Ambiente genético del gen blactx-m-12 en aislamientos hospitalarios de klebsiella pneumoniae

The blaCTX-M-12 gene’s genetic environmnt in Klebsiella pneumoniae hospital isolates Resumen: En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen blaCTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen blaCTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen blaCTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen.Palabras clave: resistencia a antibióticos; elementos genéticos móviles; gen blaCTX-M-12; plásmidos conjugativos;  Klebsiella pneumoniae. Abstract: Genes from CTX-M-1 group have been detected with great frequency in Colombia in intrahospital infection-causing Klebsiella pneumoniae isolates. Knowledge regarding the genetic factors favouring such genes’ dissemination amongst bacterial species is an important issue for resistance control blaCTX-M-12 gene-carrying plasmids were identified in this study in 21 clinical K. pneumoniae isolates. Antibiotic resistance transfer was evaluated by mating. Integrons, insertion sequences and other genetic elements were detected by plasmid DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the blaCTX-M-12 gene and other genetic elements was determined by PCR analysis. The blaCTX-M-12 gene was disemifound on 52 to 106 Kpb conjugative plasmids in all isolates. These mobile elements’ transfer by mating may explain their wide dissemination amongst nosocomial infection-causing enterobacteria in hospitals in Bogota, Colombia. The blaCTX-M-12 gene was found downstream from ISEcp1, this being an insertion sequence which has been associated with resistance genetic determinants’ mobilisation. ISEcp1 promoters (detected by sequence analysis) may increase the expression of cefotaximase encoded by this gene.Key words: antibiotic resistance; mobile genetic element; the blaCTX-M-12 gene;  conjugal plasmid; Klebsiella Pneumoniae

Antibióticos: ¿balas mágicas que ya no dan en el blanco?

Lejano parece el día, a inicios del siglo XX, en que Paul Ehrlich propuso el término de "balas mágicas" como compuestos con toxicidad selectiva capaces de actuar contra microorganismos responsables de infecciones, pero no contra las células eucarióticas del hospedero. Sin lugar a dudas, el hallazgo de la penicilina, la bala mágica por excelencia, es un hito que dio un giro en esencia, los microorganismos tienen mecanismos para hacerse "invisibles" a las balas mágicas o a la terapia utilizada para combatir las enfermedades infecciosas. Para muchos era evidente que el fin de las infecciones bacterianas estaba próximo, sin considerar otros elementos que también tienen un papel importante en la evolución y el desarrollo de la resistencia: la plasticidad de los microorganismos causantes de la infección, y la selección de cepas resistentes por el uso irracional de antibióticos

Distribución de genes codificadores de β-lactamasas de espectro extendido en aislamientos de Klebsiella pneumoniae de hospitales de Bogotá, D.C., Colombia

Introduction. Extended spectrum β-lactamases (ESBL) are the most widely distributed enzymes in Enterobacteriaceae of Latin America and are key enzymes in resistance to antibiotics in common use. However, in Colombia, little information is available concerning the identity of genes coding for these enzymes in Klebsiella pneumoniae.Objective. The bla genes were identified in K. pneumoniae isolated from hospitals in Bogotá D.C., Colombia.Materials and methods. One hundred seventy-seven isolates of ESBL producers were collected from 10 hospitals in Bogota between 2003 and 2005. Antibiotic susceptibility was determined by disk diffusion, and the number of β-lactamases in each isolate was assessed by isoelectric focusing. blaCTX-M, blaSHV and blaTEM were identified by PCR and subsequent sequencing.Results. Besides, the resitenance to third generation cephalosporins, 44.7 % and 49.7 % were resistant to amikacyn and thrimetoprim-sulaphametoxazole respectively. Lower resistance rates to other antibiotics were observed as well. An average of three β-lactamases were detected by isoelectric focusing, and the genes blaCTX-M-12 (56.0%) and blaSHV-12 (33.3%) were the most prevalent. blaSHV-5 (11.8%), blaCTX-M-1 (4.0%), blaSHV-27 (2.8%), blaSHV-2 (2.8%), blaCTX-M-2 (1.7%) and blaCTX-M-15 (0.6%) were present in smaller percentages. In addition, three genes were identified that coded for narrow spectrum β-lactamases.Conclusion. Eleven bla genes were identified, eight of which were ESBL-coding. The diversity of the bla genes suggested a continuing exposure of K. pneumoniae to strong antibiotic pressures in Bogota hospitals.Introducción. Las beta-lactamasas de espectro extendido son las enzimas de Enterobacteriaceae de mayor distribución en Latinoamérica. No obstante, en Colombia existe poca información sobre la identidad de los genes codificadores de estas enzimas en Klebsiella pneumoniae.Objetivo. Identificar genes bla presentes en K. pneumoniae procedentes de hospitales de Bogotá, D.C., Colombia.Materiales y métodos. Se recolectaron 177 aislamientos productores de beta-lactamasas de espectro extendido de 10 hospitales de Bogotá, entre 2003 y 2005. Se determinó su sensibilidad antibiótica por difusión en disco y el número de beta-lactamasas presentes por isoelectroenfoque. Se identificaron los genes blaCTX-M, blaSHV y blaTEM, mediante PCR y posterior secuenciación.Resultados. Además de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generación, el 44,7 % y el 49,7 % fueron resistentes a la gentamicina y al trimetoprim-sulfametoxazol, respectivamente. Se observaron porcentaje de resistencia más bajos con otros antibióticos. En promedio, se detectaron por aislamiento tres beta-lactamasas, y los genes blaCTX-M-12 (56%) y blaSHV-12 (33,3%) fueron los más prevalentes. Además, se identificaron blaSHV-5 (11,8%), blaCTX-M-1 (4%), blaSHV-27 (2,8%), blaSHV-2 (2,8%), blaCTX-M-2 (1,7%) y blaCTX-M-15 (0,6%). Además, en nuestros aislamientos se identificaron tres genes codificadores de beta-lactamasas de espectro ampliado.Conclusión. Se identificaron once genes bla, de los cuales, ocho eran codificadores de beta-lactamasas de espectro extendido. La diversidad encontrada de los genes bla sugiere la continua exposición de K. pneumoniae a fuertes presiones antibióticas, como las observadas en nuestros hospitales

Identificación genómica de aislamientos colombianos de Acinetobacter baumannii mediante RFLP-PCR de la región intergénica espaciadora de los genes 16S y 23S rRNA

Con el objeto de identificar la genomoespecie Acinetobacter baumannii, se estudiaron 189 aislamientos pertenecientes al Complejo Acinetobacter baumannii-Acinetobacter calcoaceticus provenientes de cuatro hospitales colombianos (denominados A,B,C,D) mediante el análisis por RFLP-PCR de la región intergénica espaciador (ITS) de los genes 16S y 23S rRNA. Se encontraron 120 aislamientos (86.3%) pertenecientes a la especie A. baumannii. La estructura de la población fue policlonal, con 19 grupos clonales, 16 de los cuales se hallaron en el hospital C. En los hospitales A,B y D se encontraron 2 grupos clonales aislados durante diferentes años. En este estudio se propone un método rápido y fácil para la identificación de Acinetobacter baumannii110-114The 16S-23S rRNA gene intergenic spacer (ITS) was analysed by RFLP in this study to identify A. baumannii from 139 isolates from four hospitals (identified as A, B, C and D). One hundred and twenty of these isolates (86.3%) belonged to the A. baumannii species; those identified as being A. baumannii were found to be polyclonal (19 clone groups) when determining the genetic relationships, 16 of them being found in hospital C. Hospitals A, B and D shared two clone groups isolated during different years. This study describes a rapid and easy method for genospecies identification of Acinetobacter baumannii

Functional Heterologous Expression of Mature Lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa PSA01 in Escherichia coli SHuffle and BL21 (DE3): Effect of the Expression Host on Thermal Stability and Solvent Tolerance of the Enzyme Produced

This study aimed to express heterologously the lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa PSA01 obtained from palm fruit residues. In previous approaches, LipA was expressed in Escherichia coli fused with its signal peptide and without its disulfide bond, displaying low activity. We cloned the mature LipA with its truncated chaperone Lif in a dual plasmid and overexpressed the enzyme in two E. coli strains: the traditional BL21 (DE3) and the SHuffle® strain, engineered to produce stable cytoplasmic disulfide bonds. We evaluated the effect of the disulfide bond on LipA stability using molecular dynamics. We expressed LipA successfully under isopropyl β-d-1-thio-galactopyranoside (IPTG) and slow autoinducing conditions. The SHuffle LipA showed higher residual activity at 45 °C and a greater hyperactivation after incubation with ethanol than the enzyme produced by E. coli BL21 (DE3). Conversely, the latter was slightly more stable in methanol 50% and 60% (t½: 49.5 min and 9 min) than the SHuffle LipA (t½: 31.5 min and 7.4 min). The molecular dynamics simulations showed that removing the disulfide bond caused some regions of LipA to become less flexible and some others to become more flexible, significantly affecting the closing lid and partially exposing the active site at all times

Modificación del gen lipA codificante de la lipasa de pseudomonas aeruginosa PSA01 dirigida a la alteración de su selectividad hacia ácidos grasos de diferente longitud de cadena

240 páginasLa lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa se caracteriza por hidrolizar un amplio rango de ácidos grasos esterificados en los triacilgliceroles, desde los de 4 carbonos, hasta aquellos con 20 carbonos. En esta investigación se buscó reducir el rango de sustratos de la enzima hacia la hidrólisis de ácidos grasos de longitud de cadena determinados. Las lipasas quimio selectivas son industrialmente interesantes pues favorecen la catálisis de ácidos grasos de longitudes de cadena específicos, en presencia de otros similares en la molécula, promoviendo su enriquecimiento o selección y disminuyendo pasos adicionales de purificación. En LipA se desconoce las estructuras del sitio activo relacionadas con su baja quimio preferencia, siendo necesario su identificación. Se utilizó así la técnica de epPCR para obtener mutantes con selectividad diferencial sobre ácidos grasos. Se establecieron las condiciones de cultivo para la expresión citoplasmática controlada y segura de lipA junto al gen lif codificante de su foldasa, en un constructo no evaluado y en E. coli BL21(DE3) y E. coli SHuffle, en los que la lipasa tiende a precipitarse. Diferencias fueron observadas en la actividad y estabilidad de las enzimas producidas por cada cepa, atribuibles probablemente a la formación del puente disulfuro en SHuffle. Con dinámica molecular se estableció que la ausencia de este enlace altera la estructura y flexibilidad de LipA, explicando dichas diferencias. Para la construcción de las librerías, pelB se fusionó a LipA direccionando su salida al sobrenadante en E. coli Rosetta (DE3) pLysS. Se identificaron 3 variantes en las librerías, una de las cuales, la G10, presentó mayor actividad hacia p-nitrofenil miristato que hacia p-nitrofenil palmitato y mayor hidrólisis hacia los ácidos grasos presentes en el aceite de coco, que los del aceite de oliva.Doctorado en BiocienciasDoctor en Biociencia

Expresión heteróloga funcional de lipasa LipA madura de Pseudomonas aeruginosa PSA01 en Escherichia coli SHuffle y BL21 (DE3): efecto del huésped de expresión sobre la estabilidad térmica y la tolerancia a disolventes del producto enzimático

19 páginasThis study aimed to express heterologously the lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa PSA01 obtained from palm fruit residues. In previous approaches, LipA was expressed in Escherichia coli fused with its signal peptide and without its disulfide bond, displaying low activity. We cloned the mature LipA with its truncated chaperone Lif in a dual plasmid and overexpressed the enzyme in two E. coli strains: the traditional BL21 (DE3) and the SHuffle® strain, engineered to produce stable cytoplasmic disulfide bonds. We evaluated the effect of the disulfide bond on LipA stability using molecular dynamics. We expressed LipA successfully under isopropyl β-d-1-thio-galactopyranoside (IPTG) and slow autoinducing conditions. The SHuffle LipA showed higher residual activity at 45 °C and a greater hyperactivation after incubation with ethanol than the enzyme produced by E. coli BL21 (DE3). Conversely, the latter was slightly more stable in methanol 50% and 60% (t½: 49.5 min and 9 min) than the SHuffle LipA (t½: 31.5 min and 7.4 min). The molecular dynamics simulations showed that removing the disulfide bond caused some regions of LipA to become less flexible and some others to become more flexible, significantly affecting the closing lid and partially exposing the active site at all times.Este estudio tuvo como objetivo expresar heterólogamente la lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa PSA01 obtenida de residuos de frutos de palma. En enfoques anteriores, LipA se expresó en Escherichia coli fusionado con su péptido señal y sin su enlace disulfuro, mostrando una baja actividad. Clonamos el LipA maduro con su chaperona Lif truncada en un plásmido dual y sobreexpresamos la enzima en dos cepas de E. coli: la tradicional BL21 (DE3) y la cepa SHuffle®, diseñadas para producir enlaces disulfuro citoplasmáticos estables. Evaluamos el efecto del enlace disulfuro en la estabilidad de LipA usando dinámica molecular. Expresamos LipA con éxito en isopropil β-d-1-tio-galactopiranósido (IPTG) y en condiciones de autoinducción lenta. SHuffle LipA mostró una mayor actividad residual a 45 °C y una mayor hiperactivación después de la incubación con etanol que la enzima producida por E. coli BL21 (DE3). Por el contrario, este último fue ligeramente más estable en metanol al 50 % y al 60 % (t½: 49,5 min y 9 min) que el SHuffle LipA (t½: 31,5 min y 7,4 min). Las simulaciones de dinámica molecular mostraron que la eliminación del enlace disulfuro provocó que algunas regiones de LipA se volvieran menos flexibles y otras más flexibles, lo que afectó significativamente el cierre del párpado y expuso parcialmente el sitio activo en todo momento

Antibióticos: ¿Balas mágicas que ya no dan en el blanco?

Lejano parece el día, a inicios del siglo XX, en que Paul Ehrlich propuso el término de "balas mágicas" como compuestos con toxicidad selectiva capaces de actuar contra microorganismos responsables de infecciones, pero no contra las células eucarióticas del hospedero. Sin lugar a dudas, el hallazgo de la penicilina, la bala mágica por excelencia, es un hito que dio un giro en esencia, los microorganismos tienen mecanismos para hacerse "invisibles" a las balas mágicas o a la terapia utilizada para combatir las enfermedades infecciosas. Para muchos era evidente que el fin de las infecciones bacterianas estaba próximo, sin considerar otros elementos que también tienen un papel importante en la evolución y el desarrollo de la resistencia: la plasticidad de los microorganismos causantes de la infección, y la selección de cepas resistentes por el uso irracional de antibióticos

Ambiente genético del Gen blaCTX-M-12 en aislamientos hospitalarios de Klebsiella pneumoniae

The blaCTX-M-12 gene’s genetic environmnt in Klebsiella pneumoniae hospital isolates   Resumen: En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen blaCTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen blaCTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen blaCTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen. Palabras clave: resistencia a antibióticos; elementos genéticos móviles; gen blaCTX-M-12; plásmidos conjugativos;  Klebsiella pneumoniae.   Abstract: Genes from CTX-M-1 group have been detected with great frequency in Colombia in intrahospital infection-causing Klebsiella pneumoniae isolates. Knowledge regarding the genetic factors favouring such genes’ dissemination amongst bacterial species is an important issue for resistance control blaCTX-M-12 gene-carrying plasmids were identified in this study in 21 clinical K. pneumoniae isolates. Antibiotic resistance transfer was evaluated by mating. Integrons, insertion sequences and other genetic elements were detected by plasmid DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the blaCTX-M-12 gene and other genetic elements was determined by PCR analysis. The blaCTX-M-12 gene was disemifound on 52 to 106 Kpb conjugative plasmids in all isolates. These mobile elements’ transfer by mating may explain their wide dissemination amongst nosocomial infection-causing enterobacteria in hospitals in Bogota, Colombia. The blaCTX-M-12 gene was found downstream from ISEcp1, this being an insertion sequence which has been associated with resistance genetic determinants’ mobilisation. ISEcp1 promoters (detected by sequence analysis) may increase the expression of cefotaximase encoded by this gene. Key words: antibiotic resistance; mobile genetic element; the blaCTX-M-12 gene;  conjugal plasmid; Klebsiella Pneumoniae