloksia voidaan käyttää hyväksi koko nautasektorilla, mikä luo edellytyksiä myös naudanlihantuotannon kehittämiseen. Strategialla on selkeä päämäärä: Maailman halutuinta maitoa Suomesta - huippututkimusta huippuyhteistyöllä. Se voidaan saavuttaa vain varmistamalla riittävä tutkimus-ja kehityspanostus ja rakentamalla aktiivinen yhteistyöverkosto alan toimijoiden kesken, jolloin suomalainen huippuosaaminen sekä korkealaatuiset ja turvalliset elintarvikkeet saavat ansaitsemaansa kansallista ja kansainvälistä näkyvyyttä. Samalla kansallinen huoltovarmuus paranee maaseudun elinvoimaisuuden säilyessä.201

Integrated Approach Reveals Role of Mitochondrial Germ-Line Mutation F18L in Respiratory Chain, Oxidative Alterations, Drug Sensitivity, and Patient Prognosis in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and malignant primary brain tumour in adults, with a dismal prognosis. This is partly due to considerable inter- and intra-tumour heterogeneity. Changes in the cellular energy-producing mitochondrial respiratory chain complex (MRC) activities are a hallmark of glioblastoma relative to the normal brain, and associate with differential survival outcomes. Targeting MRC complexes with drugs can also facilitate anti-glioblastoma activity. Whether mutations in the mitochondrial DNA (mtDNA) that encode several components of the MRC contribute to these phenomena remains underexplored. We identified a germ-line mtDNA mutation (m. 14798T > C), enriched in glioblastoma relative to healthy controls, that causes an amino acid substitution F18L within the core mtDNA-encoded cytochrome b subunit of MRC complex III. F18L is predicted to alter corresponding complex III activity, and sensitivity to complex III-targeting drugs. This could in turn alter reactive oxygen species (ROS) production, cell behaviour and, consequently, patient outcomes. Here we show that, despite a heterogeneous mitochondrial background in adult glioblastoma patient biopsy-derived cell cultures, the F18L substitution associates with alterations in individual MRC complex activities, in particular a 75% increase in MRC complex II_III activity, and a 34% reduction in CoQ10, the natural substrate for MRC complex III, levels. Downstream characterisation of an F18L-carrier revealed an 87% increase in intra-cellular ROS, an altered cellular distribution of mitochondrial-specific ROS, and a 64% increased sensitivity to clomipramine, a repurposed MRC complex III-targeting drug. In patients, F18L-carriers that received the current standard of care treatment had a poorer prognosis than non-carriers (373 days vs. 415 days, respectively). Single germ-line mitochondrial mutations could predispose individuals to differential prognoses, and sensitivity to mitochondrial targeted drugs. Thus, F18L, which is present in blood could serve as a useful non-invasive biomarker for the stratification of patients into prognostically relevant groups, one of which requires a lower dose of clomipramine to achieve clinical effect, thus minimising side-effects

Mitokondrioiden nukleoidien organisoituminen ja rakenne nisäkkäillä

Mitokondrioiden tärkein tehtävä on energian tuottaminen. Mitokondriot ovat solujen hengityskeskuksia, joissa 90 % tarvitsemastamme energiasta tuotetaan oksidatiivisen fosforylaation kautta elektroninsiirtoketjua apuna käyttäen. Kun mitokondriot eivät toimi kunnolla, tuloksena voi olla energiakriisi, erityisesti lihaksissa, aivoissa ja sydämessä. Lisäksi mitokondrioilla on muita tehtäviä solun perustoiminnoissa, kuten ionitasapainon säilyttämisessä, aminohappojen synteesissä ja solun apoptoosissa eli ohjelmoidussa solukuolemassa. Mitokondrioilla on oma DNA (mtDNA), joka koodaa 13:a hengitysketjussa olevaa polypeptidiä. Loput hengitysketjun polypeptideistä koodataan tuman DNA:sta. Lisäksi mtDNA sisältää mitokondrion proteiinisynteesissä tarvittavat siirtäjä- ja ribosomaaliset RNA:t. Tuman DNA:sta koodataan myös kaikki mtDNA:n ylläpidossa tarvittavat proteiinit, jotka tuotetaan sytoplasmassa ja kuljetetaan mitokondrioihin. Mutaatiot mtDNA:n ylläpitoon osallistuvissa proteiineissa voivat vaikuttaa mitokondrion toimivuuteen. Esimerkiksi mitokondrion helikaasiproteiinissa, Twinklessä, esiintyvien mutaatioiden on osoitettu johtavan mtDNA-deleetioihin tai kopioluvun vähenemään, jotka johtavat neuromuskulaarisiin sairauksiin, kuten adPEO (etenevä silmälihas heikkous). Väitöskirjatyössäni olen selvittänyt Twinklen rakennetta. Havaintoni vahvistivat Twinklen esiintyvän heksameerisina ja heptameerisina rakenteina. Twinkle kuuluu SF4 heksameeriseen DnaB helikaasi -perheeseen ja se on lähisukulainen bakteriofagi T7 g4 -helikaasille. T7 gp4 -helikaasin linkkeri–alue osallistuu proteiinin oligomerisaatioon. Tutkimuksessani olen osoittanut, että toisin kuin T7 gp4 proteiinilla, linkkeri-alueen lisäksi Twinklen aminoterminaalinen osa toimii oligomerisaatiossa. Monet Twinklen mutaatiot esiintyvät tässä osassa proteiinia ja tiedot Twinklen rakenteesta auttavat meitä ymmärtämään, miten tietyt mutaatiot johtavat Twinklen toimintahäiriöihin. MtDNA on pakattu nukleoideiksi kutsuttuihin mtDNA-proteiinikomplekseihin, joiden rakentumista ei ole täysin ymmärretty. Vaikka nukleoidien koostumusta ei tunneta hyvin, tiedetään, että mtDNA:n monistamiseen käytetty koneisto on osa nukleoidien rakennetta. Tähän koneistoon kuuluu esimerkiksi Twinkle-helikaasi. Vaikka nukleoidien kiinnittymisestä mitokondrion sisäkalvolle on tiedetty jo 1960-luvulta lähtien, kiinnittymisen mekanismi on ollut epäselvä. Väitöskirjatutkimukseni on osoittanut, että nukleoidit kiinnittyvät mitokondrion sisäkalvolle Twinkle-helikaasin välityksellä. Tämä kiinnittyminen on dynaaminen siten, että vain aktiivisesti replikoituvat nukleoidit kiinnittyvät Twinkle-helikaasiin. Tutkimukseni on myös osoittanut että kaikki nukleoidit eivät ole pysyvästi kiinnittyneet mitokondrion sisäkalvolle, toisin kun on edellisten tutkimusten perusteella ajateltu. Monet tutkijat ovat olleet kiinnostuneita selvittämään nukleoidien koostumusta ja rakennetta, mutta tähänastinen nukleoiditutkimus on keskittynyt suurimmaksi osaksi ei-kvantitatiiviseen tutkimukseen. Olen kehittänyt uudenlaisen nukleoidiproteiinien eristysmenetelmän, jossa käytetään kokonaisia soluja, jolloin mitokondrioiden eristämiseen ei ole tarvetta. Yhdistettynä immunoaffiniteettipurifikaation ja kvantitatiivisen massaspektometrian kanssa (käyttäen label free quantification – tekniikkaa), menetelmä tarjoaa yksinkertaisen ja toistettavan tavan nukleoidiproteiinien tunnistamiseen. Tällä menetelmällä olemme tunnistaneet monia jo tiedettyjä nukleoidiproteiineja, sekä listanneet joukon proteiineja, jotka voivat osoittautua tärkeiksi mtDNA:n ylläpidossa. Väitöskirjatutkimukseni on tuottanut tärkeää tietoa Twinklen rakenteesta ja organisoitumisesta mitokondrion sisäkalvolle. Tutkimukseni auttaa ymmärtämään mtDNA:n ylläpitoa yleisesti ja siten myös paremmin mitokondrion sairauksia. Lisäksi olemme systemaattisesti tutkineet nukleoidien rakennetta massaspektrometrian avulla. Löytämämme proteiinit ovat myös mielenkiintoinen jatkotutkimuskohde ja tärkeä tiedon lähde muille mitokondriotutkijoille.Mitochondria are involved in many cellular functions, which the most important is the supply of energy in form of ATP, which is produced by the oxidative phosphorylation system (OXPHOS). In addition, mitochondria are involved in other important cellular functions including providing cellular constituents, calcium storage and apoptosis. Mitochondria have their own DNA (mtDNA) that codes for parts of the OXPHOS and the rest is coded by the nuclear genome. Among the nuclearly encoded proteins are those involved in mtDNA maintenance, which have during evolution moved to the nucleus. The unique feature of having its own DNA means that both nuclear and mtDNA can affect the mitochondrial functions and mutations in either genome can lead to mitochondrial dysfunction. For example, mutations in mitochondrial helicase Twinkle have been implicated in adPEO (autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia) and shown to cause mtDNA deletions. This in turn results in a loss of OXPHOS genes and leads to decrease in energy production. In vitro studies have shown that depending on the mutation either the helicase activity, ssDNA binding property or oligomerisation of Twinkle can be affected. In addition, the most severe mutant forms of Twinkle can cause replication stalling. In this present study, we have investigated the structure of Twinkle and the results show the existence of Twinkle as hexamers and heptamers. Twinkle is a close relative of bacteriophage T7 gp4 primase/helicase protein and belongs to the SF4 family of hexameric replicative DnaB-like helicases. Oligomeric transitions between hexamers and heptamers have also been shown for T7 gp4 protein. Further, we show that the stabilisation of Twinkle oligomeric structure is dependent on the N-terminal portion of the protein and unlike the T7 gp4 protein, the linker region is not solely responsible for the oligomerisation. The functional importance is corroborated by the existence of several Twinkle disease mutants in this domain. Since the discovery that also mtDNA is found in discrete mtDNA:protein structures referred to as nucleoids, research on determining the composition of nucleoids has caught the interest of mitochondrial researchers. Research this far has used nucleoid complexes isolated from mitochondria and has concentrated mostly on non-quantitative methods and on examination of one protein found in the mass-spectrometry-screen. Here we show that whole cell formaldehyde crosslinking combined with affinity purification and tandem mass-spectrometry provides a simple and reproducible method to identify potential nucleoid associated proteins by mass-spectrometry. We also investigated the composition of Twinkle associated nucleoids in cells lacking mtDNA and were able to identify proteins that are reduced or absent when mtDNA is not present. The fact that nucleoids are membrane bound is a long-standing observation, but the mechanism is still unclear. Here we show that Twinkle is firmly membrane associated even in the absence of mtDNA unlike single-stranded DNA-binding protein (mtSSB) and mitochondrial transcription factor A (TFAM). Further investigation on the association of replication factors with nucleoids show that endogenous Twinkle and mtSSB co-localize only with a subset of nucleoids. Using nucleotide analogs to identify replicating nucleoids we were able to show that nucleoids transiently associate with Twinkle when there is a need for replication while mtSSB is recruited to nucleoids in Twinkle dependent manner. In conclusion, the work here gives important information on the structure of mitochondrial helicase Twinkle, which will help us to understand Twinkle caused mitochondrial disorders. Furthermore, our results show that Twinkle has an important role during mtDNA replication so that Twinkle recruits or is assembled with mtDNA at the inner membrane to form a replication platform and amount to the first clear demonstration that nucleoids are dynamic in both composition and concurrent activity. The nucleoid isolation work here offers a fast and quantitative method for nucleoid associated protein isolation, which can be applied to screen for example, Twinkle mutant expressing cell lines in search for factors important during diseases. Our data provides a very valuable resource for both basic mitochondrial researchers as well as clinical geneticists working to identify novel disease genes on the basis of exome sequence data