Cellulase-lignin interactions in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose

Lignin, a major non-carbohydrate polymer in lignocellulosic plant biomass, restricts the action of hydrolytic enzymes in the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic feedstocks. Non-productive enzyme adsorption onto lignin is a major inhibitory mechanism, which results in decreased hydrolysis rates and yields and difficulties in enzyme recycling. The mechanisms of non-productive binding are poorly understood; therefore, in this thesis, enzyme-lignin interactions were studied using isolated lignins from steam pretreated and non-treated spruce and wheat straw as well as monocomponent cellulases with different modular structures and temperature stabilities. The origin of the isolated lignin had an undisputable effect on non-productive binding. Ultrathin lignin films, prepared from steam pretreated and non-treated lignin preparations, were employed in QCM adsorption studies in which Trichoderma reesei Cel7A (TrCel7A) was found to bind more onto lignin isolated from steam pretreated biomass than onto lignin isolated from non-treated lignocellulosic biomass. Botanical differences in lignin chemistry had only a minor effect on nonproductive binding when enzyme binding to non-treated wheat straw and spruce lignin was compared. Increase in temperature was found to increase the inhibitory effect arising from non-productive enzyme binding to lignin. Different enzymes were shown to have a characteristic temperature at which the inhibition emerged. Thermostable enzymes were the most lignin-tolerant at high temperatures, suggesting that in addition to the surface properties of an enzyme, non-productive binding onto lignin may be influenced by stability of the enzyme structure. In addition, for lignin-bound T. reesei cellulases, increase in temperature resulted in loss of catalytic activity and tighter binding, suggesting that at high temperature enzyme binding to lignin was probably coupled to conformational changes in the protein folding. With TrCel7A, carbohydrate-binding module (CBM) was found to increase nonproductive adsorption to lignin. The Talaromyces emersonii Cel7A catalytic module was linked to a CBM from TrCel7A, giving rise to a fusion enzyme TeCel7A-CBM1. Despite a similar CBM, TeCel7A-CBM adsorbed significantly less to lignin than TrCel7A, indicating that the catalytic module (TeCel7A) had a strong contribution to the low binding. Probably, the contribution of CBM or catalytic core module in non-productive binding varies between different enzymes, and the role of the CBM is not always dominant. To date, very little attention has been paid to the role of electrostatic interactions in lignin-binding. In this work, binding of Melanocarpus albomyces Cel45A endoglucanase onto lignin was found to be very dependent on pH, suggesting that electrostatic interactions were involved in the binding. At high pH, significantly less non-productive binding occurred, probably due to increasing electrostatic repulsion between negatively charged enzymes and lignin. Modification of the charged chemical groups in enzymes or lignin may be a viable strategy to reduce nonproductive enzyme binding in the hydrolysis of lignocellulosic substrates.Kasvien lignoselluloosa on vaihtoehtoinen uusiutuva raaka-aine likkennepolttoaineiden sekä erilaisten kemikaalien tuotantoon. Lignoselluloosan biokemiallisella prosessoinnilla pyritään hajottamaan biomassan rakennepolysakkaridit entsymaattisesti liukoisiksi sokereiksi, joista pystytään esimerkiksi mikrobien avulla tuottamaan haluttuja yhdisteitä, kuten liikennepolttoaineeksi soveltuvaa etanolia. Lignoselluloosa koostuu pääosin rakennepolysakkarideista (selluloosa ja hemiselluloosa) sekä ligniinistä, joka on aromaattinen polymeeri. Ligniinin läsnäolo estää rakennepolysakkarideja hajottavien entsyymien toimintaa useilla mekanismeilla, joista entsyymien epäspesifi sitoutuminen ligniinin on eräs tärkeimmistä. Entsyymien sitoutuminen ligniiniin heikentää niiden toimintaa sekä rajoittaa entsyymien kierrätettävyyttä. Molekyylitason mekanismit, jotka mahdollistavat entsyymien sitoutumisen ligniiniin, tunnetaan heikosti. Väitöskirjan tavoitteena oli tutkia entsyymi-ligniini-vuorovaikutuksia käyttäen hyödyksi eristettyjä ligniininäytteitä sekä rakenteeltaan ja lämpöstabiilisuudeltaan erilaisia sellulaasi-entsyymejä. Työssä havaittujen ilmiöiden pohjalta on pystytty esittämään keinoja, joilla haitallisia entsyymi-ligniini-vuorovaikutuksia voidaan välttää prosessissa. Lignoselluloosan biokemiallisen prosessoinnin tehostaminen on edellytys sen maailmanlaajuiselle hyödyntämiselle polttoaine- ja kemikaalituotannossa

Ligniinin eristys höyryräjäytetystä kuusesta, sen karakterisointi ja käyttö sellulaasien adsorptiotutkimuksessa

Environmental concerns and limited availability of fossil hydrocarbons have boosted the research of renewable feedstocks and their processing into fuels and chemicals. Currently, vast majority of transportation fuels and bulk chemicals are refined from crude oil, but renewable lignocellulosic plant biomass has long been recognised as potential feedstock for liquid fuel and chemical production. Several alternative processes exist for biomass refining, lignocellulose-to-ethanol process being among the most studied processes. First, lignocellulose is pretreated in order to deconstruct the recalcitrant structures of plant cell walls and expose cellulosic fibrils. Subsequently, biotechnical process utilises cellulolytic enzymes of fungal origin to depolymerise cellulose down to glucose monomers and oligomers. Monomeric sugars serve as a source for platform chemicals in further conversions. Lignocellulose consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. It is generally accepted that lignin has an inhibitory effect during enzymatic hydrolysis of cellulose and part of this effect is caused by irreversible cellulase adsorption on lignin. Fungal cellulase system consists of several enzyme components that contribute to the effective degradation of insoluble cellulosic substrate. Cellulases are traditionally divided to three groups according to enzymatic activity: exoglucanases, endoglucanases and ?-glucosidases. Different enzyme components are shown to have different affinity to lignin which enables screening or engineering of weak lignin-binding enzymes. However, too little is still known about enzyme-lignin interactions and competitive nature of enzyme binding on lignin. In this study, lignin-rich residues were isolated from steam pretreated spruce (SPS) using three different methods: enzymatic hydrolysis, acid hydrolysis and alkali extraction. Lignin residues were characterized and used in adsorption studies with commercial cellulase preparations from Trichoderma reesei (Celluclast 1.5L) and Aspergillus niger (Novozym 188). Enzyme activity measurements and protein analytics were employed to reveal competitive adsorption of cellulases and catalytic activity of solid-bound enzymes. Results showed that T. reesei enzymes had high affinity on lignocellulosic SPS and all SPS-derived lignins, but enzyme activity measurements revealed considerably divergent competitive adsorption patterns. Among all the isolated lignins, lignin-rich residue obtained by enzymatic hydrolysis of SPS and subsequent protease purification was evaluated as most suited adsorption substrate for further adsorption studies and screening purposes. ?-glucosidases from T. reesei and A. niger were shown to have highly distinctive adsorption behaviour on the lignin-rich substrates: A. niger ?-glucosidase lacked affinity to lignin, whereas T. reesei ?-glucosidase adsorbed to all lignin-rich particles. Lignin-bound Trichoderma reesei endoglucanases and CBH I exoglucanase were shown to retained high activity towards soluble substrates used in activity measurements. On the contrary, same enzymes were unable to processively hydrolyze insoluble crystalline cellulose.Fossiilisten hiilivetyjen käyttö nestemäisten polttoaineiden, kemikaalien ja materiaalien tuotannossa on ympäristön ja materiaalin rajallisen määrän vuoksi kestämätön ratkaisu. Tästä johtuen uusiutuvien luonnonvarojen hyödyntämiseen tähtäävä tutkimus on lisääntynyt merkittävästi viime vuosina. Tällä hetkellä valtaosa liikenteen polttoaineista sekä kemikaaleista tuotetaan raakaöljystä, mutta tulevaisuudessa tuotteita saatetaan jalostaa kasvien tuottamasta lignoselluloosasta. Lignoselluloosan jalostukseen on olemassa useita prosessivaihtoehtoja, joista etanolin tuotanto on yksi tutkituimpia. Prosessissa lignoselluloosan rakenne hajoitetaan esikäsittelyllä, jolloin kasvin soluseinien rakenne aukeaa ja selluloosakuidut työntyvät rakenteesta esille. Bioteknisessä prosessissa selluloosapolymeeri hajotetaan entsymaattisesti sienten selluloosaa hajoittavilla entsyymeillä. Hydrolyysin tuloksena syntyneet glukoosimonomeerit sekä oligomeerit ovat reaktiivisia molekyylejä, jotka voidaan prosessoida esimerkiksi etanoliksi. Lignoselluloosa koostuu pääosin selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä. Ligniinin tiedetään estävän selluloosan entsymaattista hydrolyysiä, minkä on huomattu johtuvan osin sellulaasien tarttumisesta ligniiniin. Kiinteän selluloosan hajoitukseen tarvitaan erityyppisiä sellulaaseja, jotka hajoittavat synergisesti selluloosapolymeeriä. Nämä entsyymit jaotellaan aktiivisuuden perusteella endoglukanaaseihin, eksoglukanaaseihin sekä ?-glukosidaaseihin. Kullakin entsyymillä on yksilöllinen taipumus sitoutua ligniiniin, mikä mahdollistaa ligniiniin heikosti sitoutuvien entsyymien seulonnan tai proteiinimuokkauksen käyttämisen hydrolyysiin soveltuvia entsyymejä kehitettäessä. Ligniini-entsyymi -vuorovaikutuksesta sekä usean sellulaasin kompetitiivisesta adsorptiosta tiedetään kuitenkin melko vähän. Tässä tutkimuksessa höyryräjäytetystä kuusesta eristettiin ligniinipartikkeleja kolmella eri menetelmällä: entsymaattisella hydrolyysillä, happohydrolyysillä sekä emäskäsittelyllä. Partikkelien ominaisuuksia tutkittiin ja niitä käytettiin substraatteina adsorptiokokeissa. Trichoderma reesei (Celluclast 1.5L) sellulaasivalmistetta sekä Aspergillus niger (Novozym 188) ?-glukosidaasivalmistetta käytettiin sellulaasien sitoutumisominaisuuksien vertailuun. Entsyymiaktiivisuusmäärityksiä sekä proteiinianalytiikkaa käytettiin eri entsyymiryhmien adsorption vertailuun sekä ligniinissä kiinni olevien entsyymien katalyyttisen aktiivisuuden tutkimiseen. Tulokset osoittivat, että Trichoderma reesein entsyymit sitoutuvat huomattavan paljon höyryräjäytettyyn kuuseen sekä siitä eristettyihin ligniinifraktioihin. Entsyymiaktiivisuusmittaukset kuitenkin osoittivat eri aktiivisuuksien sitoutuvan ligniini- ja selluloosapartikkelihin eri määriä. Eri tavoin eristettyjen ligniininäytteiden välillä ei pystytty havaitsemaan merkittäviä eroja entsyymien kiinnittymisessä. Merkittävä ero havaittiin kuitenkin kahden eri alkuperää olevan entsyymivalmisteen välillä: T. reesei ?-glukosidaasi kiinnittyi ligniinipartikkeleihin huomattavasti enemmän kuin A. niger ?-glukosidaasi, joka ei adsorboitunut testatuille partikkeleille. Ligniiniin sitoutuneiden T. reesein endoglukanaasien ja eksoglukanaasien aktiivisuus osoittautui säilyvän hyvin immobilisoinnista huolimatta, mutta kiinteän selluloosasubstraatin hydrolyysi oli vaatimatonta ligniiniin sitoutuneilla entsyymeillä. Höyryräjäytetystä kuusesta eristettyjen ligniinipartikkelien hyödyntämistä arvioitiin myös tulevien adsorptiokokeiden kannalta. Entsymaattisella hydrolyysillä eristetyn ja proteaasilla puhdistetun näytteen arvioitiin soveltuvan parhaiten jatkotutkimuksiin

High consistency enzymatic pretreatment of eucalyptus and softwood kraft fibres for regenerated fibre products

Sustainability of regenerated cellulosic fibres could be improved by using paper grade pulp instead of dissolving pulp as a raw material in the fibre spinning process. However, the use of paper grade pulp calls for adjustment of the molar mass distribution (MMD) prior to dissolution to obtain good solubility and spinnability. The objective of this work was to adjust MMD of softwood and eucalyptus kraft pulps by enzymatic treatments at high pulp consistency. The reduction of the MMD of eucalyptus kraft pulp was found to require a nearly 30-fold higher dose of endoglucanase compared to the treatment of softwood pulp. Interestingly, when xylanase was used in combination with endoglucanase to treat eucalyptus kraft pulp, 27% of the xylan was dissolved and the required endoglucanase dose could be decreased from 0.57 to 0.06 mg/g. The endoglucanase dose could be further decreased to 0.028 mg/g when 67% of xylan was removed chemically before the enzymatic treatment. This suggests that xylan hinders endoglucanase action on eucalyptus kraft pulp. For softwood pulp, the addition of xylanase and mannanase had only a minor impact on the treatment efficiency. The different processabilities of softwood and eucalyptus kraft pulps are suggested to originate from the deviating cellulose accessibility which is affected by the fibre structures as well as their hemicellulose composition and localisation. The effect of the treatment consistency was further studied with softwood kraft pulp. Treatment at high consistency clearly enhanced the endoglucanase action whereas the effect of solid content on the hemicellulase action was modest.</p

Inhibitory effect of lignin on the hydrolysis of xylan by thermophilic and thermolabile GH11 xylanases

BACKGROUND: Enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass into platform sugars can be enhanced by the addition of accessory enzymes, such as xylanases. Lignin from steam pretreated biomasses is known to inhibit enzymes by non-productively binding enzymes and limiting access to cellulose. The effect of enzymatically isolated lignin on the hydrolysis of xylan by four glycoside hydrolase (GH) family 11 xylanases was studied. Two xylanases from the mesophilic Trichoderma reesei, TrXyn1, TrXyn2, and two forms of a thermostable metagenomic xylanase Xyl40 were compared. RESULTS: Lignin isolated from steam pretreated spruce decreased the hydrolysis yields of xylan for all the xylanases at 40 and 50 °C. At elevated hydrolysis temperature of 50 °C, the least thermostable xylanase TrXyn1 was most inhibited by lignin and the most thermostable xylanase, the catalytic domain (CD) of Xyl40, was least inhibited by lignin. Enzyme activity and binding to lignin were studied after incubation of the xylanases with lignin for up to 24 h at 40 °C. All the studied xylanases bound to lignin, but the thermostable xylanases retained 22–39% of activity on the lignin surface for 24 h, whereas the mesophilic T. reesei xylanases become inactive. Removing of N-glycans from the catalytic domain of Xyl40 increased lignin inhibition in hydrolysis of xylan when compared to the glycosylated form. By comparing the 3D structures of these xylanases, features contributing to the increased thermal stability of Xyl40 were identified. CONCLUSIONS: High thermal stability of xylanases Xyl40 and Xyl40-CD enabled the enzymes to remain partially active on the lignin surface. N-glycosylation of the catalytic domain of Xyl40 increased the lignin tolerance of the enzyme. Thermostability of Xyl40 was most likely contributed by a disulphide bond and salt bridge in the N-terminal and α-helix regions. GRAPHICAL ABSTRACT: [Image: see text] SUPPLEMENTARY INFORMATION: The online version contains supplementary material available at 10.1186/s13068-022-02148-4

Screening of glycoside hydrolases and ionic liquids for fibre modification

BACKGROUNDThis study elaborates the possibility to apply combined ionic liquid (IL) and enzyme treatments for pulp fibre modification. The approach involves swelling of fibre surfaces with IL followed by enzymatic modification of the disrupted fibre surface using carbohydrate active enzymes. RESULTSThe capacity of seven cellulose-dissolving or cellulose-swelling ionic liquids to swell pulp fibres was compared. In addition, thirteen cellulases and five xylanases were screened for their IL tolerance, which determines their applicability in combined or sequential IL-enzyme treatments of fibres. Among the studied ionic liquids, 1-ethyl-3-methylimidazolium dimethylphosphate ([EMIM]DMP) and 1,3-dimethylimidazolium dimethylphosphate ([DMIM]DMP) had the strongest effect on fibre swelling. These solvents were also found to be the least inactivating for the studied enzymes. CONCLUSIONEnzyme compatibility and cellulose-dissolving capability are not two conflicting properties of an ionic liquid. (c) 2017 Society of Chemical IndustryPeer reviewe

Asiakastyytyväisyys psykiatrisessa avohoidossa : Kyselylomakkeen laadinta

Opinnäytetyö on tehty toimeksiantona Etelä-Savon sairaanhoitopiirin psykiatrisen avohoidon psykiatrian, psykogeriatrian ja psykoosipoliklinikoille sekä akuuttityöryhmälle. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa asiakastyytyväisyyttä mittaava strukturoitu kyselylomake, jossa on myös yksi avoin kysymys. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa vain kyselylomake, ei vielä toteuttaa kyselytutkimusta. Kyselylomake jää toimeksiantajalle. Kyselylomake eli mittari muodostui teoreettisen viitekehyksen pohjalta. Kirjallisuuskatsauksesta nousseiden käsiteitten pohjalta muodostimme keskeiset käsitteet. Keskeiset käsitteet operationalisoitiin ja näin muodostuivat väittämät kyselylomakkeeseen. Vastausvaihtoehtoina kyselylomakkeessa toimii 4-portainen Likertin asteikko. Mittarin reliabiliteettiä parannettiin kyselylomakkeen esitestauksella. Kyselylomake esitestattiin kahdeksalla avohoidon poliklinikoiden asiakkaalla. Kyselylomaketta arvioivat myös ohjaava opettaja, opponentit ja poliklinikoiden työntekijät. Heidän kommenttiensa perusteella kyselylomakkeeseen tehtiin tarvittavat muutokset. Kyselyn toteuttamisen jälkeen poliklinikoiden työntekijät saavat tärkeää tietoa asiakkaiden mielipiteistä ja kokemuksista. Tämän tiedon avulla työntekijät voivat kehittää työtään asiakkaiden toiveita vastaaviksi. Mittari on kehitetty käytettäväksi kaikilla toimeksiantajan psykiatrisen avohoidon poliklinikoilla ja poliklinikoiden tarpeiden pohjalta.The bachelor’s thesis has been made as an assignment for the South Savo Hospital District, for the psychiatric, psychogeriatric and psychosis clinics and acute work group. The aim of the bachelor’s thesis was to produce a structured customer satisfaction questionnaire, which has also one open ended question. The purpose of the thesis was only to produce a questionnaire, not yet carry out a survey. The questionnaire will be left for the client. The questionnaire is formed on the basis of a theoretical framework. Key concepts were formed based on the literature view. Key concepts were operationalized and so formed the statements of the questionnaire. The answer options were based on a 4-step Likert scale. The reliability of the questionnaire was improved by pilot testing. The questionnaire was pilot tested with eight outpatients of the clinics. The questionnaire was also assessed by the tutor teacher, opponents and the clinics employees. Necessary changes were made on the basis of their comments. After implementation of the survey, clinics employees receive important information about their customers’ opinions and experiences. This information allows employees to develop their work as equivalent to their customers’ wishes. The meter has been developed for use in all of these out-patient clinics and based on the needs of the clinics

Mikä on PosiVire Oy:n entisten sisäisten asiakkaiden asema nykyisillä työmarkkinoilla?

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää, miten PosiVire Oy:n entiset sisäiset asiakkaat ovat työllistyneet. PosiVire Oy on sosiaalinen yritys, jonka omistaa Helsingin kaupunki, Kiinteistö Oy Kaapelitalo sekä Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiirin kuntayhtymä. PosiVire Oy:n tarkoituksena on työllistää heikossa työllistymisasemassa olevia henkilöitä, kuten maahanmuuttajia, vajaakuntoisia ja pitkäaikaistyöttömiä. Tiedonkeruuvälineenä käytimme kyselylomaketta, jossa oli sekä avoimia että suljettuja kysymyksiä. Testasimme lomakkeen viidellä ihmisellä PosiVire Oy:n toimistolla ja sen jälkeen toteutimme tutkimuksen puhelinhaastattelulla. Käytimme satunnaisotantaa pilotointivaiheessa. Soitimme läpi kaikki PosiVire Oy:n entiset sisäiset asiakkaat, joiden yhteystiedot olivat saatavilla. Syötimme tulokset SPSS-ohjelmaan ja analysoimme ne määrällisen tutkimuksen keinoin. Tutkimuksestamme selvisi, että PosiVire Oy:n entisistä sisäisistä asiakkaista suurin osa oli joko työllistynyt tai päässyt opiskelemaan. Tutkimuksemme perusteella saimme viitteitä siitä, miksi toiset menestyvät PosiVire Oy:n tarjoaman työjakson jälkeen ja toiset eivät. Saamamme tulokset tulevat PosiVire Oy:n käyttöön.What is the position of PosiVireOy’s inner clients in today’s labour market? The purpose of this thesis was to find out how PosiVireOy’s previous inner clients were employed. PosiVireOy is a social enterprise owned by the City of Helsinki, the real estate company Kiinteistö Oy Kaapelitalo and the Hospital District of Helsinki and Uusimaa. The purpose of PosiVireOy is to employ people who are at a disadvantage in the labour market, such as immigrants, people with disabilities and the long-term unemployed. The material was collected information by a questionaire which consisted of open-ended and structured questions. We conducted our survey as a telephone interview and tested the questionnaire with five people in PosiVireOy’s office. We used random sampling in our piloting phase. We called every former inner client whose contact numbers were available. The data was analyzed quantitatively with SPSS. The results showed that the majority of the former inner clients of the firm were either employed or had begun their studies. On the basis of our research we now have a better understanding on why some succeed after PosiVireOy’s placement period whereas the others do not succeed. The results will be used by PosiVire Oy